專利名稱：電致化學發光分析的制作方法
技術領域：
本發明的目的是提供一類用于測定電致化學發光現象的方法、利用所說方法來測定分析對象的方法、適用于該方法中的試劑溶液以及適用于實施該方法的專用裝置。
若干年前已經公知一些用于測定電致化學發光現象的方法。這類方法是通過氧化作用使某些特定的金屬配合物達到一種激發態，然后使其從激發態回復到基態，同時放出電磁輻射。這類方法和適用的金屬配合物例如在WO86/02734中有報導。
這種技術已不斷地獲得改進。在WO90/05296中，將一種胺，優選為三丙胺(它在被氧化時是一種強還原劑)，加入測試組合物中。在一種電解液中產生電化學反應，在該電解液中，電致化學發光(ECL)部分(即金屬配合物)能夠發射電磁輻射，同時胺被氧化。該說明書描述了一種pH6～9，優選pH7～7.5的磷酸鹽緩沖劑，它是一種適用于水溶液的電解質。
為了提高電磁輻射，WO90/05302提出了將一種洗滌劑Triton X-100或Triton N-401加入所說的測試組合物中。WO90/05411描述了一種用于測定ECL的改進儀器。
另外，已經可以應用這樣一種用于測定分析對象的技術，這種技術是將一類電致化學發光的標記物偶合到分析對象、分析對象類似物或分析對象-特異物中。該電致化學發光技術可用來定量地測定所存在的分析對象。該說明書詳細地描述了一種免疫分析法，該方法是用一種電致化學發光標記物來代替常規使用的標記物。
這種技術的另一些改進和應用描述在WO87/06706、WO89/04392、WO89/10552、WO89/10551、WO90/05301和WO90/11511中。這些出版物的公開內容都被假定為是已知的。
因此，本發明的一個目的是改進所說的已知方法，特別是要結合電致化學發光分析方法來提高檢測分析對象時的靈敏度。
本發明的第二個目的是提供一種用于測定在溶液中或在與該溶液接觸的固相中的電化學現象的測定方法，所說的溶液是選自脂肪醇乙氧基化物、Plantaren和辛基葡糖苷或其混合物中的一種洗滌劑。
本發明的第三個目的是一種使用所說方法來測定分析對象的方法以及適用于實施該方法的試劑。
本發明的第四個目的是在上述先有技術的基礎上提出一種指導。在這些先有技術文件中較詳細地描述了一些主要的電致化學發光方法。用于測定電致化學發光現象的設備包含一個測量單元，該測量單元包括用于裝盛試劑溶液的容器、至少兩個電極(一個工作電極和一個反電極)，這兩個電極在測量時與試劑溶液接觸，以及一個用于測定在電致化學發光過程中發出的光的檢測器。通常，首先將初始電壓(預極化)施加于該溶液中。然后通過在該溶液中含有的一種物質(例如胺)的氧化還原電位來提高該電壓。所說被氧化的物質激發了例如某些釕配合物等物質，這些釕配合物能夠產生化學發光現象，從而發出光。在一個給定的時間間隔內被檢測器接受的光量是對電致化學發光物質存在數量的一種量度。只要將電致化學發光物質作為分析對象、分析對象的類似物或分析對象-特異物(例如在免疫分析中)的一種標記物，那么被接受的光就是分析對象存在量的一種量度。
實驗表明，通常與洗滌劑Tween20結合使用的洗滌劑TritonX-100(由WO90/05302已知)不能產生最佳效果。一方面，Triton X-100難以降解，因此對環境不利。另一方面，實驗還出乎意料地表明，與Triton X-100相比，某些其他洗滌劑能改善ECL方法。這些特種洗滌劑可用來提高信號輸出，提高信號/噪聲比例，從而使檢測達到更高的靈敏度以及降低檢測的低限檢測閾值并最后達到更好的精密度。
適用的洗滌劑是一些選自脂肪醇乙氧基化物的洗滌劑，其中包括，例如已經在實際中應用的Polidocanol〔十二烷基聚(乙二醇醚)n〕、C14-EO9〔聚(乙二醇醚)n〕、Genapol〔異十三烷基聚(乙二醇醚)n〕、C8-EO9〔辛醇聚(乙二醇醚)n〕；Plantaren(烷基聚葡糖苷)和辛基葡糖苷(辛基-β-D-吡喃葡糖苷)或其混合物。這些洗滌劑的使用濃度范圍在0.001～1.0％之間。對于每一種洗滌劑都能容易地定出其最佳濃度。最適合的濃度范圍在0.1～0.5％之間。
