專利名稱：用紅外光譜檢測被剝離的細胞中存在異常的方法
技術領域：
本發明涉及用紅外光譜檢測被剝離的細胞中存在異常的一種方法。
眾所周知，檢查一些被剝離的組織或細胞樣品中的表示特征的瘤細胞使得能診斷是否為惡性，這些被剝離的組織或細胞樣品例如可來自各種人體器官或組織的分泌物、滲出物、漏出物、刮下來的東西或刷下來的東西。已發現表皮剝落細胞學在檢測早期子宮和子宮頸癌中很有價值，以至通常將它作為對所有成年婦女的每年度檢查的常規部分來完成，參見“病理檢查”，“表皮剝落細胞學研究”，第24章，362至365頁。
被剝離的組織或細胞樣品可以從下述這些東西得到，例如，氣管、支氣管、胃、直腸和結腸、泌尿道(Urinary tract)、漿膜囊流體(Serous sac fluids)、囊腫流體、滑液流體、腺分泌物及滲出物。獲得、收集、若必要的話以及保存這些樣品的方法，可隨意變化。
將每個收集到的樣品原封不動地勻均散布一層到一干凈的顯微鏡載物片上，并在例如乙醇-乙醚固定液中浸沒約1小時。在固定后，不允許弄干，將上述層涂上甘油，并將該層夾在兩玻璃載物片之間。然后，將這些載物片送到一實驗室染色，并由一些經過訓練的、有經驗的病理學家或細胞學家作顯微診斷。
被剝離的組織或細胞樣品的顯微診斷是有用的，這診斷性的實驗結果分析
ⅰ)由熟練人員完成，ⅱ)不完全可靠，這是由于例如豐富的粘液、毛滴蟲屬感染或萎縮，以及ⅲ)不能精確檢查例如惡化前的或早期惡性階段中組織或細胞中的惡性。
需要一種方法檢測被剝離的細胞中存在異常，其特點是ⅰ)對上述樣品的一種簡單試驗及其實驗結果分析，能由沒有醫學技能的并經過相當短的培訓過程后的人員完成，ⅱ)上述試驗結果的適當小心分析是可靠的，且ⅲ)能在惡化前的或早期惡性階段檢查組織或細胞中的惡性。
在申請人的待決的在加拿大的專利申請(申請號2，008，831-1，申請日1990年1月29日)“用紅外光譜檢測天然的或被培養的形式的生物組織及細胞中存在異常的方法”(P.T.T.Wong及B.Rigas)中，已提出用紅外光譜檢測天然的及被培養的形式的生物組織和細胞(例如，癌組織或細胞)中存在異常。將一束紅外光照射在以天然的或被培養的形式包含待測試細胞的的一種組織或細胞樣品上，并且通過確定紅外吸收中是否變化，在至少一個頻率范圍檢測，這紅外吸收變化是由于上述樣品中所存在的至少一種分子功能團的振動而出現的，所述樣品表征了上述異常。
P.T.T.Wong及B.Rigas所教導的方法被用于活體組織或被培養的細胞的例子中。具體說，在第7頁第20行到第8頁第36行，P.T.T.Wong及Rigas檢查在腸切除后由結腸粘膜立即得到的結腸直腸(colorectal)癌，即在外科手術切除一部分或一段腸后立即由結腸粘液膜得到的結腸直腸癌。
根據本發明，已經發現可以通過對被剝離的細胞的紅外吸收特性的光譜分析，檢測此被剝離的細胞中存在異常。粘蛋白、水、無機鹽、上皮細胞、紅血細胞及液體的白細胞并不產生上述細胞的紅外光譜吸收特性的任何虛假解釋。
本發明提供了一種用紅外光譜檢測被剝離的細胞中存在異常的方法，這方法包括a)將一紅外光束照射被剝離的細胞的一個樣品，而且b)通過該樣品的紅外光譜分析確定此樣品中是否存在異常，這分析是在至少一個頻率范圍，以確定所述紅外光譜吸收特性中是否至少有一種變化已出現，這種變化是由于上述特性異常的樣品中至少一種分子功能團的振動而出現。
所述紅外吸收特性中的至少一種變化可以是在某一特定頻率處的吸收強度變化、某一特定吸收出現時的頻率變化或施加到上述功能團上的不同壓力引起頻率變化，在此頻率出現一特定吸收。
