專利名稱：人iii型前膠原放免試劑，其制備方法和其放射免疫測定方法
技術領域：
本發明涉及的是醫藥診斷試劑，特別是一種在放射免疫法測定下的診斷肝纖維化的人Ⅲ型前膠原hPCⅢ診斷試劑，其制備方法和其在放免測定中的使用方法。
據認為肝纖維化是各種慢性活動性肝炎向肝硬化發展的必經階段，在肝硬化進一步造成肝實質細胞嚴重損害后，才能被肝功能試驗確認，但一般常規肝功能試驗無法診斷肝纖維化和早期肝硬化。目前臨床主要依靠肝活檢來判斷，但此為創傷性檢查，且受穿刺部位的局限，并難以進行肝纖維化進展的動態觀察。根據肝硬化乃至肝癌的形成和發展的過程，世界肝病專家認為“阻止或減慢肝纖維化的發生，將會治愈大多數慢性肝病患者”，因此，早期診斷肝纖維化特別是在臨床上建立肝纖維化的可靠標志物對于防止肝硬化的形成和發展具有非常重要的意義。
近年來，國內外許多學者報道，血清Ⅲ型前膠原肽-PⅢP(ProcollagenTypeⅢPeptide)是診斷肝纖維化較好的血清學指標。測定方法多采用放射性免疫測定，所用抗原從動物胎皮中提取，如德國貝林格公司(BehringwerkeCo.)推出的Ⅲ型前膠原肽RIA(RadioImmunoAssay)試劑中的關鍵材料PⅢP從牛胎皮提取，也有羊、鼠等胎皮中提取PⅢP的報道。其作為診斷肝纖維化標志物的依據是經研究表明肝硬化早期以Ⅲ型膠原PCⅢ增多為主，細胞在合成膠原時以前膠原形式分泌出細胞外，而血清PⅢP是Ⅲ型前膠原PCⅢ經氨基端內切肽酸作用脫下來的多肽，所以測定PⅢP含量，可以反映Ⅲ型膠原的代謝。然而動物與人類膠原分子在結構上的一些抗原決定簇存在某些差異，必然對檢驗結果帶來影響。此外，有些學者發現肝細胞炎癥和壞死均可使在肝內存在的Ⅲ型膠原裂解以致血清PⅢP值升高，因而PⅢP值不一定提示膠原形成的增加，亦即是用PⅢP測定肝纖維化會受到其它因素的影響而不準確。此外，目前引進的PⅢP放免試劑的價格非常昂貴，其具體的放免測定操作復雜，而經過復雜計算才可得到病人待測血清中的PⅢP含量。
本發明的目的是1、提供一種包括從人工流產的人胎中提取的人Ⅲ型前膠原(Human Procollagen Type Ⅲ)即hPCⅢ，其抗體anti-hPCⅢ，同位素標記抗原125Ⅰ-hPCⅢ的放免試劑;2、提供所述試劑的制備方法;3、提供所述試劑的放免測定方法。
由于上述目的，本發明存在以下三方面的內容。
一、hPCⅢ放免試劑，它包括人Ⅲ型前膠原hPCⅢ，人Ⅲ前膠原抗體anti-hPCⅢ，標記抗原125Ⅰ-hPCⅢ，分離劑。其中1、hPCⅢ按法馬西(Pharmacia)公司蛋白質檢驗標準達到聚丙烯酰胺凝膠電泳純，用電泳考馬斯亮蘭R250染色呈粉紅色，電泳圖譜觀察為單一區帶，經β巰基乙醇還原后泳圖譜可見兩條區帶分別代表肽鏈Proα1(Ⅲ)和Pα1(Ⅲ)，前者遷移率為0.238，蛋白質分子量為19萬，后者的遷移率為0.310，蛋白分量為17萬;
2、所述anti-hPCⅢ為hPC免疫家兔獲得，其工作濃度用0.1%BSA，2%正兔血清NRS及0.1M，PH7.4的PBS配制;
3、所述125Ⅰ-hPCⅢ用1%BSA，0.1MPH7.4的PBS配制為濃度30000CPm/100ul;
4、所述分離劑為0.1M，PH7.4的PBS配制6%聚乙二醇PEG和以羊抗兔血清為第二抗體獲得。
二、本發明所述試劑的制備方法，(一)所述抗原hPCⅢ的提純，它包括以下幾個步驟1、材料取雷佛諾爾合法引產的4-6個月胎兒的皮膚，刮去胎皮下脂肪，剪切成如1mm2大小的碎片，并用高速分散器制成勻漿;