在這種檢測組合物中通常使用濃度為5～10mM的疊氮化鈉作為防腐劑。實驗表明，這種對環境有害的試劑可以用bioban或oxaban來代替，它們對于環境要比疊氮化物有利得多。
出乎意料，這些穩定劑在ECL方法中還具有另一種有利效果，也就是增強了測量信號。Oxaban和bioban的使用濃度為0.01～1％，優選0.1～0.5％。
本發明用于測定在溶液中或在與溶液接觸的固相中的電化學現象的方法可以在高于該溶液的凝固點，但低于40℃的溫度下進行。
通過在測量裝置上使用方波電壓還可以進一步提高靈敏度。這是指將初始電壓直接增加(至多0.4秒的時間內)到最終電壓值。在激發時，該電壓實際上保持恒定。在激發時間之后，該電壓直接降低到低于該體系的氧化還原電位的數值。而且，該測定方法還擴大了動力學測量范圍，即在免疫分析測定的分析對象的濃度范圍也可以測定。如果使用較低的溫度，則在測定時最好加入鹽。
已經證明，最好是將施加于工作電極(相對于Ag/AgCl)的方波終點電壓的最大值限定于被氧化物質的氧化還原電位與2.2V之間。較優選的電壓范圍在1.2與2.2V之間。最優選的是1.4V。如果所用的電極由鉑或金制成，則可應用這些數值。
如果通常使用斜坡電壓，例如使用三角接線電壓，則終點電壓(相對于Ag/AgCl)的最大值應限定為3.0V。
出乎意料，在產生電致化學發光現象之前，向工作電極施加一個在+400與-400mV(相對于Ag/AgCl電極)之間的初始電壓也可以增強信號。一個特別優選的電壓范圍在0mV與+200mV之間。另外，如果所用的電極由鉑或金制成，則可應用這些數值。對于電極材料的電位可以很容易地計算出。
另外，將pH值調節到6.5至9.0之間，優選6.5至7.5之間，更優選是調節到pH6.8，也可以使信號增強。最好是使用適合于該范圍的pH緩沖劑來達到該pH范圍。另外，該溶液也可以含有一種或多種其濃度在0.05mmol/l至0.5mol/l之間的堿金屬或堿土金屬的鹵化物。其中優選氯化鈉。
上述那些測定方法本身已明顯地改進了已知的分析方法。而且，將這些測定方法結合還可以更明顯地提高用于檢測分析對象的分析方法的靈敏度和/或動力學測定范圍。
當分析對象，例如免疫分析的對象，根據夾層原理(sandwich principle)或競爭性方法可以使其檢出靈敏度提高時，則所用的方法或儀器可以進一步簡化。例如，可以用一個光電二極管作為檢測元件，以簡化系統的校準，以便提高單位時間內的測定次數，因為測定時間隨信號的增強而減少，或者可以減少樣品的體積。
本發明的另一個目的是一種用于測定電化學現象，特別是用于檢測分析對象的試劑溶液，該試劑溶液含有一種電化學上可氧化的胺或者一種在被氧化時是強還原劑的胺。該溶液含有選自脂肪醇乙氧基化物、Plantaren和辛基葡糖苷或其混合物中的一種洗滌劑。另外，該溶液可以含有一種濃度在0.1mmol/l至0.5mol/l之間和/或pH值在6.8至8.0之間的堿金屬氯化物。而且，該溶液還可以含有常規使用的添加劑，例如緩沖劑、穩定劑和防腐劑。
該試劑溶液最好用bioban或oxaban來穩定。
一種借助電致化學發光來進行檢測的儀器例如在WO90/05302中有很詳細的描述。另外，這種儀器可以含有用于冷卻測量單元的裝置和/或一種溫度在0至25℃之間的液體容器，如果該分析方法必須在這樣低溫度下進行的話。該測量單元可以理解為一個用于在其中測量電致化學發光的小室。液體容器可以是一個貯液器，但也可以是一個進料裝置，例如一根用于供入試劑溶液的管子，在測定時該液體容器就安放在測量單元中。
本發明還有一個目的是一種利用電致化學發光標記來檢測分析對象的方法，其中應用上述用于測定電致化學發光現象所列方法中的一種方法。