上述分子功能團可以是下述分子中的至少一種碳水化合物、核酸、組織蛋白質或膜酯類。
上述功能團可以是核酸中的磷酸二酯基、組織蛋白質和碳水化合物中的一個C-OH基或酯類中的一個CH2基。
上述功能團可以是下述這組功能團中所選出的至少一種，這組功能團有碳水化合物、核酸中的磷酸二酯基、組織蛋白質或碳水化合物中的COH基以及脂類的CH2基。
上述樣品可以是一Papanicolau涂片。
上述樣品可以是一子宮頸的樣品。
上述樣品可以是一子宮頸內的樣品。
上述樣品可以是一子宮頸外的樣品。
上述樣品可以是一陰道樣品。
上述樣品可以是一子宮樣品。
附圖中將以舉例方式說明本發明的實施例。
圖1是用紅外光譜檢測被剝離的細胞中存在異常的一種儀器的方框圖。
圖2顯示了頻率范圍為950到1350cm-1時的紅外光譜，從正常的健康的被剝離的子宮頸細胞樣品所得到的紅外光譜用---表示，而從用通常的細胞學方法診斷為惡性的被剝離的子宮頸樣品所得到的紅外光譜用-表示。
圖3至圖5分別示出了在健康的被剝離的子宮頸細胞樣品及那些用通常的細胞學方法診斷為惡性的被剝離的子宮頸樣品之間、在紅外波帶為～1082cm-1及～1155cm-1處的頻率位移以及在紅外波帶為～1025cm-1及～1082cm-1之間的強度比變化。
圖6示出了對于～1240cm-1波帶、被放大并被疊加的、圖2所示紅外光譜。
圖7示出了對于1190到1275cm-1頻率區域中的上述波帶，圖2所示紅外光譜的三次冪所派生的譜。
圖8示出了被剝離的子宮頸組織的細胞中核酸的PO2基振動頻率對壓力的依賴性的比較。
圖9是在正常的健康的被剝離的子宮頸細胞樣品與那些用通常的細胞學方法診斷為惡性的被剝離的子宮頸細胞樣品之間、對于1140cm-1到1185cm-1頻率區域中的上述那些紅外波帶的放大。
圖10示出了圖9所示的紅外光譜相應的三次冪所派生的譜。
圖11示出了在正常的健康的被剝離的子宮頸組織樣品與用通常的細胞學方法診斷為惡性的子宮頸組織樣品之間、對于1140cm-1到1190cm-1頻率范圍中C-O延伸模式的各組成波帶的頻率對壓力的依賴性的比較。
圖12示出了在正常的被剝離的子宮頸組織樣品與用通常的細胞學方法診斷為惡性的被剝離的子宮頸組織樣品之間、膜脂類中亞甲基鏈的CH2的彎曲模式對壓力依賴性的比較。
圖13顯示了對用通常的細胞學方法診斷為正常、惡性及發育異常的被剝離的子宮頸樣品、對950cm-1到1350cm-1頻率范圍中的上述紅外光譜的比較。
圖14顯示了由健康的被剝離的陰道細胞樣品與用通常的細胞學方法診斷為惡性的被剝離的陰道細胞樣品所得到的、在950到1，350cm-1頻率范圍中的紅外光譜。
現在參考圖1，圖1顯示了一紅外光源1、一透鏡2、一樣品容器和支架4、一紅外光譜儀6、一計算機8及一讀出裝置10。
操作時，將一被剝離的組織或細胞樣品放入樣品容器和支架4，來自光源1的、已由透鏡2聚焦的一束紅外光，穿過樣品容器和支架4中的上述樣品。該樣品的任何紅外吸收都由紅外光譜儀6檢測，然后順次由計算機計算出該紅外吸收，以在讀出裝置10給出讀數。可以安排計算機讀數直接指示上述樣品是否為一正常健康的樣品或是一包含有異常(即良性、發育異常或惡性)的樣品。
在證實本發明的試驗中，如圖1所說明的那樣，從被剝離的子宮頸細胞樣品得到紅外(IR)光譜，這被剝離的子宮頸細胞樣品是從25個女性身上收集來的，這25個女性在標準的“刮削”或“刷”程序后都經受了監視性的Papanicolaou試驗。這些樣品含有上皮細胞、炎性細胞、紅血細胞及作為正常植物群的組成部分的細菌。這些試驗表明，由兩個獨立的觀察者半定量的、在所有樣品中存在有不同數量的非上皮細胞，在所研究的光譜區域中，對紅外光譜的影響并未達到任何有意義的程度，各對照樣品中所研究的紅細胞的溶血作用，在所研究的光譜區域中，也不顯著改變紅外光譜。
