用于篩選被遮蔽的或部分被遮蔽的細胞的方法和裝置的制作方法

專利名稱：用于篩選被遮蔽的或部分被遮蔽的細胞的方法和裝置的制作方法
技術領域：
本發明總的來說涉及一種用于篩選被另外的細胞種群遮蔽或部分遮蔽的細胞的方法和裝置，這些細胞表達了用于研究、診斷或工業目的的選擇特性。更具體說，該發明涉及一種利用微球體分析該被遮蔽的細胞的方法，該微球體帶有鍵接于其上的特殊的單克隆抗體，使人們對這些被遮蔽的細胞從一個細胞種群到另一個細胞種群的檢測特性發生興趣。
本發明總的說來涉及一種自動分析儀和使用該分析儀的方法，用于篩選用來對種群計數的生物細胞或形成體，這些種群表示用于研究、診斷、醫學或工業目的選擇特性。更具體說，利用本發明的該自動分析器和方法使得能夠對細胞和形成體進行多重部分分類，細胞和形成體的功能性顯示，在其他的細胞之中鑒定白血病、淋巴組織瘤和硬腫瘤細胞，利用了一種電子技術和光學技術的獨特的組合和選擇的生物分子的特異性，例如抗體的特性對這些細胞和形成體來進行這樣的篩選和選擇性計數。
借助Coulter Electronics，Inc.of Hialeah，Florida出品的COULTER COUNTER(注冊商標)Model A成功地實現了利用一臺自動血細胞計數器對人的外周血進行常規全血細胞(CBC)分析的自動化。在美國專利2656508(1953年10月20日授予Wallace H.Coulter)公開了這種儀器的電子顆粒檢測系統原理。僅借助于這種Coulter電子檢測原理工作的顆粒分析測量裝置，就避免了使用容易出故障而又價格昂貴的光學檢測裝置或激光器。
這種Coulter檢測原理得到發展并擴展成為更高級的儀器設備，例如COULTER COUNTER(注冊商標)Model S型儀器，該儀器能借助于專門的計算機程序進行CBC參數測定，絕對細胞計數，血小板計數和形態分析，紅血細胞(RBC)形態分析，從而解釋正常的和不正常的血液樣品。
Coulter電子粒子檢測原理應用了一個使用一種直流(DC)孔電源的孔檢測電路。這種粒子檢測器結構簡單、極其堅固和可靠，在美國以及所有世界其他地區，在臨床實驗室中都普遍采用COULTER COUNTER自動分析儀，這就證實了以上結論。在美國專利3502974(1970年授權于Wallace Coulter和Walter Hogg)中公開了在這種基本的孔檢測電路的一種改進。除去標準的直流孔電源之外，還加有一種高頻孔電流，這種電流使得能夠檢測用于分類目的一種附加參數。高頻孔電流產生一信號，該信號是血細胞的內導電率以及其體積的函數。由直流孔電路同時產生的信號是一種普通的DC振幅信號，該信號主要提供關于細胞體積的信息。利用一高速除法器電路用該直流脈沖振幅去除該射頻振幅，得到一商，該商是細胞體積和內電阻的函數，一般稱為“濁度”。這一原理在美國專利3502973(又于1970年授權于Wallace Coulter和Walter Hogg)中進一步得以說明。這一參數在細胞分類系統中具有適用性。或者是一個單孔，或者是一對隔開的孔，可以利用于這種目的。
不同種群的分類是借助于在那些信號對產生時對這些信號對數據加以依次整理來完成的;一個信號是粒子體積測量值，另一個是細胞內電阻率或濁度的測量值。顯示這種數據的一種方便的形式就是借助于二維繪圖，稱之為散布圖或相關圖。這種圖在以下文獻中有詳盡說明，所述文獻是flow Cytometry and Sorting，Page 371;由Melamed Melaney和Medelsohn編著，1979，John Wiley ∞ Sons，NY，NY.出版。
圖5A是正常血的一個樣品的數據圖的一個例子。每一個點表示一個單獨的細胞。基線以上的高度表示該細胞的相對體積。該點到垂直基線右側的距離表示相對濁度。正常白血細胞(WBC)的圖(除去了紅血細胞)顯示出表示三個不同種群的三個群集，這些群集是在尺寸上和內部組成上這些種群固有差別的反映。如果需要的話，可以利用適合的電路對這些種群進行計數，以便獲得每一個種群的數目。根據這些內在的差別這些細胞得以分類。
Coulter電子粒子檢測原理的最初的應用是進行紅血細胞計數，后來進行有關其他紅血細胞參數的更復雜的測量。通過從整個外周血中除去紅血細胞的方式可以對白血細胞種群進行檢測，只要紅血細胞的消除沒有明顯地損害準備測量的剩余的白血細胞種群的性質。為此目的，紅血細胞溶血試劑得以發展，盡管這種試劑是很有用的并且已被廣泛使用，但它對于接下來的白血細胞測定來說在各方面從整體上來說仍然是不能令人滿意。
上述就單獨使用直流體積或使用各個角度光散射進行白血細胞流式分析的方法已顯示出三群集白血細胞，分別相應于淋巴細胞、單核細胞和粒性白血細胞，粒性白血細胞包括嗜中性、嗜堿性和嗜酸性這三個種群。根據一些采樣能對嗜酸性種群濃度作一個粗略的有用的估計。對于這種方法第五主種群相對說來是太小了。采用專門的熒光技術也已觀察到清晰的群集嗜酸種群。
這些熒光技術已用于柯爾特公司的EPICS(注冊商標)流式血細胞計數器之類的流動式血細胞計數儀器。此類儀器應用了細胞在鞘流(sheathflow)限定的一個柱流中排成一個單行逐個通過激光束的方式細胞運動的原理。從這些細胞來的光散射和/或熒光信號就用來對細胞種群進行分類。染有吸收或熒光染料的細胞使得有可能對另外的細胞種群進行分類。用于自動多參數分析的儀器設備和熒光染料的這種進展由R.C.Leif等人在Clinical Chemistry，Vol.23，pp.1492-98(1977)中作了進一步說明。這些進展將同時進行白血細胞種群分類數擴展為四個，即淋巴細胞、單核細胞、嗜酸細胞和“粒性細胞”(嗜中性細胞和嗜堿性細胞)。
更新近的分析血液學儀器已經將光散射技術與細胞的過氧化物酶染色(吸收染料)一起使用，以產生五部分白血細胞分類。此外，配有諸如單克隆抗體之類具有特殊反應的生物分子的結合染料已將白血細胞分類數增加到可能包括功能細分類。
在申請號為023，345、申請日為1987年3月13日，題為“用于表達選擇特性的種群計數的篩選細胞或形成體的自動分析儀和方法”的第一個原始美國專利申請中公開了一種得到改進的利用同樣原理的單個自動分析儀和方法。該原始申請將電子檢測孔原理、用于對指定的細胞種群或形成體進行鑒別和/或計數的選擇性生物分子的特性和微觀粒子技術加以組合。該自動分析器可以同專門的溶血劑和/或耦合在微球體或成分變化的支撐物上的抗體一起使用。
申請號為285，856、申請日為1988年12月16日，題為“用于篩選帶有表達選擇特性的種群的細胞或形成體的方法和裝置”的第二個原始美國專利申請公開了從全血樣或其中某些部分中篩選直接的子種群。
申請號為339，156、申請日為1989年4月14日;題為“至少利用一種檢測參數用來篩選帶有表達選擇特性的種群的細胞或形成體的方法和裝置”的第三個原始美國專利申請公開了多部分或五部分白血細胞組分，淋巴細胞子種群和根據一全血樣或借助于淘汰一些種群或其子群體的方式被除掉紅血細胞和白血細胞種群的樣品、利用一種或多種光或電子參數完成的重疊測定。
具有選擇性吸附能力的細微粒子使有可能修改決定這些種群的至少一個種群原來位置的參數。把細微粒子大量加到所選定的靶種群上會影響所測的體積和/或濁度，結果引起表示一個種群的那些點的位置發生變化。
已知特性的抗體被用來包覆細微粒子。這種包覆賦予該粒子以選擇性地附著在一定的細胞上的能力，這些細胞表征與該抗體專門作用的抗原。這些被包覆或加標記的細胞是粒子與細胞的組合體，猶如是一個新的整體一樣。它們的濁度、體積或濁度和體積兩者的參數可以看成表示在所獲得的信號中細胞和粒子兩者作用的總和。如果成分特性不同，則按凈效應而言，新的整體將移動到一個新的位置。這個新的位置與只是細胞的情況下從前的位置大大的不同，應該能用來對諸如此類的新的整體或新的整體群進行分類。如果附著在細胞上的粒子是磁性粒子，那么，當然按這時粒子的特性，可以用磁鐵來捕獲這些新的整體。如果混合得很快，就會出現出乎意料的結果，其中包括完全捕獲一個種群而對所研究的細胞的特性并無有害影響。
從一個血液樣品中可以很容易地對僅有三個的不同的種群進行識別和計數，這是利用了它們以前所述的直流體積和濁度參數的固有的和獨特的特性。為了能對更多的種群檢測和計數，必須采取一些諸如改善溶胞系統的步驟，當然，表示被稱為淋巴細胞、單核細胞和粒性細胞的三個基本種群的子種群。根據本原始申請所進行的這些步驟說明了這三個基本種群的子種群是如何獲得的。
使用配合二種或更多種生物微粒檢測技術那些簡單的微孔，就能使表示一給定種群的群集出現在一個獨特的和新的位置上。種群在點散布圖或相關圖上的這種有選擇性的移動是可以重現的，并可以用來對從這三個基本種群中分離出的一個種群進行分類。
通過把微粒附著在所選定的各個細胞上，就能修改直流體積和濁度檢測技術原來的固有的組合方式。由于生物分子、抗體其中包括在它們表面上用作涂覆層的物質的性質和特殊性能賦予這些微粒具有選擇能力。僅僅是一個細胞種群，如果在其表面并沒有微粒，可能占據一個與其它種群或子種群沒有什么區別的點散布圖位置，因而不能相互區分。用這種方法能把具有選擇附著能力的微粒加到我們所要識別、計數和研究的一個具體細胞的種群上去。把足量的具有選擇能力的微粒有選擇地加到一個性質不同的所研究種群上，由于質量、體積和濁度的這種新的獨特的結合導致那個種群的點散布圖位置發生偏移。
把指定的細胞種群分離出來并不會嚴重影響剩下的細胞種群的性質。舉例來說，按照本發明從全血中除去紅血球或紅血細胞(RBC)就能測量T4和/或T8淋巴細胞。使用迄今為止一直使用的化學RBC溶胞劑沒有其他可能。T4/T8細胞的比值已經用來表示與嚴重的病毒感染(其中包括愛滋病病毒)相一致的免疫缺乏癥。細胞表面存在著特殊的受體，這可用來把一個種群劃分為一些子種群，對這種子種群進行計數可以檢測疾病的發作。例如白血病流行的形式中是外周血淋巴細胞的急劇增加。如果有快速增殖的淋巴細胞攜帶有T11受體的子群體，那么這個病人就有免疫不正常的危險。
再者，如果T11陽性淋巴細胞的子種群具有T4受體，則這個患者就被劃分為通常在日本發生的那一類病人。這些細胞被定義為“重疊”，因為這些細胞至少包括人們所感興趣的兩種受體或抗原。重疊可能是一種診斷和治療的重要的參數。在正常的全血樣品中重疊種群的例子就是CD2和CD8子種群。種群的一種不正常的重疊的例子是在CLL(慢性淋巴細胞白血病)中發現的。在CLL病態，CD5和CD20子種群重疊。此外，如果T4受體子種群擴展為2H4陽性，那么病人不僅說明有多種感染的趨勢，而且患有急性白血病，同樣因為T11、T4、2H4向性細胞是抑制誘導體并且功能地抑制了患者產生抗體的能力。因此，該患者受到多種感染，必須進行接受對白血病和免疫缺乏的治療。參考K.TaKatsuki，et al.，GANN monograph on Cancer Research 2813-22，1982;C.Morimoto，et al.，Coulter Japan Symposium，1984;C，Morimoto，et al.，Immunology 134(3)1508-1515，1985;C.Morimoto，et al.，New England Journal of Medicine 316(2)67-71，1987.本發明還可用于對諸如在其中包括細菌和病毒的形成體的懸浮液進行分析。
應用本發明的方法和裝置可用于各種免疫反應，例如包括反應劑和形成體或細胞的免疫反應。本發明還用于分析形成體懸浮物，例如在其中包括細菌和病毒。在這里使用時，細胞被限定為動物或植物細胞，包括細胞細菌、真菌，這些細胞單獨地或聚合都可以認為是相同的。細胞是可以作為一個獨立單元起作用的活的物質的最簡單結構的集合。例如，這些細胞可以是取自組織或血樣的人體RBC和WBC種群，癌或其他不正常細胞。形成體被限定為某些細菌或病毒。本發明可用于對病人的診斷和監視。本發明尤其可用來除去或轉移種群以分析用別的方法不易識別的種群或子種群。適于加標記或示蹤的細胞和形成體可以有理由認為是可以用本發明的方法和裝置以與人體血細胞樣品相同的方式檢測。
盡管“反應物”這個詞在原申請中已被用來定義溶胞劑和單克隆抗體，反應物還可以包括檢測并與一種或多種特殊的分子反應的各種試劑，而所述特殊的分子是在細胞形成體的表面上。以下給出一些例子反應物 特殊的分子抗體 抗原藥物 藥物受體激素 激素受體生長因子 生長因子受體該反應物偶合或鍵合于該細胞特殊的分子上。這些反應物的確形成了化學反應的一部分;然而，這些反應物不是必然的化學改變。
本發明提供了一種單獨的多用途分析儀和使用該儀器的方法，該儀器將最低限度的電子和/或光微粒檢測技術與具有選擇能力的生物分子的特殊性能相結合，大大促進了用于臨床實驗室和工業的自動分析儀器領域的發展。人體外周血液中的多種白血細胞子種群的檢測和它們的相互關系對醫學研究和人體疾病診斷是十分重要的。這些數據對諸如白血病之類的疾病進行鑒別和診斷的篩選手段是很有用的。用執行本發明來鑒定不正常的情況提供了診斷有關的信息，研究范圍并不限于檢測白血細胞種群，正如本發明的說明書和附圖所顯示出的那樣。
本發明的一個極有價值的特點是應用了單獨的穩定的Coulter檢測操作。這種操作是十分穩定而且不需要復雜昂貴的光學系統，但如果需要的話也可以使用光檢測。附加RF振蕩器和檢測器所需的電路裝置經濟、堅實和可靠。所需要的就是一個單孔，但附加一個第二孔或甚至第三孔可能經濟地使更大的樣品通過量成為可能。