2、配制緩沖液用20mMEDTA-Na2、20mMC對氯汞苯甲酸、10uM芐基磺酰氟配制成PH7.4，150mM的Tris-Hcl緩沖液;
3、提取皮膚勻漿先用所述緩沖液提取40-50小時之后，以3000轉/分速度離心除雜10分鐘，取上清液加入硫酸銨至20%飽和度后，以14000xg離心25分鐘，再重溶沉淀于配置好的緩沖液中，加Nacl至10%后，使Ⅲ型膠原與前膠原沉淀，以70000xg速度離心20分鐘。
4、取上述提取液沉淀溶于PH7.6Tris-HCL緩沖液中透析除鹽;
5、DEAE-32層析，經230nm比色，留用達到層析洗脫曲線(參見
圖1)第一峰峰值的層析管內的液體，再用PH7.6Tris-HCL緩沖液透析，濃縮后，進行DEAE-52層析，用0-200mM濃度的Nacl梯度洗脫，取達到層析洗脫曲線(參見圖2)第二峰峰值的層析管內的液體，再在0.1%醋酸中透析，濃縮后即得hPCⅢ純品;
上述抗原保存在-20℃以下，以上操作均在4℃中進行。
(二)、所述抗體anti-hPCⅢ的制備取2.5-3公斤的健康雄性家兔，進行免疫。1、基礎免疫將hPCⅢ0.5ml(含200mg)，與等量完全福氏佑劑，乳化后雙足趾分處皮下注射。2、追加免疫，取hPCⅢ100ug與不完全佑劑注入肋窩或腹溝腫大的淋巴結。若淋巴結不大可注入足趾或兩側背部皮下，追加免疫兩次后，從耳靜脈取血測試抗體效價。若效價不夠理想，可繼續追加免疫。待達到符合要求的抗體效價后，從頸動脈放血，分離血清、冷凍保存。
(三)、標記抗原125Ⅰ-hPCⅢ的制備采用氯胺T法，其中以半胱氨酸作還原劑標記hPCⅢ，按以下步驟將50ulPH7.5PBS和50ul含12ug的hPCⅢ混合，再加入0.5-1mCiNaⅠ125混勻后快速注入含15-25ug的氯胺T20ul，旋渦振蕩2分鐘，立即加入20-40ug半胱氨酸還原終止反應，取5ul用三氯醋酸法測定標記率，其余徑SephadexG-25過柱純化，分離游離碘，流速0.3ml/min，用同位素活度計檢測洗脫液，出現分界清楚的兩個峰(參見圖3)，收集前峰進行透析，即得標記抗原純品。
上述方法獲得的試劑的質量鑒定方法及結果如下經PAGE(Coomassie blue染色)鑒定，獲得的hPCⅢ為單一區帶(照片1)，說明純度達到電泳純，區帶為粉紅色，符合膠原蛋白特征;經β巰基乙醇還原后電泳(SDS-PAGE)可見兩條區帶pro α1(Ⅲ)和pα1(Ⅲ)(照片2)，但遷移率較牛Ⅲ型前膠原的遷移率略低。經與進口(Phamacia Co.)高分子量蛋白質標準(HMW)對照測定，獲得的hPCⅢ分子的亞單位的分子量分別為pro α1(Ⅲ)190，000道爾頓(Dolton)和p α1(Ⅲ)170，000 Dolton。而牛Ⅲ型前膠原的pro α1(Ⅲ)170，000道爾頓(Dolton)和p α1(Ⅲ)150，000(照片2。注PCⅢ為牛Ⅲ型前膠原;HPCⅢ即hPCⅢ;hPCⅠ為人Ⅰ型前膠原;cⅢ為牛型膠原)。由照片3(SDS-PAGE)可見到hPCⅢ的純化過程(1-DEAE-32層析前;2-DEAE-52層析前;3，4-Sephadex G100層析前;5-Sephadex G100層析后)，可獲得hPCⅢ純品。