在進一步的試驗中，通過在普通鹽水溶液中輕輕抖動刷子，來獲得用這刷子所得到的被剝離的刮屑物上的細胞。通過離心將這細胞懸浮液的兩半分別作成丸。去除上層清液后，將一個丸凍在液氮中，以備以后按照本發明用光譜學方法作IR吸收研究，而將另一等分試樣丸在顯微鏡載物片上，用Papanicolaou染劑染色并固定，并用通常方法診斷。每個樣品由兩個有經驗的內科醫生評價，而且這些評價完全一致。如前面圖1所說明的那樣得到紅外吸收光譜。將細胞涂抹在上述樣品支架上，在施加樣品后，光譜圖樣穩定許多小時。使一自動比例繪圖裝置自動歸一化峰強度。
將試驗分為兩組，這兩組是ⅰ)大氣壓強試驗，這里發現由1990年12月25日公開的美國專利4，980，551所說明并要求保護樣品支架是有用的，以及ⅱ)高壓試驗，這里發現1990年11月13日公開的美國專利4，970，396所說明并要求保護的樣品支架是有用的。
在通常的細胞學評價的基礎上被評定為正常健康樣品的那些子宮頸樣品基本顯示了相同的IR光譜。用細胞學方法被診斷為惡性的那些樣品的光譜，與正常樣品的光譜是明顯不同的。圖2中，對于正常的健康的子宮頸組織的結果顯示為一一一，而對于惡性子宮頸組織的結果顯示為-，這些是來自正常的健康的及惡性的子宮頸樣品的典型光譜。最突出的差別包括在那些惡性樣品中的下述研究結果a)在～1025cm-1、～1047cm-1(在～1025cm-1波帶上呈現一個肩形凸出部)、～1082cm-1、～1155cm-1、～1244cm-1及～1303cm-1各波帶處的強度劇烈變化，b)～1082cm-1、～1155cm-1及～1244cm-1峰的顯著位移，以及c)在970cm-1處的一個新波帶峰。
在圖3到圖5中，○是對于正常的健康的被剝離的子宮頸組織的結果，而●是對于惡性的被剝離的子宮頸組織細胞的結果。圖3和圖4顯示了在～1082cm-1及～1155cm-1處的兩個峰中的位移各自平均約為4及12個波數，這是對于所有被研究的樣品。圖5顯示了在正常和癌組織樣品之間、在～1025cm-1及～1082cm-1波帶之間的峰強度比。
發現～1025cm-1及～1047cm-1處的波帶是由于碳水化合物產生，并發現糖原對這些波帶的強度作出了壓倒性貢獻。發現～1082cm-1及1244cm-1處的波帶，分別是由于對稱及反對稱磷酸鹽(PO-2)延伸模式產生。發現它們主要起源于細胞核酸的磷酸二酯的振動。發現～1155處的波帶是由于除了其它的東西外還有細胞蛋白質中氨基酸的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的殘基的C-OH基以及碳水化合物的C-OH基的C-O延伸模式產生。在～1303cm-1處的波帶由許多重迭波帶構成，而且業已確定了它的分配。最后，發現在970cm-1處的波帶部分是由于一些雙陰離子磷酸鹽基的振動模式產生，如在典型的磷酸化蛋白質的紅外光譜中先前已觀察到的那樣，而且部分還由于DNA和/或RNA分子。