一種用于完成篩選被遮蔽的或被部分遮蔽的細胞的方法和裝置，以對諸如白血細胞種群子種群的一種或多種被遮蔽的細胞計數。該被遮蔽的細胞或白血細胞種群子種群通過鑒定由被研究的細胞來表達的選擇特性來進行計數。
可以對一種全血樣或其一部分進行篩選，以提供所需要的對諸如該樣品中的一種白血細胞種群子種群的一種或多種被遮蔽的細胞的分析。例如，要詳細地描述這種白血細胞種群，包括被遮蔽的被研究的子種群的一個白血細胞種群首先同一種標準種群一起進行計數。這種標準種群可能是全部白血細胞種群中的一個，一個不遮蔽被研究子種群的被轉移或未被轉移的被檢測特性的第二白血細胞種群，一個也不遮蔽被研究子種群的被轉移或未被轉移的被檢測特性的由微球體形成的人造種群或一個該子種群的被檢測特性將全部或部分地被轉移為其特性的白血細胞種群。于是，被研究的白血細胞種群子種群的被檢測特性通過將具有專門用于該白血細胞種群子種群的單克隆抗體的微球體鍵接到該細胞種群上而被轉移。而后再一次對該白血細胞種群和該標準種群進行計數并與原計數值加以比較以獲得被研究的白血細胞種群子種群的計數值。
現在，我們借用舉例的方式，參考本說明書的附圖來描述本發明的一些最佳實施例。
因此，本發明的第一個目的是提供一種從一個樣品的至少一部分中獲得一個被遮蔽的或被部分地遮蔽的種群分析的方法，該樣品的這一部分中至少含有一個包括至少一個被研究的種群子種群的第一細胞種群和第二細胞種群，其特征在于通過電子方式對包括至少第一細胞種群及其子種群的一個第一種群進行檢測和計數以產生第一計數值，將被研究的細胞種群子種群從所述第一細胞種群中轉移出來并且至少部分地轉移到一個第二細胞種群中，通過電子方式對包括至少第一細胞種群及其子種群的剩余的第一種群進行檢測和計數以產生一個第二計數值，以及比較所述第一和第二計數值以獲得被研究的細胞種群子種群的百分比貢獻。
本發明的第二個目的是提供一種用于從一個樣品的至少一部分中獲得一種被遮蔽的或被部分地遮蔽的種群分析的一個裝置，這一個樣品的一部分至少含有一個包括至少一個被研究的種群子種群的第一細胞種群和一個第二細胞種群，其特征在于它包括用于通過電子方式對一個包括至少第一細胞種群及其子種群的第一種群檢測和計數以產生第一計數值的部件;用于把所研究的細胞種群子種群從所述第一細胞種群中轉移出來并且至少部分地轉移到第二細胞種群中的部件;用于通過電子方式對剩余的包括至少第一細胞種群及其子種群的第一種群進行檢測和計數，以產生一個第二計數值的部件和用于比較第一和第二個計數值以獲取所研究的細胞種群子種群的百分比貢獻的部件。


圖1-13描述那些在申請號為025，345的第一原申請中所公開的實施例。
圖1是原申請的一個細胞種群分析器實施例的圖解方框圖;
圖2是原申請的第二分析器實施例的圖解方框圖;
圖3是相應于圖1和圖2的原申請的一個具體的分析器實施例;
圖4是原申請的另一個分析器實施例的原理方塊圖;
圖5A和圖5B是用類似于圖2和圖3所示的典型分析器系統得到的一組結果的點散布圖;
圖6是原申請又一個分析器實施例的原理方塊圖;
圖7是原申請再一個分析器實施例的原理方塊圖;
圖8A和圖8B、圖9A和圖9B;圖10A和圖10B，圖11A和圖11B是用類似于圖6和圖7所示的典型分析器系統得到的一組結果的點散布圖;
圖12是原申請又一個分析器實施例的原理方塊圖;
圖13是用類似于圖12所示的典型分析器系統得到的一組結果的點散布圖;
圖14-26D描述那些在申請號為285865的第二個原申請中公開的實施例;
圖14是原申請的一個WBC種群子種群分析器實施例的原理方塊圖;
圖15是原申請的一個WBC種群子種群分析器實施例的另一個的原理方塊圖;
圖16是原申請相應于圖14和圖15的一個具體分析器實施例;
圖17A和圖17B是用類似于圖3和圖16所示的典型分析器系統得到的一組結果的點散布圖;
圖18A是L.M和G種群的點散布圖，而圖18B是L.M和B種群的點散布圖，這些結果是用類似于圖16所示的典型分析器系統所獲得的;
圖19A-D，圖20A-D和圖21A-D是不同患者樣品的CD4，CD8，CD2和CD20子種群的點散布圖;
圖22A是類似于圖18A的點散布圖，圖22B是說明E種群和N種群偏移的點散布圖，而圖22C是說明E.N和CD4種群偏移的點散布圖;
圖23A-D是說明利用一個鍵合到所研究的WBC子種群上的微球體和一個鍵合到第一微球體上的第二微球體的一個直接的WBC子種群分析的點散布圖;
圖24A-C是說明在原申請的偏移分析中所利用的微球體尺寸影響的點散布圖;
圖25A-D是說明一個利用原申請的技術同時分析二個WBC子種群的點散布圖;
圖26A-D是在不同參數點散布圖上說明相同的一些種群的點散布圖;
圖27-46描述一些申請號為339156的第三原申請的實施例;
圖27是該原申請的一種單式檢測參數幾部分WBC種群子種群分析器實施例的一種原理方塊圖;
圖28是對應圖27的該原申請的一個具體的分析器的實施例;
圖29A-D是用一個類似于圖27和圖28典型分析器系統和一個DC檢測參數得到的一組結果的點散布圖;
圖30A-D是利用一種RF檢測參數的圖29A-D的同樣結果的點散布圖;
圖31A-D是利用一個類似于圖27和圖28的典型分析器系統和一種DC檢測參數得到的第二組結果的點散布圖;
圖32A-D是利用一種RF檢測參數得到的圖31A-D的相同結果的點散布圖;
圖33-36是說明使用一個單獨的光檢測參數的得到的結果的點散布圖;
圖37是關于增強小的或遮蔽種群的一種WBC種群子種群分析的原理方塊圖;
圖38A-E是利用一種類似圖27和圖37所示的典型分析系統和一種RF檢測參數所獲得的一組結果的點散布圖;
圖39A-E是利用一種DC檢測參數得到的另一組結果的點散布圖;
圖40A-E是利用一種RF檢測參數得到的相同的一組結果的點散布圖;
圖41A-E是利用二個檢測參數得到的一組結果的點散布圖;
圖42A-G和圖43A-G是在二個各自的不正常的血樣中利用不同的檢測參數所得到的結果的點散布圖;
圖44是用于測定細胞重疊分類的本發明一種WBC子種群分析實施例的原理方塊圖;
圖45A-D和圖46A-D是利用類似于圖27和圖44所示的一種典型分析器系統和一個DC檢測參數所得到的二組結果的點散布圖;
圖47-60涉及本發明的若干實施例;
圖47是本發明的一白血細胞種群子種群分析器的一個原理方塊圖;
圖48A和圖48B是說明在本發明中所利用的分類法的概念的點散布圖;
圖49-60是利用本發明的分類法分析被遮蔽或被部分遮蔽的白血細胞種群子種群所得結果的點散布圖。
圖1-13描述了申請號為025345的第一原申請的一些實施例。
參照圖1，申請號為025345的原申請的細胞這種群分析方法和裝置的第一個實施例一般用編號10表示。分析器(10)包括一個含有至少一個第一組活的生物細胞(沒有示出)的生物樣品(12)，例如在全血樣中或從全血樣中取出的細胞。生物樣品(12)的細胞在進行定量和/或定性測定或分析時被卷入一生物反應，樣品(12)中可能還含有緩沖液，所述細胞就加進這種緩沖液中。
樣品(12)經通路(14)與經通路(18)的至少一種反應物(16)混合。然后，由在功能上被指定為RBC除去部位(20)將紅血細胞(RBC)從混合物中清除。部位(20)可以用若干種方法將所述那些RBC從該混合物中清除。RBC可用溶胞劑在反應物(16)中細胞溶解。一種這樣的優先選用的溶胞劑和可以利用的一種猝滅劑在題為“Method And Reagent System for Isolation Identification and/or Analysis of Leukocytes from whole Blood Samples”(申請號為130911，申請日為1987年12月10日)的申請案中被公開，該案是申請號為025303，申請日為1987年3月13日，題目相同的CIP，在這里僅作參考。反應物(16)可能是或者包括許多帶有抗體的磁性微球體，這種抗體是專門用于RBC鍵接在這種微球體上(未示出)。在這個例子中，所利用的這種特殊的紅血細胞專用抗體在題為“Monoclonal Antibody for Recovery of Leukocytes in Human Peripheral Blood and Method of Recovery Employing said Monoclonal Antibody”(申請號為799489，申請日為1985年11月19日)的申請案中被公開，該申請案在這里僅作參考。除樣品緩沖液之外反應物(16)還可能包括一種緩沖液，而且反應物(16)還可以包括一種緩沖液代替樣品緩沖液。反應物(16)還可能是一種所述優先選用的溶胞劑和所述RBC專用微球體的組合體。
一旦RBC基本上從混合物中被清除，這一部分混合物就通過通路(24)送到白血細胞(WBC)分析器(22)。WBC分析器(22)至少要對混合物中的WBC進行計數。WBC分析器(22)還能測量WBC的一個或多個體積或濁度參數。分析器(22)得出的結果通過線路(28)送到比較器(26)。
第二部分RBC貧化的混合物通過通路(32)送到WBC子種群減去部位(30)。有許多方式能從混合物中減去WBC。帶有專門對WBC某一子種群的單克隆抗體的微球體能加到混合物中。該子種群被鍵接到那里。非磁性微球體能鍵合在WBC上，以改變或移動該細胞的生成物濁度和體積參數。磁性微球體也能鍵合到WBC上，于是這些WBC就能用磁場從該混合物中清除。
還除去WBC子種群或已改變一個或幾個參數的混合物而后就通過通路(36)送到WBC子種群分析器(34)。分析器(34)可以與分析器(22)是相同的。然后，由分析器(34)得到的結果通過線路(38)送到比較器(26)。然后比較器(26)能把分析器(22)送來的WBC結果與分析器(34)送來的經過修正的結果加以比較，以確定所選定的白血細胞種群的至少一個特征，例如在一個特殊范圍的細胞數。
參照圖2，實施原申請的細胞種群分析方法和裝置的第二個實施例簡略地用參考數字(40)標記。分析器(40)包括也含有至少一個第一組活的生物細胞(未示出)(例如在全血樣中或從全血樣中取出的細胞的)生物樣品(42)。生物樣品(42)的細胞在進行定量和/或定性測定或分析時要卷入一生物反應。樣品(42)也可以包括有一種緩沖液，細胞就加進這種緩沖液中。
樣品(42)通過通路(44)與通過通路(48)的至少一種反應物(46)混合。在分析器(40)中，由在功能上被指定為去除RBC和移動WBC的部位(50)在除去混合物中的RBC的同時改變或移動至少一個WBC子種群的至少一個特性。如上所述，該部位可以按許多方式來除去混合物中的RBC，這在前邊就部位(20)已經列舉過了。同時，在這相同的混合物部分中，WBC被鍵合在通常是非磁性的微球體上，以改變或移動細胞的生成物濁度和/或體積參數。
然后，已除去RBC和已移動WBC子種群的混合物通過通路(54)送到分析器(52)。分析器(52)可基本上與分析器(22)相同。因此，分析器(40)對一個選定的WBC種群或WBC子種群的至少一個特性提供了快速的直接的分析。
實施原申請并能完成第一和第二分析器(10)和(40)的分析的一種分析器裝置的具體的實施例在圖3中一般用參考數字(56)來標記。
在儀器(56)中，只表示出一個具體的記數，按照原申請的原理可以作出幾乎無數種變化。再者，對儀器(56)顯示的是在一般的功能上的細節，而具體的實施例可以按許多已知的方式完成其結構。
儀器(56)包括一個用來將所研究的生樣品，如樣品(12)或(42)，抽入儀器(56)的吸氣泵機構(58)。吸氣器(58)通過通路(60)與連接到采樣探頭(63)上的采樣閥(62)連接。溶胞劑泵(64)可以含有諸如反應物(18)或(46)那樣溶胞劑一部分，而且通過通路(66)也與閥(62)相連接。在適當的時機，閥(62)和泵(58)可以與經泵(64)而來的溶胞劑一道吸取生物樣品(12)或(42)。
而后，反應物的混合物或生物樣品本身經由泄放通路(68)送到混合裝置(70)。混合器(70)包括一個送入樣品或反應物的混合室(72)。在這一點上分析器(10)和分析器(40)的工作不一樣，因此，將分別加以描述。
在分析器(10)的情況下，如果RBC已經被來自泵(64)的溶胞劑溶胞，則在反應完成時從部位(74)經由通路(76)供給猝滅劑或固定劑。攪拌混合室(72)內的溶胞劑和樣品可以促進反應，如同在(78)所表達的功能那樣。
在這里可以采用的合適的混合裝置(70)的具體細節在申請號為025337、申請日為1987年3月13日，題為“Method And Apparatus for Rapid Mixing of Small Volumes For Enhancing Biological Reactions”的申請案中被公開，該申請案在此被收作參考。通過使用混合器(70)，反應速度大為提高，但并沒有明顯地損害我們所研究的細胞特性，而如用提高反應溫度的辦法，則細胞特性受到損害。進一步說，通常反應可以在遠小于1分鐘時間內完成，一般是大致15秒或更短。這使自動化程度高的體積分析儀(56)可以進行高速分析。