2、anti-hPCⅢ的鑒定將上述制備的抗血清做系列稀釋，按放免法，不加競爭性抗原，繪制抗血清稀釋曲線，測定其效價;免疫組織化學取肝硬化與慢性活動性肝炎各10例病人的肝活檢標本，將上述制備的抗血清稀釋至1∶100。該高價抗血清經免疫組化肝活檢標本，光鏡下可見肝硬化假小葉之間膠原纖維，證實為特異性抗體。
3、將前述125Ⅰ-hPCⅢ用三氯醋酸法測定，放射化學純度達99.6%。
三、本發明所指的試劑的放射免疫測定方法系采用雙抗體PEG法，非平衡法加樣，操作前試劑按以下容量分裝1、hPCⅢ標準7瓶(S0-S6)，1ml/瓶;
每瓶按hPCⅢ含量0、25、50、100、500、1000(ug/e)分裝。
2、PBS1瓶，2ml;
3、anti-hPCⅢ3瓶，共22ml;
4、分離劑3瓶，共22ml;
5、125Ⅰ-hPCⅢ2瓶，共11ml;
6、質控血清1瓶，1ml。
本發明用于放射免疫測定中的測定方法按以下操作步驟100ul標準或待測血清標本→加100ulanti-hPCⅢ血清 (4℃42-48小時)/() 100ul125Ⅰ-hPCⅢ(30000cPm) (4℃6h)/() 200ul分離劑 (室溫30min)/() 離心400rPm，4-10℃30min→棄上清液→測定沉淀的放射性活性計數B。
上述操作步驟的詳細說明參見下表(單位ul)加樣順序 NSB S0S1S2S3S4S5S6待測血清待測血清--------100標準液 100(S0) 100 100 100 100 100 100 100 -PBS200--------hPCIII抗體-2002002002002002002002004℃放置42～48小時。
125I-hPCIII 100 100 100 100 100 100 100 100 1004℃放置6小時。
分離劑注200 200 200 200 200 200 200 200 200室溫放置30分鐘;4～10℃,3500轉/分,離心30分鐘;棄上清,測沉淀計數(B)。
注加前須充分混勻分離劑！測定結果的計算標準曲線繪制以B/B。為縱座標，hPCⅢ標準(5、25、50、100、250、500、1000ug/l)為橫座標，在半對數坐標紙上以Y= (B標－NSB)/(BO-NSB) ×100%，X＝loghPCⅢ，繪制曲線。待測血清標本做雙份平行管測定，查上述標準曲線即可測出結果。
用上述操作步驟獲取的數據繪制的標準曲線的競爭抑制關系良好，落差大，測定范圍較寬，為5-1000ug/l，靈敏度6ng/ml，批內和批間差異系數各為5.2%和6.2%，回收率為97.6-102.3%，與其他型膠原無交叉反應，方法穩定。以上指標已達到RIA法標準質量要求。
上述計算結果與肝活檢纖維化程度的關系(參見圖4)，經37例肝活檢標本經H-E染色，按纖維化分布范圍和成纖維細胞增生程度分輕、中、重三級，無纖維增生者為0級。其血清PCⅢ測定結果0級11例為89.5±18.1;輕級10例為135.5±20.5;中級8例為260.8±39.2;重級8例為369.8±68.0。血清PCⅢ隨著肝纖維化程度加重遞增，兩者呈密切正相關(r＝0.984，P∠0.001)。
照片4-7為其中4例肝活檢標本的病理切片的顯微照片，證明本發明的測定結果與病清相吻合。