現在參考圖6，這是一幅圖2的一部分的放大圖，且對應于圖7所示的三次冪所派生的圖，反對稱磷酸鹽伸展波帶的更詳細的研究展示了，在用-顯示的惡性被剝離的子宮頸組織中，它由兩個重迭的波帶構成，其中一個低頻波帶當與正常的健康的被剝離的細胞比較時顯著增加。當PO-2基完全被氫鍵合時，在進行上述試驗時，已知反對稱PO-2伸展波帶的頻率是～1220cm-1，當它未被氫鍵合時，大于～1240cm-1。這一發現表明，與正常的被剝離的子宮頸組織的情況相對照，在子宮頸癌中，許多核酸的PO-2基被氫鍵合。這個結論進一步被這些波帶的頻率對于壓力的依賴性所支持，如圖8所示，這里○表示對于正常的健康的被剝離的子宮頸組織的結果，而●表示對于患癌的被剝離的子宮頸組織的結果。發現低頻波帶的頻率隨壓力增加而減少，而發現癌的高頻波帶的頻率及正常的健康組織的單個PO-2波帶隨壓力增加而增加。已知上述低頻波帶對壓力的這種反應是典型的被氫鍵合的基，因為壓力增強了氫鍵合的強度，因此而減少了上述PO-2延伸的頻率。另一方面，已知對于惡性及正常組織兩者共同的上述壓力對高頻PO-2波帶的影響是非氫鍵合的功能團的特征，而且是來源于壓力增強了分子間的相互作用。
圖9和圖10顯示了在1155cm-1處的C-O延伸波帶的類似分析，這里對于正常的健康的被剝離的子宮頸組織的細胞的結果顯示為---，而對于患癌的被剝離的子宮頸組織的細胞的結果顯示為-，這分析顯示了它由～1153cm-1、～1161cm-1及～1172cm-1三個重迭波帶構成，當與正常的子宮頸組織的相應波帶比較時，前兩個顯示了強度減少，而第三個強度增加。頭兩個的頻率隨壓力增加而減少，而發現后者的頻率如圖11所示增加。因此，這些發現表明，在～1153cm-1及～1161cm-1處的組分波帶產生于被氫鍵合的C-OH基的延伸振動，而在～1172cm-1處的波帶是由于未被氫鍵合的C-OH基的延伸振動。
圖12中，○表示對于正常的健康的被剝離的子宮頸組織的細胞的結果，而●表示對于患癌的被剝離的子宮頸組織的細胞的結果，在1466cm-1到1476cm-1的頻率范圍中顯示了酯類的亞甲基鏈的CH2彎曲模式的頻率對壓力的依賴性。這個波帶的頻率對壓力的依賴性，先前已被廣泛用來研究酯類雙層的鏈與鏈之間的緊束及有序/無序性質。已發現在酯類雙層壓力中，這個波帶的頻率要產生一個增量，這是因為出現了上述亞甲基鏈的被誘導的形態與取向有序，由此這一點增加了鏈與鏈之間的相互作用。在惡性子宮頸組織中，與正常健康組織相比，發現壓力在這個頻率范圍誘導了一較小的位移。這表明，在被剝離的子宮頸癌組織的細胞中，比在正常健康的被剝離的子宮頸組織的細胞中，酯類的亞甲基鏈更無序。
圖13中，---表示對于正常健康的被剝離的子宮頸樣品的結果，對于發育異常的結果表示為-·-·，而對于惡性樣品的結果表示為-。
圖13中，與正常樣品相比，發育異常樣品的顯著差別包括a)～1025cm-1、～1082cm-1、～1244cm-1及1303cm-1這些波帶的強度中的劇烈變化，以及b)在～1047cm-1及～1082cm-1波帶的頻率中的顯著位移。
還是在圖13中，與正常及發育異常樣品相比，對于惡性樣品的顯著差別包括a)在～970cm-1、～1025cm-1、～1047cm-1、～1082cm-1、～1155cm-1、～1244cm-1及～1303cm-1這些波帶的強度中的劇烈變化，以及b)在～1025cm-1、～1047cm-1、～1082cm-1及～1155cm-1這些波帶的頻率中的顯著位移。
這些試驗表明，伴隨子宮頸被剝離的癌組織，有幾個重要變化。與正常健康的被剝離的子宮頸組織的細胞相比，在被剝離的子宮頸癌組織的細胞中，發現糖原的量引人注目地減少。這點進一步被下述事實所證實，這事實是，肝癌(肝是一個糖原極豐富的器官)顯示了一類似的光譜圖樣，在結腸癌中未觀察到這光譜圖樣，結腸是糖原貪乏的腸部分。
可將糖原(來自哺乳動物肝的D-糖原)的已知光譜，與申請人在～975至1100cm-1頻率范圍中得到的光譜進行比較(圖13和14)。