而后，被溶胞劑除去RBC并已停止反應的反應物(即自部位(20)送出的)經由通路(80)送到容納室(82)，在這種情況下，該室將容納該混合物的第二部分。該混合物的第一部分將從室(82)經由通路(84)送到WBC分析器(86)(即分析器(22))。按照Wallace H.Coulter在美國專利2656508中所說明的和在Coulter電子公司經銷的大量商品血細胞計數器中所實施的計數和尺寸測量的技術，分析器(86)可以具有許多實際類型。
通常，分析器(86)包括一個流動式檢測器或檢測室(88)。室(88)包括一個具有一個貫通孔(92)的變換器。室(88)包括一個具有一個與那里的流體接觸的第一電極(96)的第一部分(94)。
該室的第一部分(94)和電極(96)通過孔(92)與其中具有一個第二電極(100)的室第二部分(98)相連通。電極(96)和(100)通過反饋導線(102)和(104)與RF/DC源和檢測電路(106)相連。電路(106)將直流或低頻電流或信號和在電極(96)和(100)的高頻信號兩者偶合。
低頻信號用來檢測由通過孔(92)的一個細胞所引起的信號脈沖的振幅。高頻信號用來獲得通過孔(92)的同一細胞的電濁度。
Wallace H.Coulter和Walter R.Hogg在美國專利3502974以及以后的幾個專利中，以及Coulter Electronics Inc.經銷的出版物中對測量細胞的電濁度作了說明。一種能在這里應用的具體的電路在題為“Particle Analyzer For Measuring the Resistance and Reactance of A Particle”的案例168008中被公開，該案例的申請日為1986年10月21日，現在的美國申請號為921654，該申請案在此列入參考。
由電路(106)從被檢測細胞產生的信號經由DC信號引線(108)和RF信號引線(110)耦合到比較器(112)[類似于比較器(26)]。比較器(112)可以存儲從第一部分，即沒有減去WBC子種群的那部分，產生的信號，以便與從所述第二部分得到的結果相比較。
分析器(86)可以包括一個以眾所周知的方式將細胞聚集到檢測器(88)的鞘流，該鞘流可以由射流系統(114)提供，該系統用一對通路(116)和(118)以一種已知的方法與檢測器(88)相連。樣品反應混合物可以經導入管(120)送入檢測器(88)，也能經排出管(122)從檢測器(88)排到廢液容器(124)中。
當該混合物的第一部分正在分析器(86)內進行分析時，該混合物的第二部分就保存在室(82)里，而混合器(72)由清洗通路(120)清洗或沖洗，并通過廢水通路(128)排出。一旦室(72)清洗完畢，第二部分經通路(130)返回室(72)。象部位(30)一樣，現在通過加入經通路(134)、閥(136)和室通路(138)自部位(132)送出的WBC微球體的方法把WBC子種群減去。
用混合機構(78)將WBC微球體與第二部分混合。如果WBC微球體是非磁性的，則鍵合有WBC的微球體的反應混合物經通路(80)、室(82)以及通路(84)送入分析器(86)[即分析器(34)]，在那里對第二部分進行類似對第一部所進行的那樣的分析。然后，將這結果在比較器(112)[即比較器(26)]里比較。在第二部分由所述WBC子種群鍵合微球至少改變了所述WBC子種群細胞參數的一個，例如細胞濁度，以便提供被改變了的結果，然后可以對這些結果進行分析。
如果這WBC微球體是磁性的，鍵合在微球體上的WBC子種群在混合過程中和/或混合以后用一個磁場或磁鐵(140)除去。該磁場可以由電磁部件或由相對于室(72)以物理學方式被移動的磁體(140)產生，以用磁性方式捕獲被鍵合的WBC子種群。而后不帶鍵合的WBC子種群的第二部分經通路(80)、室(82)以及通路(84)送到分析器(86)用以上所述方式以便得到分析[類似于分析器(34)]。
此后，裝置(56)準備為下一次分析取樣。探頭(63)可以用探頭清洗機構(142)進行清洗，而一些通路及室(72)和(82)可以很方便地加以沖洗。以后的樣品混合物的每一次分析都可以以一種快速的自動的方式來進行。在以后的樣品混合物的各次分析之間的時間間隔大約是幾分鐘或更少一些。
在操作分析裝置(56)時，與分析器(40)類似，含有RBC溶胞劑/反應物(46)和樣品(42)的反應混合物在室(72)中與來自部位(132)的鍵合有WBC子種群之一的非磁性WBC微球一道相混合。猝滅劑(74)被加到反應混合物中，而后將該混合物經通路(80)、室(82)以及通路(84)送到分析器(86)進行分析[即類似于分析器(52))。
在分析器(10)和(40)任何一種，作為一個代替使用溶胞劑的方法，樣品(12)或(42)都可以經閥(62)送入混合器(70)而不帶有任何溶胞劑。在這種情況下，可以利用鍵合有RBC專用抗體的微球體以磁性方式除去WBC，這些微球體由一個RBC微球體部位(144)經通路(146)送到閥(136)，再經通路(138)送到室(70)。在那里不使用溶胞劑，在混合后鍵合有RBC的微球體用磁鐵(140)以磁力除去，其方式大致與前面所述以磁力去除鍵合有WBC的微球體的方式相同。
此外，在第二種促進反應速度的情況下，可以利用既含RBC溶胞劑又含有RBC磁性球的樣品的反應混合物。攪拌反應混合物，溶胞作用被猝滅，鍵合的RBC以磁力除去，然后進行如上所述的WBC分析。
現在參照圖4，實施原申請的細胞種群分析方法和裝置的另一個實施例，總的用參考數字(148)標記。分析器(148)包括一個生物樣品(150)，該生物樣品也至少含有第一組活的生物細胞，如在全血樣中或從全血樣中取出的細胞。樣品(150)也可以含有緩沖液，那些細胞就加在該緩沖液中。
樣品(150)經通路(152)與經通路(156)的至少一種反應物(154)混合在一起。然后，如前所述，利用從功能上被指定為RBC去除部位(158)除去RBC。去除了RBC的反應混合物經通路(160)送到WBC分析器(162)，由分析器(162)得出的結果經線路(166)送到比較器(164)，提供了帶有關于單核細胞(M)、淋巴細胞(L)和粒性細胞(G)的結果的一種三部分的WBC組分。
然后該混合物經通路(170)送到從功能上被指定為嗜中性細胞(N)去除部位(168)。通過移動或改變一個參數，如濁度的方式或通過磁力去除方式從該混合物中除去N細胞，這兩種方式均如上所述。在這個例子中，所用的特殊的N專用抗體在題目為“Monoclonal Antibody Specific to Neutrophils”的判例中被公開，該判例的申請日為1986年12月8日，目前的美國申請號為938864。
而后，被除去或移動了N細胞的混合物就經通路(174)送到另一個WBC分析器(172)。分析器(172)的結果經線路(176)送到比較器(164)。分析器(172)的結果用來獲得四部分的WBC組分，該組分還帶有關于M細胞和L細胞的結果，然而目前另外還有因為所述N細胞被除去或移動，還獲得關于嗜酸性細胞(E)和嗜堿性細胞(B)的結果。而后就可以用比較器(164)比較來自分析器(162)和(172)的二種分析結果，以便形成五部分的WBC組分。具體說，從G細胞的數中減去B細胞的和E細胞的數，得出被除去的N細胞的數。
現在參見圖5A和圖5B，說明二組點散布圖結果是利用類似于分析器(148)的典型的分析方法從一個全血樣品獲得的，生物樣品(150)是20微升全血樣，該血樣同140微升緩沖液混合的40微升的鍵合有RBC專用抗體的磁性微球體混合，形成反應物(154)。將該反應混合物攪拌15秒鐘并在部位(158)中的磁場中放置10秒鐘。除去RBC的混合物由分析器(162)進行分析，結果如圖5A的點散布圖所示，L細胞的計數為45.6(1)，M細胞的計數為5.6(2)以及G細胞的計數為48.7(3)。
然后，該混合物在部位(168)與10微升帶有鍵合N細胞專用抗體的磁性微球體混合。將該混合物攪拌30秒鐘，而后在一磁場中放置10秒鐘。而后，除去了N細胞的混合物送到分析器(176)，形成圖5B的點散布圖，結果是L計數為81.0(1)，M計數為0.6(2)，E計數為11.0(3)以及B計數為1.8(4)。而后比較器(164)給出L計數為45.6、M計數為5.6、N計數為41.6，E計數為6.0和B計數為1.2的五部分的WBC組分。這與利用載片上樣品的Wright染色、所得結果計數為L計數44.0，M計數為3.4，N計數為45.0，E計數為6.1和B計數為0.4的標準是微五部分的WBC組分相一致。
圖6說明實施原申請的細胞種群分析方法和裝置的再一個實施例，總的用數字(178)標記。分析器(178)包括一個生物樣品(180)，該生物樣品也含有至少一種第一組活的生物細胞，也可以包括一種緩沖液。
樣品(180)經通路(182)與經通路(186)的反應物(184)混合。現從功能上作如下說明該混合物的第一部分經通路(188)送到功能上被指定為RBC和N去除部位(190)。如前所述的那樣，將RBC細胞和N細胞除去或移位，并將該第一部分經通路(192)送往WBC分析器(194)。
由分析器(194)給出了一個結果，該結果經由線路(196)送往比較器(198)。該結果包括以上所指的含有M、L、E和B的四部分的組分。
同時，樣品(180)與反應物(184)的混合物的第二部分經通路(200)送到在功能上被指定為RBC去除部位(202)。除去了RBC的混合物經通路(204)送到另一個WBC分析器(206)。分析器(206)的結果經線路(208)送到比較器(198)。分析器(206)的結果就直接包括以上所指的包括M、L和G計數的三部分的WBC組分。然后，用比較器(198)比較分析器(194)和(206)的結果，給出五部分WBC組分。
結合分析器(178)的方法和裝置的一個具體的分析儀器實施例在圖7中總的用參考數字(210)標出。此外，只表示出一種具體的計算機部件計算，但與分析儀(56)一樣，分析儀(210)可以由許多構形實現。
儀器(210)包括一個由通路(216)連接到采樣閥(214)上的吸氣泵機構(212)。閥(214)可以包括一個樣品探頭(218)，以吸取所要研究的生物樣品，例如樣品(180)。稀釋劑供給泵(220)由通路(222)連接到閥(214)上，以便在需要的時候為樣品，例如全血樣，提供稀釋劑。而后，該混合物的第一部分經通路(224)和通路(226)送到第一混合器(228)。同時該混合物的第二部分經通路(224)和通路(230)送到第二混合器(232)。
混合器(228)(可比得上部位(190)基本上與混合器(232)(可比得上部位(202))相同，將首先予以說明。混合器(228)包括一個混合室(234)，混合物的第一部分就送到這個室。混合器(228)包括上述所有各種選擇，如果需要還可以包括用于RBC溶胞的溶胞劑輸入通路(236)。
如果采用溶胞劑，則在混合(如在238中所顯示功能)后，經由猝滅劑通路(240)加入猝滅劑。同時，通過加入帶有N專用抗體鍵合的合適的磁性或非磁性微球體的方式除去N細胞，這種微球體是由微球體源(242)經通路(244)送入室(234)內的。如果對N細胞或RBC使用磁性微球體，則要用磁鐵(246)或磁場通過磁力方式除去被鍵合的細胞。
而且，被混合和被猝滅(如果需要的話)的混合物經通路(248)通過閥(250)和通路(252)送到WBC分析器(254)(即分析器(194))。分析器(254)與分析器(86)相同，就不再那么詳細地說明了。此外，分析器(254)包括一個帶有孔(258)的檢測室(256)，混合物和細胞就穿過這個孔。鞘流射流系統(260)可以連接到室(256)上。細胞產生的信號由RF/DC源和檢測電路(262)檢測，其輸出信號送到比較器(264)，如前所述。
同時，混合物的第二部分送入混合室(266)。在這第二部分中，只除去RBC(即類似部位(202))并且RBC可以用經由通路(268)送入室(266)的RBC溶胞劑來除去。將溶胞劑同樣品混合，而后經猝滅劑通路(270)加入猝滅劑。可以用帶有鍵合RBC專用抗體的磁性微球體來除去RBC，這種微球體是從微球體源(272)經通路(274)送入室(266)內的。這些微球體在(276)被混合，而后用磁鐵(278)將鍵合RBC的微球用磁力方式除去。
而后，已除去RBC的混合物經通路(280)送到閥(250)再經通路(252)送到分析器(254)，以便獲得以上所述結果。混合器(228)和(232)包括合適的相應清洗通路(282)和(284)，以及排廢通路(286)和(288)，還有探頭清洗機構(290)，以便在吸入下一個樣品或要分析的樣品之前清洗儀器(210)。
圖8A和圖8B給出了用類似于分析器(178)的分析方法從一個全血樣得到的結果的點散布圖。在這個例子中，樣品(180)為20微升全血，而反應物(184)為40微升鍵合RBC專用抗體的磁性微球體和140微升緩沖液混合。該混合物的一部分在部位(202)內攪拌20秒鐘，而后在磁場中放置10秒鐘。而后，除去RBC的混合物在分析器(206)內進行分析，產生圖8A的點散布圖，該圖給出L的計數為29.4(1)，M的計數為8.1(2)和G的計數為62.4(3)。