下面的實施例用于進一步解釋本發明。實施例1進行了一系列試驗來測定本發明所用洗滌劑的效果。為了測定洗滌劑對獨立于單個試驗參數的信號的產生的影響，即對預測定的被分析物的影響使用涂敷有抗生蛋白鏈菌素的磁性顆粒(HSAP“熱的抗生蛋白鏈菌素顆粒”)作為測定的分析對象，將一種生物素化(biotinylated)的或釕化(ruthenylated)的抗體與其連接。
將一種在WO90/05302的實施例1中描述的儀器用于測量，該儀器在其測量室(Origen 1.0，由IGEN，Rockville，USA或Magnalyser出品)中還含有一塊永久磁鐵。該儀器還含有一個光電倍增管、一個恒電位器、一個電化學流通室、液體轉移工具以及一個50號管式樣品攪拌器。
將下列物質一起置于一個試管中以進行分析HSAP〔將凍干的HSAP溶解于Tris/polydocanal緩沖液(100mM；0.1％)pH9.0中，以獲得一種濃度為600μg/ml的工作溶液〕 50μlPBS緩沖液(50mM KH2PO4；100mM NaCl；0.1％BSA；pH7.0) 200μl試劑溶液(對每個測定的試劑200mM KH2PO4緩沖劑；100mM TPA；pH7.5)將該混合液滴入一個測量管中，然后將其轉移入測量室。用緩沖液(AB)沖洗HSAP，然后測量在該緩沖液中產生的信號。
所用的抗體以生物素-DDS(生物素基-氨基-3，6-二氧雜辛酰基-氨基羰基-庚酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯)進行生物素化。利用DSS(二琥珀酰辛二酸酯)將(Tris)(2，2′-聯吡啶基)氯化釕六水合物結合到抗體上。
涂敷抗生蛋白鏈菌素的磁性顆粒從Deutshe Dynal GmbH，德國(Dynabeads M-280 Streptavidin)購得。
用于測量的緩沖液(AB)的組成如下KH2PO4·2H2O 0.2MKOH 0.076MNaCl 0.05mMTPA(三丙胺) 0.1M洗滌劑濃度如表中所述Oxaban/bioban 0.1/0.3％pH7.5所用的對比物為公知的洗滌劑Tween20和Triton X-100，其濃度皆為0.05％。為了進行對比，把在表1中給出的用該洗滌劑獲得的信號輸出認定為100％。為了獲得另一個測量數據，測量在緩沖液(AB)中的非特異性信號輸出，并用其來計算HSAP/AB信號輸出的比例。在使用和不使用HSAP二者所獲得信號輸出之間的比例是對分析靈敏度的一個良好指標。從表1給出的結果可以清楚地看出，本發明的洗滌劑是最適合的洗滌劑。
聚乙二醇單十二醚和C8-EO9在HSAP/AB比例方面顯示出最好的效果。除了Tween/Triton X-100以外，各種洗滌劑都對信號輸出產生負的影響。
表1作為ECL分析的緩沖劑用的洗滌劑電極BPt3PMT 700V
<p>續表1
所用洗滌劑的名稱和縮寫符號C8-EO9辛醇聚(乙二醇醚)nC14-EO9 聚(乙二醇醚)nC16-EO9 鯨蠟基聚(乙二醇醚)nDodecyl maltoside 十二烷基-β-D-吡喃葡糖基(1→4)α-D-吡喃葡糖苷Genapol 異十三烷基聚(乙二醇醚)n辛基葡糖苷辛基-β-D-吡喃葡糖苷Plantaren 烷基聚葡糖苷(C14-C16)Ralufon 3-14 正十四烷基-n，n-二甲基-3-氨基-1-丙烷硫酸酯SDS 月桂基硫酸鈉
Polidocanol 十二烷基聚(乙二醇醚)nTriton X-100辛基苯酚聚(乙二醇醚)nTween 聚(氧化乙烯基)n-脫水山梨醇-單月桂酸酯實施例2使用參數獨立試驗(parameter-independent test)(HSAP)來測定測量室溫度對信號回收的影響，以及如果在測量室溫度為28～35℃的條件下使用斜坡電壓，則另外還測定動力學與NaCl濃度的關系。