本發明的試劑及放免測定方法經在重慶市腫瘤醫院及全國七所大醫院臨床試用，其效果參見下表重慶市腫瘤研究所注1七家醫院結果綜合組別例數均數±標準差例數均數±標準差正常對照10085.0±17.526583.4±17.8急性肝炎22131.1±30.253111.2±30.1慢遷肝1894.9±26.514393.6±26.2慢活肝13188.2±73.9122174.0±42.6代償性肝硬化10277.4±91.013210.3±86.6失代償性肝硬化20228.2±157.1129211.1±67.9肝硬化合并肝癌46288.7±101.462269.7±66.6原發性肝癌(單純型)22168.5±39.3膽石癥1288.0±18.61587.9±16.6其他:肝病788.2±26.02393.4±19.7非肝病1188.6±10.5表中通過上述建立的方法測定100例正常人和181例各種肝病和其他病人血清PCⅢ的結果表明，肝硬化各組和慢活肝組血清PCⅢ升高最顯著，急肝和單純性肝癌略有升高，慢遷肝、膽石癥和其他疾病均無顯著升高，這說明肝細胞炎病壞死可能對PCⅢ影響較小。
小結1、從雷佛諾爾人工流產的胎皮中提取、純化人Ⅲ型前膠原、經聚丙烯酰胺凝膠電泳和還原后亞單位測定等證實hPCⅢ為純品。
2、用hPCⅢ免疫家兔獲得高價抗血清，并經免疫組化證實膠原纖維可著色。
3、用Nal125標記hPCⅢ，放化純度達93-98%。
4、建立的血清PCⅢ放免法-雙抗體PEG法，各項質量指標均符合測定要求。
5、臨床上測定281例血清PCⅢ的結果100例正常對照均值±SD為85.0±17.5ug/l(單位下略)，正常上限為120;肝硬化組上升最高;代償性、失代償性和合并肝癌組分別為227.4±91.0、266.2±157.5和288.7±101.4;慢活肝組有顯著升188.2±73.9;急肝和肝癌(單純型)組略有升高，各為131.1±30.2和168.5±39.3;慢遷肝、膽石癥和其他組均無明顯升高。
6、37例肝活檢按纖維化程度分為0、輕、中和重級，其血清PCⅢ分別為89.5±18.1、135.5±20.5、260.8±39.2和369.8±68.0。兩者呈密切正相關(r＝0.984，P∠0.001)。
本發明的積極效果是1、以hPCⅢ為血清指標建立的放免測定法能客觀地反映肝組織纖維化程度，對診斷肝纖維化及早期肝硬化的治療具有重要的價值。
2、用本發明所述的方法能獲得hPC純品，用氯胺T法標記hPCⅢ時以半胱氨酸作還原劑所得的125Ⅰ-hPCⅢ的穩定性＞1.5月，明顯較偏重亞硫酸鈉的為好，對hPCⅢ分子的損傷很小，且放射化學純度達99.6%。
3、操作簡單，所有成份均配制成應用液體，分別加入即可，不必再作其它附加工作;待測的病人血清不必作任何稀釋即可得到Ⅲ型前膠原含量。測定范圍足夠臨床使用(為25-1000ug/l)，靈敏度達6ug/l;批內及批間變異系數分別僅為5.2%和6.2%，所有指標均達到PIA法質量要求。
權利要求
1.一種用于放射免疫法測定肝纖維化的試劑，其特征在于它包括人Ⅲ型前膠原hPCⅢ，人Ⅲ型前膠原抗體anti-hPCⅢ，標記抗原125I-hPCⅢ及分離劑；其中(1)、hPCⅢ按法馬西(Pharmacia)公可蛋白質檢驗標準達到聚丙烯酰胺凝膠電泳純，用電泳考馬斯亮蘭R250染色呈粉紅色，電泳圖譜觀察為單一區帶，經β巰基乙醇還原后泳圖譜可見兩條區帶分別代表肽鏈Proα1(Ⅲ)和Pα1(Ⅲ)，前者遷移率為0.238，蛋白質分子量為19萬，后者的遷移率為0.310，蛋白分子量為17萬；(2)、anti-hPCⅢ為hPCⅢ免疫家兔獲得，其工作濃度用0.1%BSA，2%正兔血清NRS及0.1M，PH7.4的PBS配制；(3)、125I-hPCⅢ用1%BSA，0.1MPH7.4的PBS配制為濃度30000CPm/100ul；(4)、分離劑為0.1M，PH7.4的PBS配制6%聚乙二醇PEG和以羊抗兔血清為第二抗體獲得。