同時，同一混合物的另一部分在部位(190)與10微升帶有鍵合N專用抗體的磁性微球體相混合以除去RBC和N細胞。將該混合物攪拌30秒，而后在磁場中放置10秒。除去了N和RBC的混合物又用分析器(194)進行分析，產生圖8B的點散布圖，該圖給出L的計數為73.5(1)，M的計數為21.7(2)，E的計數為3.4(3)和B的計數為1.4(4)。這兩種計數在比較器(198)內進行比較，得到五部分的WBC組分，為L的計數29.4，M的計數為8.0，N的計數60.8，E的計數為1.2和B的計數為0.60并且還作了顯微鏡方法比較，得到的計數為L29.4，M5.0，N65.0，E1.0而B小于1.0。
圖9A和圖9B為類似于圖8A和圖8B的五部分的WBC組分的例子的結果的點散布圖。按照對應于圖8A和圖8B所述的同樣的步驟分析20微升全血樣，得出圖9A的點散布圖，該圖給出的計數為L為35.4(1)，M為14.6(2)和G為50.0(3)。圖9B的點散布圖給出的計數為L為66.4(1)，M為25.0(2)，E為6.6(3)和B為2.0(4)。最后得到的五部分的WBC組分結果用如下計數表示L為35.4，M為14.6，N為45.5，E為3.5和B為1.1，而與此相比較的顯微鏡計數為L為36，M為11，N為49，E為3和B為1。
圖10A和圖10B也給出了類似于圖8A、圖8B和圖9A、圖9B的五部分的WBC組分的點散布圖結果，但在這個例子中使用了溶胞劑。在這個例子中，將20微升全血樣與80微升的緩沖液以及240微升的以上所述的RBC優選溶胞劑相混合。將該混合物攪拌6秒鐘，而后加入猝滅劑。時間的長度非常關鍵，因為大于10秒尚未被猝滅的溶胞劑將開始對WBC的性質產生非常顯著的影響。對除去了RBC的混合物進行分析，以得出圖10A的點散布圖，該圖的結果用計數表示為L為25.7(1)，M為9.6(2)和G為65.0(3)。
含有第二個20微升全血液的該混合物的第二部分與120微升緩沖液和10微升帶有鍵合N專門抗體的磁性微球體相混合，攪拌30秒鐘，而后在磁場中放置10秒鐘。然后，將RBC優選溶胞劑加入已除去N的混合物，而在溶胞作用被猝滅之前將該混合攪拌6秒鐘，所得出的點散布圖10B結果用以下計數百分比表示L為74.6(1)，M為21.6(2)，E為2.9(3)和B為0.8(4)。所得出的五部分的WBC組分結果用計數百分比表示為L為25.6，M為9.6，N為63.5，E為1.06和B為0.3。與此相比較顯微鏡的計數結果為L為29.4，M為5.0，N為65.0，E為1.0和B小于1。
類似于圖10A和圖10B的五部分WBC組分的點散布圖的另一個例子用圖11A和圖11B表示。一個全血樣曾有過二個按對應用圖10A和圖10B所述的相同的步驟同時分析的樣品。圖11A的點散布圖提供的計數L為31.9(1)，M為17.6(2)和G為50.4(3)。圖11B的點散布圖提供的計數L為67.1(1)，M為24.1(2)，E為7.6(3)和B為1.2(4)。所得出的五部分的WBC組分的結果是L為31.9，M為11.4，N為46.0，E為3.6和B為0.7。作為比較，顯微鏡計數為L為36，M為11，N為49，E為3和B為1。
實施原申請的細胞種群分析方法和裝置的又一個實施例總的用參考數字(292)標記在圖12中。分析器(292)包括一生物樣品(294)，該生物樣品還包括至少第一組活的生物細胞，如果需要的話還包括一種緩沖液。
樣品(294)經通路(296)與經通路(300)來的至少一種反應物(298)相混合。在分析器(292)中，在一個指定的功能的部位(302)順序地或同時除去RBC和移動N。RBC除去功能標記為(304)，而N除去或移動功能標記為(306)以便指示這二種功能可以同時執行或順序完成。RBC可以用如上所述的磁力方式或溶胞劑或這兩種方式的組合來除去。N的去除或移動是通過將帶有鍵合有N專用抗體的微球體加入該混合物中進行的。
一旦RBC被去除并且N被除去或移動，而后得到混合物經通路(308)送到分析器(310)。在這種情況下，N被充分地移動離開E和B的圖形，結果直接得到M、L、E、B和N的五部分的WBC組分。分析器(292)的這一功能可以利用儀器(56)和(210)或者它們小的變動的儀器來完成。
用分析器(292)直接得出五部分的WBC組合的一個例子的點散布圖的結果表示在圖13中。在這個例子中，生物樣品(294)是20微升全血樣，而反應物(298)是10微升帶有鍵合N專用抗體的非磁性微球體，該微球體摻有100微升緩沖劑并在子部位(306)中攪拌過30秒鐘。而后，將10微升RBC優選溶胞劑加入到該混合物中，該混合物在加入猝滅劑之前曾在分部位(304)攪拌過6秒鐘。然后，除去了RBC并移動了N的混合物由分析器(310)加以分析，得到圖13這個點散布圖，該圖給出的直接記數L為29.6，M為13.6，N為52.2，E為3.4和B為1.06，作為比較的顯微鏡計數L為35，M為5，N為56，E為4并無B。在這個具體的例子中，該全血樣也用Coulter電子公司的通用細胞計數儀進行了分析，結果是L為29，M為11.1和G為59.9(N，E和B)。
現在參照圖14-26D，說明申請號為285856的第二個原申請的一些實施例。
參照圖14，所述第二個原申請的WBC種群子種群分析方法和裝置的第一個實施例總的標記為參考數字(320)。分析器(320)包括至少含有第一組活的生物細胞(未示出)的生物樣品(322)，它包括具有至少一個可確定子種群的至少一種白血細胞種群，例如在全血樣中或從全血樣中取出的樣品。如在此所采用的，WBC子種群是專用單克隆抗體能鍵合在其上的一個WBC種群的子種群。世界健康組織和國際免疫學會對單克隆抗體現已規定了一種命名法。單克隆抗體由分化基(CD)術語來定義，這種術語為細胞或細胞群和專用于這種CD群的單克隆抗體定義了具體的特性。僅僅作為例子而言，在以后的例子中要用到四個CD群CD4、CD8、CD2和C20。這個單克隆抗體CD命名法、特性和一些商品來說在表Ⅰ中加以說明。
表Ⅰ分化基 抗體 特性(商品來源)bCD2(g p50)aT11(Coulter) E RossetteOKT11(Ortho); 受體Leusa(BD)CD4(gp 56) T4(Coulter)OKT4a(Ortho); 助劑/誘導體Leu 3a(BD)CD8(gp 32-33) T8(Coulter)OKT8(Ortho); 細胞毒素/抑制因子TLeu 2a(BD)CD20(gp35) B1(Coulter) 除淋巴液以外的所有Leu 16(BD) B細胞除骨髓病以外的B細胞腫瘤，某些非T ALL細胞。
d gp-糖蛋白，以干道爾頓計的分子量bCoulteR-Coulter公司的Coulter免疫部(Hialeah，Florida)
BD-Becton-Dickinson免疫系統orho-Orho診斷系統(Raritan，NewJersey)生物樣品(322)的細胞在進行定量和/或定性測定或分析時要卷入生物反應。樣品(322)可以包括緩沖劑，所述細胞就加在該緩沖劑中。
樣品(322)經通路(324)與經通路(328)來的至少一種反應物(326)相混合。在分析器(320)中，由在功能上被指定用于除去RBC和移動WBC子種群的部位(330)從該混合物中除去RBC，并且同時或順序地改變或移動至少一個WBC子種群的至少一個特性。如在第一個原申請中所述，用部位(330)從混合物中除去RBC可以采用許多方法，例如關于部位(20)列舉的。在相同的混合物部分同時或順序將至少一個WBC子種群鍵合到帶有專用于該子種群的單克隆抗體的WBC微球體上，以修改(改變或移動)該細胞的生成物濁度和/或體積參數。
而后，除去了RBC和移動了WBC子種群的混合物經通路(334)送到分析器(332)。分析器(332)可基本上與分析器(22)相同。通常將所研究的WBC子種群表示為所研究的WBC種群的百分比。因此，分析器(320)提供了一個WBC種群的一個選定的子種群的至少一個特征的一種快速的直接的分析。分析器(320)可以用于被移動的WBC子種群沒有被其他數目更多的細胞遮蔽的情況，或當被識別的WBC子種群的大量被移動了的細胞占有很大百分比，即使被遮蔽了也能識別的情況。
參照圖15，第二個原申請的WBC種群子種群分析方法和裝置的第二個實施例總的用參考數字(340)標出。分析器(340)包括含有至少第一組活的生物細胞(未示出)的生物樣品，該樣品包括至少一個具有至少一個子種群的一個白血細胞種群，如在全血樣中或從全血樣中取出的那樣。生物樣品(342)的細胞在進行定量和/或定性測定或分析時也要卷入生物反應。生物樣品(342)可以包括一種緩沖劑，所述細胞就加入該緩沖劑中。
樣品(342)經通路(344)與經通路(348)而來的至少一種反應物(346)相混合。在分析器(340)中，用具有去除RBC和移動WBC子種群功能的部位(350)將RBC從混合物中除去，并同時或順序地使至少一個WBC子種群的至少一個特征被改變和被移動。如前所述，可以有許多方法用部位(350)將RBC從混合物中除去，例如關于部位(20)所列舉的方法。此外，同時或順序地在同一混合物部分中將至少一個WBC子種群鍵合到微球體上以修改(改變或移動)這些細胞的生成物濁度和/或體積參數。
同時或順序地將至少一個WBC種群或子種群從該混合物中除去。由于除去了WBC種群或子種群，結果所研究的WBC子種群就不會被該種群所遮蔽。這最好是按以下方式來完成，這就是在WBC種群被鍵合到帶有專用于該WBC種群的單克隆抗體的磁性微球體上之后用磁力除去該WBC種群。
而后，將除去了RBC和WBC種群并移動了WBC子種群的混合物經通路(354)送到分析器(352)。分析器(352)也可以與分析器(22)基本相同。
實施第二個原申請并能完成第一和第二分析器(320)和(340)的分析方法的一個分析器裝置的實施例在圖16中總的用參考數字(360)標出。
在儀器(360)中，類似儀器(56)，只說明一種具體的枚舉，按第一個原申請的原理，可以在幾乎無窮多的細節上變化。此外，對儀器(360)的說明只是一般功能細節的，而許多具體的實施例可以按許多已知的方式結構上實現。
儀器(360)包括吸氣泵機構(362)，用來將所研究的生物樣品(如樣品(322)或(342))抽到儀器(360)中。吸氣泵(362)經通路(364)連接到與采樣探頭(368)相連的采樣閥(366)上。溶胞劑泵(370)可以包括溶胞劑，例如部分反應物(326)或(346)，經通路(372)也連到閥(366)上。在適當的時候，與經泵(370)與吸取溶胞劑一道，閥(366)和泵(362)，可以吸取生物樣品(322)或(342)。生物樣品(322)或(342)最好是與溶胞劑分開加入。
而后，反應混合物或生物樣品本身經排放通路(374)送入混合裝置(376)。混合器(376)包括混合室(378)，樣品和反應物就送入該室。分析(320)或(340)僅在操作上略有不同，今后將一起加以說明。
在操作時，如果RBC已經被來自泵(370)的溶胞劑溶胞，則在反應完成時由部位(380)經通路(382)供給猝滅劑或固定劑。于是除去RBC的反應就完成了。通過在室(378)內攪拌溶胞劑和樣品可以促進反應，如在(374)功能性說明。
無論是在除去RBC之前、之后或其同時，移動WBC，并且在使用分析器(340)的情況下，也可以除去一個WBC種群或其子種群。通過加入從部位(386)經通路(388)、閥(390)和室通路(392)來的專用WBC微球體，移動該WBC子種群。利用混合機構(384)使WBC微球體與該混合物或樣品混合。
合適的混合裝置(376)的具體細節與混合裝置(70)大體相同。通過使用混合器(376)，大大提高了這些反應的速度，而不會象提高反應溫度那樣出現明顯地損害細胞有關性質的情況。此外，反應一般在少于幾分鐘的時間內完成，一般是2分鐘或更短時間。這使自動化程度高的體積分析儀器(360)可以進行快速分析。
在分析器(320)中，用溶胞劑(例如來自部位(20))除去RBC的被猝滅的反應物和被修改了的WBC子種群而后就經通路(394)送到WBC分析器(396)(即分析器(322))。根據Wallace H.Coulter在美國專利2656508中所描述的和在Coulter電子公司所經銷的許多商品血細胞計數器中實施的計數和尺寸測量技術，分析器(396)可以有許多具體的類型。
如前所述，一般說來分析器(396)包括一個液流檢測器或檢測室(398)。室(398)包括一個具有一個通孔(402)的變換器(400)。室(398)包括一個具有與其中液流接觸的第一電極(406)的第一部分(404)。
該室的部分(404)和電極(406)通過孔(402)同其中具有第二電極(410)的該室的第二部分(408)連通。電極(406)和(410)通過饋線(412)和(414)與RF/DC源和檢測電路(416)耦合。電路(416)將直流(或低頻)電流或信號和在電極(406)和(410)之間高頻信號這兩部分耦合。
低頻信號被用來檢測由通過孔(402)的一個細胞所引起的一個信號脈沖的振幅。高頻信號用來獲取通過孔(402)的同一細胞的電濁度。