進行如實施例1所述的實驗。其中的緩沖液(AB)被具有下列組成的緩沖液BMG2所取代H3PO40.2MPolidocanol0.1％Oxaban 0.1％三丙胺 0.16MKOH0.12MpH 6.8NaCl 濃度如表中所述所獲結果示于表2中。溫度的增高和鹽濃度的增加都會導致ECL信號的增強，該信號可單獨用緩沖液(BMG2)獲得和用該緩沖液與HSAP結合來獲得。HSAP/AB、HSAP/FC和FC/AB比例都幾乎與溫度無關，但與鹽濃度有關。
表2a)溫度/鹽與ECL信號的關系<
<p>
b)基于28℃，NaCl為0％的計算，％
BMG2具有樣品緩沖液BMG2的對照組FC 具有游離軛合物的對照組(生物素化和釕化的抗體)HSAP熱的抗生蛋白鏈菌素顆粒如果溫度降低到20℃以下，則必須加入堿金屬氯化物并將該溶液的pH值調節到7.25至7.75之間的優選范圍。實施例3T3的檢測通過一種用于檢測三碘甲腺原氨酸(T3)的免疫分析來比較本發明BMG1的檢測組合物與先有技術的檢測組合物(BMG0)試劑溶液具有下列成分<
還使用下列添加劑HEPES緩沖液7.0HEPES-Na7.0 0.1M0.06％ANS0.1％牛IgG0.5％Byco50mM NaClPAB-RU 在HEPES緩沖液7.0中通過DDS結合到抗T3的PAB上的(釕化的多克隆體)(Tris)(2，2′-聯吡啶基)氯化釕六水合物100ng/ml
PH-BI在HEPES緩沖液7.0中的(T3-多半抗原生物素化物)PH PABK-IgG(DE)BOC-T3-IBi600ng/ml樣品 標準a-eT3的濃度a0.24ng/mlb0.88ng/mlc1.90ng/mld3.05ng/mle6.65ng/ml3人的血清2人的血清不添加/添加500mg/dl血紅蛋白(Hb)抗生蛋白鏈菌素涂敷的磁性顆粒在HEPES緩沖液7.0中的Dynabeads M-280抗生蛋白鏈菌素(DeutscheDynal GmbH，德國)600μg/ml將下列物質混合以進行檢出反應PAB-Ru50μlDynabeads M-280 50μl樣品 30μlPH-Bi 50μlBMG 0或1 500μl將該混合物在28℃培養16分鐘，然后將其轉移入已保持在28℃溫度下的測量室中。將所說的顆粒根據被測試的混合物用BMG 0或1沖洗，然后進行測量。然后施加三角接線斜面電壓。測得的電壓為0.565V和PMT720mV。
將結果匯總于表3中。可以看出，在BMG 0中觀察到的血紅蛋白的干擾在BMG 1中不再出現。這不影響檢出下限。
表3
LDL(2s)＝檢出下限實施例4HBsAg的檢測在一種夾層免疫分析中，使用本發明的檢測組合物BMG 1來檢測HBsAg。將所獲結果與使用BMG 0獲得的結果進行對比。BMG 0和1的組成已給出在實施例3中。
使用下列試劑HEPES緩沖液pH7.5HEPES-Na 0.05M牛血清白蛋白 1％Genapol X 080 0.1％牛(R)-IgG 0.1％鼠-IgM 10μg/mlCAM(氯乙酰胺) 0.1％
MIT(甲基異噻唑酮)0.01％(methylisothiazolon)AB-Bi(用生物素-DDS進行生物素化的抗體)MAB＜HBs＞M5A10-IgG-Bi(DDS)按1∶7.5在HEPES緩沖液pH7.5中300 ng/mlTAG 利用DDS抗HBsAg〔F(ab′)片段〕結合到單克隆抗體上的(釕化抗體)MAB＜HBs＞M5A1 0-F(ab′)2-BPRU(Tris)(2，2′-聯吡啶基)氯化釕六水合物在HEPES緩沖液pH7.5中 500ng/ml樣品標準a-hHBsAg濃度a0 U/mlb 0.22 U/mlc 0.52 U/mld 1.08 U/mle 2.30 U/mlf 4.50 U/mlg10.30 U/mlh22.20 U/ml涂敷抗生蛋白鏈菌素的顆粒Dynabeads M-280抗生蛋白鏈菌素在HEPES緩沖液pH7.5中 600μg/ml將下列物質混合以進行檢出反應Dynabeads M-280 50μlAB-Bi 50μlTAG 40μl樣品50μlHEPES緩沖液pH 7.5 20μlBMG 0 or 1 150μl