進一步，在被剝離的子宮頸癌組織的細胞中，發現核酸的磷酸二酯基的氫鍵合有所增加。這一光譜研究結果與其它一些試驗中的那些發現是共同的，這些其它試驗用了經過癌組織活組織檢查的一些樣品，申請人已檢查了這些樣品，例如這些樣品是結腸、肝、皮膚、陰道及乳房的樣品。
圖14中，對于健康的陰道樣品的結果顯示為---，而對于惡性樣品的結果顯示為-。
圖14中，與正常樣品相比，對于惡性樣品的顯著差別包括a)在～1025cm-1、～1154cm-1、～1240cm-1及～1300cm-1這些波帶處的強度中的劇烈變化，以及b)在～1025cm-1、～1155cm-1及～1081cm-1這些波帶的頻率中的顯著位移。
這些和其它一些試驗表明，本發明是有用的，例如對于檢測來自各種人類或其它哺乳動物器官或組織的分泌物、滲出物、漏出物的被剝離的組織或細胞樣品中的異常是有用的，特別是對于檢測來自Papanicolaou子宮頸涂片的被剝離的癌組織或細胞是有用的，所述Papanicolaou子宮頸涂片也就是子宮頸內涂片、子宮頸外涂片、陰道涂片及子宮涂片。
根據本發明可檢測的被剝離的細胞的異常包括例如病毒、細菌、真菌及其一些傳染及非傳染疾病。
可以檢測被剝離的細胞中或被剝離的組織里細胞中的細胞異常。
權利要求
1.一種用紅外光譜儀檢測被剝離的細胞中存在異常的方法包括a)將一束紅外光照射被剝離的細胞的一個樣品，以及b)通過上述樣品的紅外吸收的光譜分析確定該樣品中是否存在異常，這分析是在至少一個頻率范圍，以確定是否已出現上述紅外吸收特性中的至少一種變化，這變化是由于存在于上述樣品中的至少一種分子功能團的振動而出現，所述樣品表片了那種異常。
2.如權利要求1所述的一種方法，其中所述那些紅外吸收特性中的至少一種變化是在某一特定頻率處的吸收強度變化、出現一特定吸收時的頻率變化或施加到所述功能團上的不同壓力引起的頻率變化，在此頻率出現了某一特定吸收。
3.如權利要求1所述的一種方法，其中上述分子的功能團是下列分子中的至少一種碳水化合物、核酸、組織蛋白質或膜脂類。
4.如權利要求1所述的一種方法，其中上述功能團是核酸中的一磷酸二酯基、組織蛋白質及碳水化合物中的-C-OH基或酯類中的-CH2基。
5.如權利要求1所述的一種方法，其中上述分子功能團是下列物質中的至少一種一些碳水化合物、一些核酸中的一些磷酸二酯基、一些組織蛋白質和碳水化合物的一些C-OH基或一些酯類的CH2基。
6.如權利要求1所述的一種方法，其中上述樣品是Papanicolau涂片。
7.如權利要求1所述的一種方法，其中上述樣品是一子宮頸樣品。
8.如權利要求1所述的一種方法，其中上述樣品是一子宮內樣品。
9.如權利要求1所述的一種方法，其中上述樣品是一子宮外樣品。
10.如權利要求1所述的一種方法，其中上述樣品是一陰道樣品。
11.如權利要求1所述的一種方法，其中上述樣品是一子宮樣品。
全文摘要
用紅外光譜檢測被剝離的細胞中存在異常。將一束紅外光照射到包含細胞的樣品上，所述細胞可以是各種器官或組織的被剝離的細胞的分泌物、滲出物、漏出物、刮屑物、刷下來東西或用其它方式得到的群體，并通過確定已出現紅外吸收中的變化，在至少一個頻率范圍檢測上述異常，所述紅外吸收中的變化是由于功能團的振動產生，這振動例如是核酸的磷酸二酯基的振動、組織蛋白質的COH基的振動、碳水化合物的振動，所述紅外吸收的變化或者是由于酯類分子的特殊排列或存在于所述樣品中的異常酯類結構而產生。
文檔編號G01N33/487GK1067314SQ9210143
公開日1992年12月23日 申請日期1992年2月4日 優先權日1991年2月4日
發明者帕特里克·T·T·王, 巴斯爾·里家斯 申請人:加拿大國家研究會