關于測量細胞電濁度，由Wallance H.Coylter和Walter R.Hoff在美國專利3502974和以后的一系列專利中以及自從該專利申請以來在由Coulter電子公司經銷的出版物中對此作了描述。一個在此可利用的具體的電路在美國專利申請921654中被公開，它被引作參考文獻。
由電路(416)從被檢測的細胞產生的信號經一DC信號導線(418)和RF信號導線(420)耦合到比較器(422)(類似比較器(26))上。
分析器(396)可以包括一個將細胞按眾所周知的方式聚集到檢測器(398)內的鞘流。鞘流由射流系統(424)提供，鞘流通過一對通路(426)和(428)以一種已知的方式連接到檢測器(398)上。樣品反應混合物可以經導入管(430)送到檢測器(398)，而通過排出管(432)從檢測器(398)排入廢水容器(434)。
每次操作后，混合器(378)都要由清洗通路(436)清理或沖洗并通過排廢通路(438)排凈。一旦室(378)清理完畢，另一個樣品或樣品部分就可以送入儀器(360)。
在分析器(340)中，工作情況與加有磁性白血細胞種群或子種群的微球體的分析器(320)相同。鍵合到那里的WBC子種群在混合過程中和/或混合后用磁場或磁鐵(440)除去。磁場可以用電磁部件或通過相對于室(378)作機械運動的磁鐵(440)產生，以磁性捕獲鍵合的WBC子種群。除去了鍵合的WBC子種群的混合物而后經通路(394)以與前面所述相同的方法送到分析器(396)，以獲得分析(類似分析器(320))。
然后，儀器(360)準備為下一次分析取下一個樣品。探頭(368)由探頭清洗機構(442)清洗，各通路和室(378)也可以由方便的方法沖洗干凈。接下去的樣品混合物的每次分析都是以自動方式快速進行。前后二個樣品混合物分析之間的時間間隔是5分鐘左右或更少。
如果不利用溶胞劑，無論是在分析器(320)或(340)中，樣品(322)或(342)可以經閥(366)送到混合器(376)而不帶任何溶胞劑。在這種情況下，RBC可以用帶有RBC專用抗體的微球體以磁力方式除去，所述微球體由RBC微球體部位(444)經通路(446)送到閥(390)，再由此經通路(392)送到室(376)。在不用溶胞劑的場合，鍵合RBC也是在混合后用磁鐵(440)利用磁力方式除去，所用方式大致與以上所述帶磁性的鍵合WBC的情況大致相同。
此外，在第二種情況下，為了增進反應的速度和效率，可以采用既帶有RBC溶胞劑，又帶有RBC磁性微球體的樣品的反應混合物。攪拌這種反應混合物，猝滅溶胞，并用磁力將鍵合RBC除去，然后分析WBC，如前所述。
現在參照圖17A和圖17B，以點散布圖的方式示出了用一個類似儀器(360)的典型分析器得出的兩組結果。除二個WBC種群，直接分析T8子種群。T8子種群是帶有與T8專用抗體鍵合的受體或抗原的細胞或形成體。在圖中，這些標為T+8。那些不帶與T8專用抗體的受體或抗原的細胞或形成體則標為T-8。在這些例子中，生物介質(342)是隨同混合器(376)使用的20微升全血樣。在圖17A和圖17B中，這20微升全血樣，即介質(342)，與40微升鍵合RBC專用抗體的磁性微球相混合，與120微升緩沖液和10微升帶有鍵合N和E專用抗體鍵合的磁性微球相混合后，與30微升緩沖液相混合，一起形成反應物(346)。一種這樣的典型的N和E專用抗體在申請號為U.S.068618、題為“Monoclonal Antibody Specific To A Common Determinent Site of Neutrophils And Eosinophils、申請日為1987年6月3日的申請中被公開，該申請在此收入并作參考。
磁性微球體可以是任何合適的類型，在這個例子中用的是印地安那州的Seradyn，Inc.of Indiahapolis出售的聚苯乙烯磁性微球體，直徑為0.7微米，具有重量相當于實心體10%體積的重量。反應混合物在混合器(376)內攪拌10秒鐘、在磁鐵(440)的磁場中放置15秒鐘，然后除去了RBC、E和N的最終混合物在分析器(396)中分析。在圖17A中給出了所得到的點散布圖。
加入12.5微升鍵合T8專用抗體的非磁性微球體，與12.5微升的緩沖劑溶液相混合組成反應物(346)，用同樣的程序得到圖17B的點散布圖。T8專用抗體是以Coulter Clone商標(注冊商標)由Coulter公司的Coulter免疫部經銷。非磁性微球體也可以是任意合適的類型，在這個例子中采用由俄勒同州的Interfacial Dynamics of Portland經銷的表面活性劑無硫酸鹽聚苯乙烯乳劑微球體，商品名稱為IDC微球體，直徑1.78微米，其重量相當于這樣的實心體8%體積的重量。
加入T8微球體將鍵合的CD8細胞移到區域B，在那里它們可以單獨地加以識別和計數，如同通過比較圖17A和圖17B所看到的那樣。在圖17A中，CD8細胞被其他的WBD細胞隱藏。從點散布圖上除去N和E，或它們將遮蔽在圖17B中的被移動了的CD8識別。圖17A給出了除去了N和E的情況，而圖17B則清楚地給出了鍵合CD8的細胞從區域A移到區域B的情況。緩沖劑溶液可以是密蘇里州圣路易斯的Sigma Chemical Company經銷的磷酸鹽緩沖液。
圖18A還示出了由分析器(352)得出的正常的點散布圖或M、L和G種群的三參數計數分布圖的位置分布。不除去G，則如圖17B所見，經移動的WBC子種群所在的區域B會被數目相當大的G細胞遮蔽。圖18B為說明在除去E和N后留下的WBC種群M，L和B的情況的點散布圖。雖然B還可能部分地遮蔽我們所關心的區域，但這些WBC種群的百分數很小，不會對所需要的子種群百分數的計算發生很大影響。而且，如果需要的，可以把B的影響從子種群百分比中扣除。
現在參照圖19A-D、20A-D和21A-D，說明從三個不同患者采集的相應的樣品的CD2，CD4，CD8和CD20WBC子種群所進行的直接子種群分析的情況。對每一種子種群，將28微升全血樣與20微升帶有N和E專用抗體鍵合的磁性微球體(重量溶液體積比為2.5%)混合。此外，帶有與各WBC子種群相對應的單克隆抗體的非磁性微球體也與該樣品混合。用T4′，T8′，T11和B1包覆的微球體各自的數量分別為40微升(每一種均為1%重量溶液體積比)。每一相應的總混合物，即帶有T8′的N和E微球，與磷酸鹽緩沖液及1%的牛血清白蛋白組成的pH值為7.2至7.4緩沖液混合，總量為150微升。各相應混合物在室(378)內用混合器(376)攪拌2分鐘，然后在磁場(440)內放置1分鐘。在這些例子中，RBC順序地用以上所提到的溶胞劑除去。首先加入WBC微球體，然后用來自溶胞劑源(370)的300微升溶胞劑(例如由Coylter Electronics公司經銷的紅細胞溶胞劑)除去RBC。然后，用來自源(380)的120微升猝滅劑(例如也是由Coulter Electronics公司經銷的穩定劑(Stabilyse一種白細胞保存劑)猝滅該混合物，再送入分析器(396)分析。
在各個散布圖中的右邊的方框(1)表示我們所關心的相應的WBC子種群。圖中所示的方框1，2，3等是形象化地或通過自動化方式圍繞著我們所關心的WBC種群子種群加上的。
將這些結果與利用常規的液流細胞計數法相比較，并給出用本發明的方法(SHIFT)和液流細胞計數法(CYT)相對比的以下三種樣品的百分數比較結果。
T4(圖19A) T8(圖19B) T11(圖19C) B1(圖19D)Shift CYT Shift CYT Shift CYT Shift CYT患者樣品1 51 52 18 22 82 76 15 13T4(圖20A) T8(圖20B) T11(圖20C) B1(圖20D)Shift CYT Shift CYT Shift CYT Shift CYT患者樣品2 53 54 32 29 89 83 6.5 7.5T4(圖21A) T8(圖21B) T11(圖21C) B1(圖21D)Shift CYT Shift CYT Shift CYT Shift CYT患者樣品3 46 46 24 18 86 81 11 10
圖22也示出了由分析器(352)得出的正常的點散布圖或M、L和G細胞種群的三參數的位置分布。不除去N和E，CD4細胞種群將被遮蔽。通過用帶有N和E專用單克隆抗體的微球體將N和E移到圖22B中所示出的一個區域或方框1，CD4種群就可以移動并在該方框里或區域2觀察。這個區域將要被N和E遮蔽，如在圖22A中所見。在圖22C這個例子中，28微升全血樣與50微升帶有N和E專用單克隆抗體鍵合的2.2微米的微球體和50微升帶有T4專用單克隆抗體鍵合的微球體以及22微升烯釋劑相混合。圖22B是除去不帶T4微球體以及用72微升稀釋劑外其余相同，而圖22A除不帶任何微球體和使用122微升稀釋劑外其余相同。
參照圖23A-D，可以看到采用多種鍵合到我們所關心的WBC子種群的微球體直接對WBC進行分析的情況。圖23A和圖23B分別給出了帶有每一種都用0.8微米非磁性小球移動了的T4WBC子種群和T11WBC子種群的僅有L種群的點散布圖。由于所述移動不充分，在圖23A和23B上不能區分該WBC子種群。圖23C和23D分別給出了帶有通過鍵合在0.8微米和2.2微米這兩種微球體上的方式移動了的T4WBC子種群和T11WBC子種群的僅有L種群的點散布圖。2.2微米微球體通過有Goat抗小鼠IgG抗體鍵合其上，被鍵合到0.8微米微球上，從而鍵合到T4或T11抗體鍵合的0.8微米的微球上。
在圖24A-C中給出了關于與我們所感興趣的WBC子種群鍵合的微球體的尺寸大小的影響。在這個例子中，28微升的全血樣與10微升鍵合有N和E專用抗體的磁性微球體(2.5%重量/溶液體積)以及40微升鍵合T8專用抗體的非磁性微球體(1%重量/溶液體積)相混合。T8微球體具有二種不同的直徑，以顯示在點散布圖上在移動中的差別。再加入緩沖溶液，形成體積為150微升的混合物，將該混合物攪拌2分鐘，并在磁場中放置1分鐘。然后再將除去反應產物N和E的混合物溶胞以除去RBC，而后加以分析。圖24A顯示了一個沒有附著在微球體上的對照WBC子種群、一個與2.2微米非磁性微球體鍵合的T8WBC子種群和一個與3.0微米非磁性微球體鍵合的T8WBC子種群。寬度和高度表示所檢測信號的標準偏差。圖24B是說明用鍵合3.0微米微球體移動的T8WBC子種群的點散布圖，而圖24C是說用鍵合2.2微米移動的T8WBC子種群的點散布圖。對于用不同微球體所獲得的分析的T8WBC子種群百分數分別是20.9和19.3。顯然，尺寸較大的微球體形成更為清晰的點散布圖形，如圖24B所示那樣。
現在參照圖25A-D，根據第二個原申請來說明對二個WBC子種群的同時的直接分析。在這個例子中，28微升全血樣與10微升鍵合有N和E專用抗體的磁性微球體、52微升緩沖溶液和40微升鍵合T8專用抗體的3.0微升的非磁性微球體相混合并攪拌2分鐘。然后將該混合物在磁場內放置1分鐘，而后將除去反應產物N和E的混合物溶胞以除去RBC，并且加以分析。圖25A顯示出一個其上沒有鍵合任何微球體的對照WBC子種群樣品、一個使用與2.2微米非磁性微球體的鍵合T4讀數和一個使用3.0微米非磁性微球體的鍵合T8讀數。這說明在二個被移動了的WBC子種群之間的分離。圖25B是只涉及與2.2微米微球體鍵合、被移到區域A的T4WBC子種群的散布圖分析，而圖25C是只涉及與3.0微米微球體鍵合、被移到區域B的T8WBC子種群的點散布圖分析。圖25D說明了一個涉及被移到相應的A區域和B區域的T4和T8二個WBC子種群的點散布圖分析。
現在參照圖26A-D，在利用不同參數得到的四個不同點散布圖上來說明L、M和G這三個種群。雖然前邊的例子是用DC對濁度(RF/DC)的關系來說明的，實際上點散布圖也可以利用任意二個不同的參數來形成。圖26A給出了一個利用DC對RF關系的點散布圖，圖26B利用了RF對濁度的關系，圖26C利用了DC-RF對濁度的關系，而圖26D利用了如前所述的DC對濁度的關系。此外，雖然已經用了DC對RF或RF/DC關系，但只要信號能夠彼此分開，那么任何兩個不同頻率的信號都是足夠的，因為它們的頻譜位置和/或相位關系不同。濁度是一個比較好的參數，因為它本質上是一個標準化的RF信號。顯然，如圖26A-D所示，數據的表示可以隨需要而變。DC是所要檢測的細胞或形成體的體積的函數，而RF是所要檢測的細胞或形成體的內部導電率和體積的函數。
現在參照圖27-46，說明申請號為339156的第三個原申請的實施例。
參照圖27，用于完成細胞，例如多部分組分的分類的分析方法和裝置的第一個實施例總的用參考數字(500)標示。該儀器或分析器(500)包括一個含有至少第一組活的生物細胞(未示出)的生物樣品(502)，這些細胞至少包括二種白血細胞種群，例如在全血樣中或從全血樣中取出的那樣。
生物樣品(502)的細胞在進行定量劃定性測定或分析時卷入一種生物反應。生物樣品(502)可以包括一種緩沖劑，所述細胞就加在緩沖劑中。
生物樣品(502)經通路(504)與經通路(508)而來的至少一種反應物(506)相混合。在分析器(500)中，在RBC去除部位(510)從該混合物中除去RBC。如在第一個原申請中所述，從部位(510)可以用許多方法除去RBC，例如關于部位(20)所列舉的那些。