將該混合物在28℃下培養16分鐘，然后將其轉移入已加熱到282的測量室中。用BMG 0或1來沖洗顆粒，然后進行測量。
將結果匯總于表4中。BMG1的使用明顯地改善了檢出下限。與BMG 0相比，其CV也有所降低。對于BMG 1來說，在校準曲線上標準樣品h至a的數值的比例是上升的，這就可以改善校準曲線的偏差。
表4<
>LDL檢出下限CV 偏差系數實施例5TSH的檢測為了與先有技術的檢測組合物BMG 0進行對比，將檢測組合物BMG 1和沒有oxaban的BMG 1用于夾層免疫分析中以檢測TSH(甲狀腺-興奮激素)。BMG 0和BMG 1的組成已給出在實施例3中。
用夾層免疫分析法測定了甲狀腺-興奮激素(THS)。使用實施例1中描述的儀器來進行這次分析。
將下列物質混合以進行檢出反應培養用緩沖液50μl(內含6.06g/l Tris x HCl；
1g/l氯乙酰胺；0.1g/l甲基異噻唑酮，pH8.0；50g/l牛血清白蛋白；10g/l R-IgG)涂敷抗生蛋白鏈菌素的磁性顆粒(Dynal，2.8μm)在培養用緩沖液中 600μg/ml40μl用DSS(二丁二酰辛二酸酯)結合到生物素化的TSH上的單克隆抗體(MAB)，在培養用緩沖液中 3.0μg/ml40μlTAG用DSS結合到TSH之上的MAB上的(Tris)(2，2′-聯吡啶基)氯化釕六水合物，在培養用緩沖液中 1.2μg/ml40μl樣品液體或標準 50μl再懸浮液〔加入試劑溶液(BMG 1)〕100μl將該混合物在室溫(21℃)下培養16分鐘，然后將其轉移入已保持在室溫下的測量室中。用試劑溶液BMG 1沖洗固定化的顆粒，并在BMG 1中測量。
使用的樣品是標準樣品a-e，其中的TSH濃度如下
a0 μU/mlb0.39μU/mlc3.54μU/mld12.4μU/mle44.3μU/ml將所獲結果匯總于表5中。與BMG 0相比，BMG 1顯示出改進的檢出極限。加入防腐劑oxaban后進一步降低檢測下限閾值。在兩種情況下，偏差系數都有明顯的改善(BMG 1±oxaban)。
表5
縮寫符號的定義與實施例4中給出的相同。
權利要求
1.用于測定在溶液中或在與該溶液接觸的固相上產生的電致化學發光現象的方法，其特征在于，該溶液含有選自脂肪醇乙氧基化物、Plantaren和辛基葡糖苷或其混合物中的一種洗滌劑。
2.根據權利要求1的方法，其特征在于，所說的脂肪醇乙氧基化物是聚乙二醇單十二醚、C14-EO9、Genapol或C8-EO9。
3.根據權利要求1或2的方法，其特征在于，所說的溶液含有一種或多種堿金屬或堿土金屬的鹵化物。
4.根據權利要求1至3的方法，其特征在于，所說溶液的pH范圍在6.5至9.0之間。
5.根據權利要求1至4的方法，其特征在于，所說的電致化學發光是通過施加2.2V的最大方波電壓或3.0V的最大斜坡電壓來達到的。
6.用于測定電化學現象的試劑溶液，其中含有一種在被氧化時為強還原劑，可以被電化學氧化的胺，其特征在于，該溶液含有選自脂肪醇乙氧基化物、Plantaren和辛基葡糖苷或其混合物的一種洗滌劑。
7.根據權利要求6的試劑溶液，其特征在于，其中所含的洗滌劑的濃度為0.001～1％。
8.根據權利要求6或7的試劑溶液，其特征在于，其中還含有一種濃度為0.05mmol/l至0.5mol/l的堿金屬氯化物。
9.根據權利要求6至8的試劑溶液，其特征在于，其pH值在6.5至9.0之間。
10.用于通過電化學發光標記檢測分析對象的方法，其特征在于，將權利要求1至5之任一項的方法用于檢測電化學發光。
全文摘要
用于測定電致化學發光現象的方法，該方法使用某些洗滌劑，以及如果需要，還使用堿金屬氯化物和適用于該目的的試劑。
文檔編號G01N33/52GK1125480SQ94192464
公開日1996年6月26日 申請日期1994年4月27日 優先權日1993年5月3日
發明者V·克倫姆, G·米勒, U·努曼, U·吉森, N·霍義爾 申請人:曼海姆泊靈格股份公司