2.一種用于制備hPCⅢ的方法，其特征在于它按以下步驟進行(1)、取佛諾爾合法引產的4-6個月胎兒的皮膚，刮去胎皮皮下脂肪，剪成碎片，用高速分離器制成勻漿;(2)、用20mMEDTA-Na2，20mM對氯汞苯甲酸，10uM芐基磺酰氟配制成PH7.4，150mM的Tris-HCL緩沖液;(3)、用上述緩沖液提取皮膚勻漿40-50小時后，以3000轉/分離心除雜10分鐘，取上清液加入硫酸銨至20%飽和度后，以14000xg離心25分鐘，再重溶沉淀于配置好的緩沖液中，加Nacl至10%后，以70000×g速度離心20分鐘;(4)、取上述提取液沉淀溶于PH7.6Tris-HCL緩沖液中透析除鹽;(5)、DEAE-32層析，經230nm比色，留用達到層析洗脫曲線第一峰峰值的層析管內的液體，再用PH7.6Tris-HCL緩沖液透析，濃縮后，進行DEAE-52層析，用0-200mM濃度的Nacl梯度洗脫，取達到層析洗脫曲線第二峰峰值的層析管內的液體，再在0.1%醋酸中透析，濃縮后即得hPCⅢ純品;(6)、以上操作均在4℃中進行。
3.一種制備anti-hPCⅢ的方法，其特征在于用hPCⅢ對健康雄性家兔進行免疫，方法包括(1)、基礎免疫將hPCⅢ0.5ml(含200mg)，與等量完全福氏佑劑，乳化后雙足趾分處皮下注射;(2)追加免疫，取hPCⅢ100ug與不完全佑劑注入肋窩或腹溝腫大的淋巴結，或者注入足趾或兩側背部皮下，追加免疫兩次后，從耳靜脈取測試抗體效價，在追加免疫達到符合要求的抗體效值后，從頸動脈放血，分離分清、冷凍保存即可。
4.一種制備125Ⅰ-hPCⅢ的方法，采用的是氯胺T法，其特征在于方法中以半胱氨酸作還原劑標記hPCⅢ，按以下步驟進行將50ulPH7.5PBS和50ul含12ug的hPCⅢ混合，再加入0.5-1mCiNaⅠ125混勻后快速注入含15-25ug的氯胺T20ul，旋渦振蕩2分鐘，立即加入20-40ug半胱氨酸還原終止反應，取5ul用三氯醋酸法測定標記率，其余經SephadexG-25過柱純化，分離游離碘，流速0.3ml/min，用同位素活度計檢測洗脫液，出現分界清楚的兩個峰，收集前峰進行透析，即得125Ⅰ-hPCⅢ純品。
5.一種用放射免疫法測定肝纖維化的方法，其特征在于方法按以下進步驟行100ul標準或待測血清標本→加100ulanti-hPCⅢ血清 (4℃42-48小時)/() 100ul125Ⅰ-hPCⅢ(30000cPm) (4℃6h)/() 200ul分離劑 (室溫，30min)/() 離心4000rPm，4-10℃30min→棄上清液→測定沉淀的放射性活性計數B→以B/B為縱座標，hPCⅢ(5、25、50、100、250、500、1000ug/l)為橫座標，在半對數坐標紙上以Y = (B.-NSB)/(B.-NSB) ×100%,X＝loghPCⅢ繪制標準曲線→待測血清標本做雙份平行管測定，在標準曲線上查出結果。
全文摘要
本發明涉及從人工流產胎皮中提取、純化人III型前膠原，用此抗原制備了高效價抗血清，并以
文檔編號G01N33/53GK1087997SQ93114698
公開日1994年6月15日 申請日期1993年11月18日 優先權日1993年11月18日
發明者李偉道, 劉興明, 林丁 申請人:重慶市腫瘤研究所