除去RBC的混合物的第一部分后，經通路(514)被送到WBC分析器(512)。這樣就獲得了一個生物樣品(512)的總的或完全的WBC種群的標準或對照物。分析器(512)可以與分析器(86)相同，或者可以是一種光檢測分析器。如在申請號為025，442，申請日為1987年3月13日和申請號為129954、申請日為1987年12月4日、題為“Multi-Part Differential Analyzing Apparatus Utilizing Light scatter Techniques.”的二個美國專利申請中所描述，這些文獻在這里作為參考被收入。單檢測參數可以是電子的，例如RF或DC，或光的，例如中位角光散射(Scatter)或其他所需要的光參數。
該混合物的第二部分經通路(518)送到一個N去除部位(516)通過加入帶有N專用抗體鍵合的合適的磁性微球體的方式除去N。在這個例子中，所使用的具體的N專用抗體在判例168306中被公開，該判例題為Monoclonal Antibody Specific to neutrophils，申請日為1986年12月8日，目前的美國專利申請號為938864，該文件在這里被收入作為參考。如前面所討論過的那樣，用磁鐵或磁場從該混合物中除去鍵合的細胞。而后，除去N的剩余的混合物經通路(520)送到分析器(512)。然后將該混合物的這部分的分析結果在比較器(522)中與第一部分混合物相比較，得出在生物樣品(502)中N的百分比。
該混合物的第三部分經通路(526)送到N和E去除部位(524)。通過加入合適的帶有N和E專用抗體鍵合的磁性微球體除去N和E。一種典型的N和E專用抗體在申請號為068618、申請日為1987年6月3日，題為“Monoclonal Antibody Specific to A Common Determinant Site of Neutrophils and Eosinophils”的美國專利申請中被公開，該文件在這里被引用作為參考。分離開的N和E專用抗體，鍵合在相同的或分離的磁性微體上，也可以在適當的場合或研究時加以利用。于是，除去了N和E的其余的混合物的分析結果經線(528)送到比較器(522)。在比較器(522)中混合物這部分分析結果與第一和第二部分的分析結果相比較，以獲取在生物樣品(502)中的E和M的百分數。
該混合物的第四部分經通路(532)送到一個L和N去除部位(530)。通過加入帶有L和N專用抗體的鍵合的合適的磁性微球體除去L和N。所述N專用抗體可以是以上所提到過的N專用抗體或其他合適的抗體。所述L專用抗體可以是一種研制出的L專用抗體或是由Coulter公司的Coulter免疫部以T11和2H4的名稱出售的一些專用抗體的組合物，這種組合物將各種L專用抗體結合在一起。除去L和N的其余的混合物而后經通路(534)送到分析器(512)。而后可以將這一部分混合物的分析結果與其他混合物部分的結果相比較，以獲取生物樣品(502)中B和L的百分比。
這樣，分析器(500)完成了一種細胞的單獨分類，例如N利用線路或通道(514)和(518)，E和/或N和/或M利用了通路(514)，(518)和(526)，而一個完整的五部分WBC組成利用了全部四條通路。分析器(500)的一個最重要的特征就是這些混合物可以只利用一個單獨的分析參數，例如一個電子參數或一個光參數，來進行分析。其他組合也應用，但在每一種情況僅單檢測參數或特性對完成該原申請的這種分類是必要的。
圖28給出了一個結合的分析器(500)的方法和裝置的具體的分析儀器實施例，總的用參考數字(540)標記。儀器(540)包括一個吸氣泵機構(542)，該機構被用來將所感興趣的樣品，例如(502)，吸入到儀器(540)。吸氣泵(542)經通路(544)連到一個取樣閥(546)上，該閥又可以連到一個取樣探頭(548)上。而后，生物樣品(502)經通路(550)和一個多通閥(551)送入分離的通道(514)，(518)，(526)和(532)。
首先，樣品部分通過通道(514)，而后被送入室(552)。該室可能是一個混合室，樣品和反應物被送入該室以除去RBC。例如利用溶胞劑。通過在室(552)中加入適當的溶胞劑并最好在其中加以攪拌，使RBC在該室中溶胞，而后，當反應完成時，向室(552)中加入猝滅劑或固定劑。
在此可利用的合適的混合裝置的具體情況，在申請號為025，337、申請日為1987年3月13日，題目為“Method and apparatus for rapid mixing of small volumes for enhancing biological reactions”美國專利申請中被公開，該文件在此作為參考被引用。通過利用混合器，反應速度大大提高，而對細胞的有關性能并沒有明顯損害，例如通過提高反應溫度可能出現的那樣。此外，反應通常有效地在一分鐘之內完成，一般是15秒鐘或更短時間。這使得自動化程度高的體積分析儀(540)可以進行快速分析。
通過溶胞作用除去了RBC的猝滅反應物混合物，然后經通路(554)送到多通閥(556)，或直接經通路(560)送到分析器(558)。根據Wallace H.Coulter在美國專利2656508中所述的計數和估計技術分析器(558)可以具有許多種實際的類型，這種技術利用了光或電子檢測，如在Coulter電子公司經銷的大量商品血細胞計數器中所實施的那樣。
分析器(558)總的說來包括一個液流檢測器或檢測室(562)。室(562)包括一個帶有一個通孔的變換器(564)。室(562)可以包括一個帶有一個與其中的液流接觸的第一電極(568)的第一部分(566)。該室的部分(566)和電極(568)可以通過檢測孔與其中帶有第二電極(572)的該室的第二部分(570)相通。
電極(568)和(572)經饋線與RF/DC源和檢測電路(574)相連接。電路(574)與電極(568)和(572)之間的一直流或低頻電流或信號之一或兩者和高頻信號耦合。
低頻信號用檢測由通過檢測孔的細胞所產生的信號的振幅。高頻信號可以按照與一個單獨參數相同的方式來使用或與低頻信號一起使用以獲取通過該檢測孔的同一細胞的電濁度。
Wallace H.Coulter和Walter R.Hogg在美國專利3502974以及其他若干個專利中和這個專利之后Coulter電子公司所經銷的出版物中描述了有關細胞電濁度測量的情況。在這里可以采用的一個具體的電路在題為Particle Analyzer For Measuring the Resistance And Reactance of A Particle的判例中被公開，該案的申請日為1986年10月21日，美國專利申請號為921654，現在的美國專利號為4791355，該文件在此作為參考被引用。
由電路(574)根據被檢測的細胞產生的信號經DC信號引線(576)和/或RF信號引線(578)耦合到比較器(580)(類似于比較器(26))。比較器(580)可以保存由第一部分(即沒有減去WBC種群或種群子種群的那部分)產生的信號，以便同在這以后要敘述后面的部分所產生的結果相比較。分析器(558)可以包括一個鞘流，以便以眾所周知的方法將細胞聚集在檢測器(562)中。該鞘流可以由一個以公知的方法連接在檢測器上的射流系統(582)提供。
分析器(558)已經利用僅作舉例用的DC和RF兩者的分析電路進行過說明。在獲取該原申請的多部分的WBC種群或子種群特性的時候，只需利用一個單獨的檢測參數，電子學的或光學的。在電子檢測情況下，參數可以是DC或RF，在利用光檢測時，無需說明，也只需要利用一個單獨的參數，例如中位角光散射。這種一維檢測可以簡化儀器(540)，也使其成本降低。
該樣品混合物的第二部分經通路(518)通過閥(551)送到N去除部位(516)。部位(516)包括一個混合器或室(584)。該混合室(584)裝有經通路(518)被送入其中的混合物的第二部分。混合器(584)包括以上所述的所有各種選擇方案，例如，包括用于RBC溶胞的溶胞劑輸入通路。
當利用溶胞劑時，在進行了如在(586)所述功能的混合之后，將猝滅劑經一猝滅劑通路加入。同時或順序地通過加入合適的帶有N專用抗體鍵合的磁性微球體除去N，該微球體是從微球體源(588)經通路(590)送入室(584)的。然后磁鐵(592)或磁場被用來以磁力除去鍵合在該磁性微球體上的細胞。被混合并被猝滅的混合物而后經通路(520)通過閥(556)和通路(560)送到WBC分析器(558)以便進行如前所述的分析。而將被除去了N的混合物的分析結果在比較器(580)中進行比較以測定樣品(502)中的N的百分數。
樣品(502)的第三部分混合物經通路(550)和閥(551)，又經通路(526)送到N和E去除部位(524)。部位(524)包括一個混合室(594)。在第三部分中，借助送入室(594)中的RBC溶胞劑除去RBC。該溶胞劑同樣品部分混合，而后經猝滅劑通路加入猝滅劑。利用鍵合有N和E專用抗體或抗體簇的磁性微球體來除去N和E，該微球體是從微球體源(596)經通路(598)送入室(594)的。將微球體加以混合，如在(600)所述功能那樣，而后用磁力除去鍵合有N和E的微球體，如在(602)所述功能那樣，除去了N和E的混合物而后經通路(528)到閥(556)，又經通路(560)送到分析器(558)，以便也獲取以上所述結果。
用第一部分的二個通道(514)和(518)測定N的百分比，或用第一部分的三個通道(514)，(518)和(526)得出N和E的百分比和/或M的百分比，如所需要的那樣來使用該儀器。為了獲取WBC種群或子種群進一步的一些特性，樣品混合物(502)的第四部分經通路(550)和閥(551)又經通路(532)送到L和M去除部位(530)。此外，與在室(604)中使用溶胞作用一樣除去RBC，并且通過將L和N鍵合在L和N專用抗體或抗體簇鍵合磁性微球體上除去L和N，該微球體是從源(606)經通路(608)送入混合室(604)中。將這些微球體加以混合，這功能由(610)完成，而后用磁力除去鍵合L和N的微球體，這功能由(612)來完成。
除去L和N的混合物而后經通路(534)到閥(556)，再經通路(560)送到分析器(558)以獲取以上所述結果。利用由其他通道所得結果的結合，于是可以得出L和/或B的百分比，例如完成一種完全的五部分的WBC組分分析以得出N、E、M、L和B的百分比。該混合器包括合適的清洗通路和排廢通路，并且儀器(540)可以包括一個清洗頭(614)以便在吸取下一次分析樣品或樣品部分之前清洗該儀器(540)，此外，如果需要的話，樣品(502)可以由源(616)經通路(618)加以稀釋。
這里給出的只是一個綜合了分析器(500)的方法和裝置的具體硬件實施例，而類似在原申請中的許多實施例，分析儀器(540)可以按許多構形來實現。例如，分析器(540)可以包括一個單獨的通道，例如，通道(518)，并且這些混合物的部分每一個可以順序地通過部位(516)，以從每一部分中除去相應的一個WBC種群或種群簇，如前邊相應于那些單獨的通道所描述的那樣。
現在參照圖29A-D和圖30A-D，說明二組一維點散布圖多部分特性結果，這些結果是由一個全血樣得到的一利用了類似分析儀器(540)的典型的分析方法。在每一種情況下該生物樣品都是28微升全血樣，對于用于第一通道(514)的樣品部分與122微升緩沖液相混合。該樣品部分用300微升RBC優選溶胞劑溶胞，該溶胞劑是上面在通道(552)中所提到過的。該樣品部分溶胞4秒鐘，然后以120微升猝滅劑猝滅，而后在經通路(554)、閥(556)和通路(560)送入分析器(558)。在圖29和圖30中說明了利用一個一維電子檢測參數所得到的分析結果。DC被用來獲取圖29A-29D中的數據，RF被用來獲取圖30A-30D中的數據(用于比較)，兩者利用的是同一一樣品部分，并且在分析器(558)中同時進行測量。這產生了圖29A中二個可清晰地識別的數據峰(620)和(622)以及圖30A中的峰(624)和(626)。峰(620)和(626)表示該樣品中L和B的百分比。峰(622)和(626)表示N、E和M的百分數。顯然，在一維情況下，由于不能進一步控制，在同一數據峰中一些個別的百分數被競爭細胞所掩蓋。如在以上提到過的原申請中所述，這是不成問題的，至少對某些細胞來說，當它大于一個參數時，就被用來區分這些數據。
在第二個通道(518)中，28微升第二全血樣部分在室(584)中與40微升鍵合N專用抗體的磁性微球相混合，又與82微升緩沖溶液相混合。在除去N的混合物，經通路(520)、閥(556)和通路(560)送入分析器(558)之前，該樣品部分按照與在通道(514)中相同的方式攪拌60秒，進行溶胞然后猝滅，而后在磁場(592)中放置30秒。這樣得出圖29B中的兩個數據峰(628)和(630)以及圖30B中的二個數據峰(632)和(634)。峰(628)和(632)保持與峰(620)和(624)相同，盡管在樣品混合物部分中它們的百分比較大，而峰(630)和(634)表示除去了N的E和M的百分比。于是就可以將數據峰(630)和(634)同相應的數據峰(622)和(626)進行比較，以確定在全血樣中N的百分比。
接下去，或按任意的順序，其中包括基本上同時地將第三個28微升樣品部分送到第三個通道(526)，并在室(594)中同20微升鍵合有E和N專用抗體或抗體簇的磁性微球體相混合，并與102微升緩沖溶液中相混合。在除去N和E的混合物經通路(528)、閥(556)和通路(560)進入分析器(558)之前，該樣品部分以與在通道(514)中相同的方式攪拌30秒，進行溶胞猝滅，而后在磁場(602)中放置30秒。這也得出圖29C中的兩個數據峰(636)和(638)和圖30C中的二個數據峰(640)和(642)。峰(636)和(640)也與峰(620)和(624)是相同作用，而數據峰(638)和(642)表示在全血樣中M的百分比，如比較數據峰(622)和(626)。而后可以將數據峰(638)和(642)同數據峰(630)和(634)相比較，也是為了求出在全血樣中E的百分比。
第四個28微升樣品部分分送到第四個通道(532)，同70微升鍵合CD2專用抗體的磁性微球體和50微升鍵合CD45R專用抗體的磁性微球體在室(604)中相混合。將該樣品部分攪拌2分鐘，而后在磁場(612)中放置30秒鐘，然后將剩余的混合物經通路(646)移入保留室(644)中。移入保留室(644)目前看起來是一個必要的操作，因為所利用的專用抗體，如以上所提到的專業術語被稱為T11和2H4的以及N專用抗體，看起來當同時使用時與一種其他的抗體相互干擾。人們所不了解的是這是專用抗體的原因還是細胞本身性質的原因。一旦除去了鍵合有T11和2H4的細胞的混合物送入保留室(644)，于是室(604)就要用磁場加以處理，以除去帶有CD2和CD45R細胞簇的磁性微球體。
鍵合有N的磁性微球體于是就被隔離在室(604)中，該微球體可以由其他源提供，而不是由源(606)提供(未示出)。將40微升鍵合N專用抗體的磁性微球體保留在磁場(612)中，并將緩沖液排到廢液中，通過這樣的方式完成所述隔離。換句話講，該混合物可以加以調整，以便使緩沖液被用作混合物的一部分，或可以使用磁性微球體濃縮物而是無需用溶液。而后，在除去L和N的混合物經通路(534)、閥(556)和通路(560)送入分析器(558)之前，該樣品部分又由室(644)經通路(648)返回室(604)，同鍵合N專用抗體的磁性微球體相混合，進行溶胞而后猝滅，如在通道(514)中所述的那樣，而后大在磁場(612)中放置30秒。這樣就產生了圖29D中的兩個數據峰(650)和(652)以及圖30D中的兩個數據峰(654)和(656)。峰(650)和(654)只表示B，因為所有的L已被除去。因為L大約是正常全血樣的30%，這就將B增強成為非常明顯的數據峰(即數據量)，而B原來大約是該樣品的1%。因為N也被從峰(652)和(656)中除去，而它們原來大約是樣品60%，于是B進一步被增強，B現在大約是剩余的B、M和E細胞的10%。
通過用由兩個峰得出的總的數據去除數據峰(在峰上計得的細胞數)的方式計算數據峰的數目，完成實際的百分比計算，如下所述(例如利用圖29A-29D)1)M%-由通道(526)測定[(PK1(620))(PK1(636))]××PK2(638)＝M%
2)M+E%-由通道(518)測定[(PK1(620))(PK1(628))]××PK2(630)＝M+E%3)E%＝M+E%-M%4)N%＝(PK2(622))-M+E%5)B%-由通道(532)測定[(PK2(630))(PK2(652)××(PK1(650)＝B1%B1%××[(PK1(620)(PK1(628))]＝B%6)L%＝(PK1(620))-B%為說明在圖29和圖30中所示那些數據，由RF和DC數據得出的計算值列在表Ⅱ中。
表Ⅱ通道 DC RFPK1 PK2 PK1 PK2514 28.1 71.9 30.3 69.7518 74.4 25.6 74.1 25.9526 83.8 16.2 83.4 16.6532 10.9 90.1 10.0 90.0在N、L、M、E和B的百分比中表示的一個完整的五部分組分也是由DC和RF數據峰計算出的，并且為了進行檢驗將它與光檢測儀器的分析結果作比較，例如在美國專利申請025442中所述的那樣。
表Ⅲ5部分組成光 DC RFN 61.58 N 62.2 N 59.1L 28.50 L 26.9 L 29.1M 6.27 M 5.4 M 6.0M 3.10 E 4.3 E 4.6B 0.56 B 1.2 B 1.2現在參照圖31A-D和圖32A-D，說明第二個兩組一維點散布圖多部分表征特性結果，這是利用第二份全血樣獲得的，也利用了類似分析器裝置(540)的典型的分析方法。在每一種情況下，生物樣品也是28微升全血樣，這樣品是為每一通道制備的，如相應于圖29和31所述的那樣。該樣品部分在送往分析器(558)之前在室(552)中的第一通道(514)里進行溶胞，然后猝滅。圖31和32給出了利用一個一維電子檢測參數所得分析結果。利用DC得到圖31A-31D中的數據，利用RF得到圖32A-32D中的數據(用于比較)，利用的是同一樣品部分，是同時在分析器(558)中進行分析。這樣就得出圖31A中的二個清晰可識別的數據峰(658)和(660)以及圖32A中的峰(662)和(664)。峰(658)和(662)表示樣品中L和B的百分比。峰(660)和(664)表示N、E和M的百分比。此外，在一維情況下，如果不加以進一步的控制，那么個別的百分比就要在同一數據峰中被競爭細胞遮蓋住。
在第二通道(518)中，第二份全血樣品部分同鍵合N專用抗體的磁性微球體在室(584)中相混合、攪拌、溶胞和猝滅，而后在磁場(592)中放置，而后將除去N的混合物送到分析器(558)。這樣就得出圖31B中的二個數據峰(666)和(668)，以及圖32B中的二個數據峰(670)和(672)。峰(666)和(670)保持與峰(658)和(662)相同，盡管在樣品混合物中它們的百分比更大，而峰(668)和(672)表示除去N的E和M的百分比。數據峰(668)和(672)而后就可以同相應的數據峰(660)和(664)相比較，以確定在全血樣中N的百分比。
接下去，或按任意順序，其中包括基本上同時地將第三樣品部分送到第三通道(526)并同鍵合E和N專用抗體或抗體簇的磁性微球體在室(594)中相混合，繼而攪拌，溶胞和猝滅，而后磁場(602)中放置，最后將除去N和E的混合物送入分析器(558)。這樣也得出圖31C中的兩個數據峰(674)和(676)以及圖32C中的兩個數據峰(678)和(680)。峰(674)和(678)也與峰(658)和(662)相同，而數據峰(676)和(680)表示在全血樣中M的百分比，類似數據峰(660)和(664)。而后，便可將數據峰(676)和(680)與數據峰(668)和(672)比較，以便也求出在全血樣中E的百分比。
第四樣品部分送入第四通道(532)并與鍵合CD2專用抗體的磁性微球體以及鍵合CD45R專用抗體的磁性微球體在室(604)中相混合，繼而攪拌，而后在磁場(612)中放置，最后將剩余的樣品移入保留室(644)中。
而后，通過將鍵合N專用抗體的磁性微球體保留在磁場(612)中并除去緩沖液的方式就將鍵合N磁性微球體分離在室(604)中。該樣品部分在室604清洗后于是又回到室(604)(由室(644)經通路(648))，并同鍵合N專用抗體的磁性微球體相混合，溶胞，而后猝滅，再在磁場(612)中放置，最后，除去所有L和N的混合物被送到分析器(558)。這樣得出圖31D中的兩個數據峰(682)和(684)以及圖32D中的兩個數據峰(686)和(688)。峰(682)和(686)只表示B，因為所有的L已被除去以將B增強為非常明顯的數據峰(即數據數量)。由于N也從峰(684)和(688)以及也從剩余樣品部分中被除去，B就進一步被增強。
完成實際的百分比計算在下文中依然如前所述，利用了用由兩個峰得到的總數去除該數據峰(在峰上所計出的細胞數)所計算出的數據峰計數(利用圖31A-31D作例子)。
1.)M%-由通道(526)測得[(PK1(658))(PK1(674)]××PK2(676)＝M%2.)M+E%-由通道(518)測得[(PK1(658))(PK1(666)]××PK2(668)＝M+E%3.)E%＝M+E%-M%4.)N%＝(PK2(660))-M+E%5.)B%-由通道(532)測得[(PK2(668))(PK2(684))]××PK1(682)＝B1%B1%××[(PK1(658))(PK1(666))]＝B%6.)L%＝(PK1(656))
對于圖31和圖32中所示數據，由RF和DC數據得出的計算值列在表Ⅳ中。
表Ⅳ通道 DC RFPK1 PK2 PK1 PK2514 24.0 76.0 26.0 74.0518 63.3 36.7 62.6 37.4526 76.0 24.0 75.2 24.8532 10.6 89.4 9.7 90.3一個用N、L、M、E和B的百分數表示的完整的五部分的組分也是由DC和RF數據峰計算出的，為了檢驗，也與光檢測儀器作了比較，例如在美國專利申請025442中所述那樣。
表Ⅴ5部分組成光 DC RFN 60.37 N 62.1 N 58.5L 24.70 L 22.4 L 24.3M 8.62 M 7.6 M 8.6E 5.12 E 6.3 E 6.9B 1.18 B 1.6 B 1.7利用DC數據峰所得到的計算值列在下面
1.)M%＝ 24.0/76.0 ××24.0＝7.62.)M+E%＝ 24.0/63.3 ××36.7＝13.93.)E%＝(13.9)-(7.6)＝6.34.)N%＝(76.0)-(13.9)＝62.15.)B%＝ 36.7/89.4 ××10.6＝4.44.4×× 24.0/63.3 ＝1.66.)L%＝24.0-1.6＝22.4圖29-32中的數據峰利用一個單獨的電子檢測參數，DC或RF，來描述。不討論濁度，但如果需要的話，也可以使用，因為它是RF/DC，如前所述。單獨的光檢測參數也可以利用，例如中位角光散射(Scatter)，如圖33-36所示。
參照圖33，利用二個參數，即散射和電體積，M、L、N和E組細胞被清晰地方離開。在這一數據圖形中B被遮蔽。然而，在一維情況下，圖34中所示相同的點散布數據給出了遮蔽L的M或者相反，如在數據峰(690)中所見到的那樣。在數據峰(692)中給出了N和E，在數據峰(693)中給出了E，如圖33中那樣表示相同的數據。
解決在數據峰(690)中數據被遮蔽的問題的一個方法就是除去M。目前這將按一種脫機的或予先準備的模式完成，因為當使用CD14專用抗體時，例如由Coulter公司Coulter免疫部經銷的Mo2時，M被緩慢地除去。例如將400微升全血樣同200微升2%-0.5%鍵合CD14專用抗體的磁性微球體的溶液相混合。通過從其中除去流體而將該微球體保留在一個磁場中的辦法首先將該磁性微球體分離，而后加入樣品，輕輕地攪拌混合物，例如搖動大約30分鐘，而后在磁場中放置5分鐘，在這之后，將予先準備好的除去M的混合物在儀器(540)中進行分析，如前所述的那樣。在圖35中，為了進行比較，也以二維形式給出數據，在圖中可以清楚地看到的是同圖33比較，M已被貧化，增進了剩下的WBC種群數據。
圖36中給出了一維散射數據，也得出兩個數據峰(694)和(696)。峰(694)是除去M只留下L的數據峰(690)。峰(696)與數據峰(692)相同，而峰(697)與峰(693)相同，由于從樣品部分中除去了M，兩個峰(696)和(697)得到增進。盡管沒有特別加以說明，如在峰(694)中說明的那樣，除去M的樣品混合物現在可以進一步貧化，以完成L子種群分析，如將在下文中進一步要說明的那樣。
盡管給出了舉例用的利用四個分離通道的分析器(500)，但這僅增加了該原申請的分類方法的速度。該原申請也可以利用一個單通道實施，順序地處理生物樣品(502)的各個不同的部分。
圖37給出了一個增強小的或被遮蔽的分類種群的方法和裝置的分析器實施例，總的標記為參考數字(700)。這種方法和裝置可以用來測定諸如B或L的子種群一類的小種群。分析器(700)包括一生物樣品(702)，該樣品含有至少第一組活的細胞(未示出)，例如在全血樣中或從全血樣中取出的那樣，如果該分類屬于B細胞，那么樣品(702)將包括至少B細胞種群和至少一個其他的WBC種群，例L細胞。一般來說，樣品(702)將至少包括所有的WBC種群，然而，如前所述，其中的各種種群或子種群可以脫機或在予先制備的步驟被消除。如果該分類是WBC種群子種群，那么樣品(702)將包括至少一種具有至少一種可確定的子種群的WBC種群。
現在首先說明B細胞的分類，B細胞是總的WBC種群中的一個非常小的種群，一般數量大約小于1%。顯然，除去遮蔽B細胞的那些WBC種群將增進B細胞的分類和分析，由于這樣一來當其他WBC種群被除去時，B細胞就成為剩下的WBC種群中較大的和重要的部分。顯然，這種增進對所有小的或被遮蔽的感興趣的細胞種群來說是正確的。
在利用一個單獨的測量量或參數來分析B細胞種群時，如利用下文中將要敘述的圖38中所示的RF，在一個單峰(704)中B細胞被L細胞遮蔽。L細胞大約為全部WBC種群的30%，而B細胞甚至仍然只是大約L和B合起來的3%。因此，為了更明確地分析和對B細胞分類，L細胞要完全或基本上從樣品中除去。
樣品(702)經通路(706)同經通路(710)來的至少一種反應物(708)相混合。利用前面敘述過的一種方法在一個RBC去除部件(712)除去RBC。一旦RBC被除去，所得混合物的第一部分就經通路(714)送到分析器(716)。WBC分析器可以與以前所述的相同，或者是它們的有一些局部變化的機型。單獨的檢測參數可以是電子的，例如RF或DC，或是光的，例如散射或任意其他的所要的光參數。
該混合物的第二部分經通路(718)送到L去除部位(720)，在這里L細胞被鍵合在磁性微球體上，該微球體包括鍵合在上面的L專用抗體或抗體簇。至少帶有剩余的B細胞的混合物的剩余物經通路(722)被送到WBC分析器(716)。兩個被分析部分的經果經線路(726)送入比較器(724)，在那里將二個分析結果加以比較以求出在樣品(702)中B細胞的百分比。B細胞按這種方法已經由該樣品混合物中的大約1-3%變為在第一數據峰(704)中的大致100%，這就給出了明確的分析結果和特性。按照一種類似的方法，當CD或所選擇的其他WBC種群組很少時，可以除去剩余的L細胞的全部或一部分，以增進所感興趣的其余CD族的分析。
其次，我們說明一種或多種WBC種群子種群，例如CD2、CD4或CD8WBC種群子種群的分析或分類。樣品(702)也將包括至少第一組活的生物細胞(未示出)，例如在全血樣中或從全血樣中取出的那樣。樣品(702)將包括至少一種所感興趣的WBC種群子種群和至少一種其他的有遮蔽作用的WBC種群或種群子種群，而通常將包括所有的WBC種群。
樣品(702)也被送入RBC去除部位(712)，而后將第一部分經通路(714)送入WBC分析器(716)。第二部分例如被用來測定CD2族，因此第二部分與包括鍵合CD2專用抗體的磁性微球體相混合，所述抗體例如Coulter電子公司Coulter免疫部經銷的T11。該混合的其余部分，現已除去CD2細胞，將經通路(722)送到WBC分析器(716)。然后，將二個分析結果在比較器(724)中進行比較以給出CD2組細胞的所要求的特性。
利用所要的各個通道或在另外多道儀器上的通道或在一個按順序操作的單通儀器上的通道在儀器(540)可以完成分析器(700)的操作。
現在參照圖38A-38E，如在一維點散布圖特性結果所示，利用類似于分析儀器(540)的典型的分析方法，來測定CD4，CD8和CD2子種群。在每種情況下生物樣品都是28微升全血樣品。將這個樣品與在通道(714)中用作對照樣品的122微升緩沖液混合(這可以是在儀器(540)中通道(514))。利用一維電檢測參數(在此為RF)的結果而得到圖38A-E的數據。這份樣品部分與上述提及的RBC優選溶胞劑300微升溶胞4秒(例如在室(552)中)，再用120微升猝滅劑猝滅，然后送分析器(716)(例如分析器(558)中)，其分析結果為圖38A中兩個明顯可識別的數據峰(704)和(728)，其中數據峰(704)包括B和L以及其所有子種群，它作為一個單峰。B的百分含量足夠地小，以致它不能影響所要分析的L子種群的結果，但是，若需要B的值可以扣除。
通過把第二份28微升的全血樣品與50微升上面沒有鍵合任何L或L子種群專用抗體的磁性微球和72微升緩沖液混合作為第二對照樣品。該樣品按前述方法溶胞和猝滅后送到分析器(716)中，得到在圖38B中的兩個數據峰(730)和(732)，數據峰(730)和(732)與數據峰(704)和(728)基本相同，因此，包含微球沒有對分析結果產生任何有害的影響。
將第3份28微升樣品送到通道(718)(也可以是儀器(540)中通道(518)、(526)和(532)中任何一個)中，并同50微升鍵合CD4專用抗體的磁性微球以及72微升緩沖液混合，CD4專用抗體可以是coulter公司Coulter Immunology Division出售的T4。將該樣品如前所述的那樣，攪拌60秒，溶胞和猝滅后放在一個磁場中30秒，然后將除去CD4子種群的該混合物送到分析器(716)中，從而得到圖38C中兩個數據峰(734)和(736)，峰(734)代表不含CD4子種群的L，然后用比較器(724)與峰(704)相比較，得到在該樣品中CD4子種群的百分含量。
為了檢驗和估價，再將相同血液樣按上述方法分析，而得到數峰的四組數據，其中之一組在圖38A-E中繪制。由于在每一組中這些數據峰是基本上相同的，所以用單獨一組數據就可以了。在四組數據上平均這些數據就得到結果。所得到的平均CD4子種群百分含量是45.7，為了驗證，把這個值同一光檢測儀器，例如從Coulter Corporation可購得的EPICS e細流量細胞計數器的測量結果相比較，該計數器給出百分含量為47.6。
將第四份28微升樣品送到通道(718)，與50微升上面鍵合有CD8專用抗體的磁性微球以及72微升緩沖液相混合，CD8專門抗體可以是Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T8，再如前述將該樣品攪拌，溶胞和猝滅，并放到磁場中，除去CD8子種群的該混合物送到分析器716，得到在圖38D中兩個數據峰(738)和(740)，數據峰(738)代表沒有CD8子種群的L，然后用比較器(724)與峰(704)比較，得到在樣品中CD8子種群的百分含量，所得到的平均的CD8子種群百分含量是25.0，為了驗證，把這個值與光檢測儀器給出百分含量26.0相比較。
將第五份28微升樣品送到通道(718)與CD2專用抗體鍵合的50微升磁性微球以及72微升緩沖液相混合，該CD2專用抗體可以是Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T11，該樣品按前述方法經攪拌、溶胞和猝滅然后放在一磁場中，然后將除去CD2子種群的混合物送到分析器(716)，得到在圖38E中兩個數據峰(742)和(744)，數據峰(742)代表沒有CD2子種群的L，然后把它用比較器(724)與峰(704)比較，從而得到在該樣品中CD2子種群的百分含量，所得CD2子種群的平均百分含量是82.7，并將它與光檢測流量細胞計數儀器給出百分含量79.0相比較。
在圖39A-E和40A-E中給出了用CD4、CD8和CD2子種群的一維電檢測參數其他子種群分析的結果，DC用于得到在圖39A-E的數據，而RF用于得到在圖40A-E中的數據，用同樣品部分并同時測定。
按照關于在圖38A-E所述的基本相同的方式，將該樣品溶胞和猝滅后送到分析器(716)，在圖39A和40A的情況，僅加入緩沖液，而在圖39B和40B情況，緩沖液以及未鍵合L和L子種群專用抗體的磁性微球與該樣品混合。無微球的對照得到圖39A中數據峰(746)和(748)以及圖40A的數據峰(750)和(752)。峰(746)和(750)代表在該樣品中L和B。帶對照微球的對照樣品與該樣品混合，但用磁場從中除去微球，得到在圖39B中的數據峰(754)和(756)，以及在圖40B中的數據峰(758)和(760)。
第三份全血樣品與其上鍵合有CD4專用抗體的磁性微球50微升混合，該混合經攪拌、溶胞、猝滅并放在磁場中，以除去該樣品混合物的CD4子種群，此后，該樣品混合物送到分析器(716)。DC分析得到在圖39C中兩個數據峰(762)和(764)，而RF分析得到在圖40C中兩個數據峰(766)和(768)。與比較數據峰(750)和(766)同時比較數據峰(746)和(762)，以得到CD4子種群在該樣品中的百分比。
在圖39和40中，數據峰是來自同一全血樣品三個分離樣品組中的一組，平均這些得到這個結果。在CD4的情況，由CD得到的百分比為57.0，RF得到的百分比為57.1，而光檢測流量細胞計數器儀器得到的百分比為54.6。
為了獲得CD8子種群的分析，第四份全血樣品部分與其上鍵合有CD8子種群的專用抗體的磁性微球50微升混合，把該樣品部分攪拌，溶胞、猝滅，并放在一磁場中，以便從該混合物中除去CD8子種群，然后將該混合物送到分析器(716)中，DC分析得到圖39D中兩個數據峰(770)和(772)，而RF分析得到圖40D中兩個數據峰(774)和(776)。
與比較數據數(750)和(774)的同時比較(746)和(770)，以得到在該樣品中CD8子種群的百分比，在CD8的情況，由DC得到的百分比為17.4，由RF得到的百分比為18.6，由光檢測流動細胞計儀器得到的百分比為17.7。
為了進行CD2子種群分析，第五份全血樣品與其上鍵合有CD2專用抗體的磁性微球50微升相混合，該樣品經攪拌、溶胞、猝滅，并放在一磁場中，以除去該混合物中CD2子種群，然后將該混合物送到分析器(716)中，DC分析得到在圖39E中的兩個數據峰(778)和(780)，而RF分析得到在圖40E中的兩個數據峰(782)和(784)。
與比較數據峰(750)和(782)的同時比較數據峰(746)和(778)，以得到在該樣品中CD2子種群的百分比，在CO2的情況，由DC得到的百分比為79.6，由RF得到百分比為79.3，由光檢測流動細胞計數儀器得到百分比為74.7。
利用一維電檢測參數，參照關于得到圖37-40的方法分析B和L子種群。也可使用一光檢測參數，以及兩個或多個檢測參數，例如在圖41A-E中所述。
這些樣品按在圖38-40中獲得數據所使用的同樣方式處理。圖41A和圖41B分別說明沒有微球的對照和與磁性微球混合并在分析前除去微球的對照的結果。這些對照說明正常三部分直方圖，圖示L、M、以及G種群。
在圖41C中圖示CD4貧化，在CD4子種群磁性貧化后，留下L種群可以與對照的L種群比較，以確定CD4子種群百分比。測得CD4子種群百分比是59.4，然后它與光檢測流動細胞計數儀器測得的百分比54.6比較。
圖41D圖示CD8貧化，在CD8子種群磁性貧化后，留下L種群可與對照L種群比較，從確定CD8子種群百分比。所測定的CD8子種群百分比是15.8，然后，將它與光檢測流動細胞計數儀器測定的百分比17.7比較。
圖41E中圖解說明CD2貧化，在CD2子種群磁性貧化以后，剩余的L種群可與對照L種群比較，以確定CD2子種群百分比。所測定的CD2子種群百分比是82.2，然后，將它與光檢測流動細胞計數儀器測定百分比74.7比較。
由上述分析可清楚地看到這些子種群重疊的數量，因為各個L子種群和大于100。在這里用重疊以說明某些細胞、細胞種群，細胞子種群或形成體包括至少兩個有關的受體或抗原。在診斷和治療中重疊可能是一個重要的參數，并將在以后進一步討論。
上面所提到的所有數據，為什么被稱做“正常”全血樣品，在這里用“正常”以說明全血樣品實質上沒有被例如癌或其它疾病感染。
圖42和43圖示了兩個異常的全血樣品分析結果，圖42A-G中用幾種不同方式分析和顯示第一個樣品的結果，圖42A和B描述該全血樣品兩個不同的兩維檢測直方圖，其中一用光檢測而另一個僅以電檢測，這個血樣沒有經過任何處理。顯然，正常血樣L、M和G組，例如在圖41A所示，被全部遮蔽住，并正好存在一個不能識別的數據組。
在圖42C和42D中示出所述異常全血樣品的兩個不同處理的結果。在圖42C中，該樣品200微升與鍵合N和E專用抗體的磁性微球200微升相混合，該混合經攪拌、溶胞、猝滅，并放置在一磁場中，把去除后的剩余部分送到分析器中，在其中沒有N和E鍵合的細胞。顯然，該異常細胞的實質部被除去了，因為圖42C中圖形比圖42B中的圖形變得更確定。
在第二種處理中，該樣品的200微升與僅鍵合有N專用抗體的磁性微球200微升相混合，雖然這些細胞的一些被除去，表明這些細胞鍵合到N抗體上，該異常細胞的重要部分仍保留，尤其如在所述直方圖頂部看到的。因此，這好象是所述異常或患病細胞的某些細胞鍵合到N+E抗體上。這種貧化處理類型可用于診斷和治療特殊的疾病。
利用兩維檢測可將圖42A-D的數據直方圖擴展。利用單一檢測參數也可以擴展同樣的信息，例如，象在圖42E-42G中描繪的單一電檢測參數，這個一維檢測(在此是DC)產生在圖42E中所示的直方圖，該被分析樣品沒有任何處理。該單個數據峰和直方圖最右側的數據清楚指出一個異常樣品。
事實上，采用如上述圖42C和42D所使用的同樣處理，可以同時如產生的二維檢測數據那樣產生一維檢測數據。如上所述，該分析儀器可包括多個檢測參數或僅有單一檢測參數。除去N和E鍵合細胞又在圖42F產生一個直方圖，這再次說明異常細胞的絕大部被除去了。圖42G中直方圖再次說明沒有被除去的異常細胞的一重要數量。
在圖43A-G中給出了分析第二個異常全血樣品的結果，在圖43A和43B中示出分析未處理的該樣品結果兩維直方圖。顯然，沒有看到正常全血樣品數據圖形。在這個儀器上繪制的圖43B的直方圖可與脫機繪制的圖43C直方圖比較，它們沒有表現出有意義的差別。一份28微升樣品被脫機制備或在繪制圖43C的分析結果之前預先制備。
在圖43D給出了CD5子種群貧化的樣品，然后分析得到的直方圖。28微升全血樣品與122微升鍵合有CD5專用抗體的磁性微球混合，例如由Coulter Immunology Division of Coulter Corporation出售的T1。該混合物經攪拌、溶胞、猝滅并放在一磁場中以除去CD5鍵合的細胞，把圖43B或圖43C與圖43D比較可以看到異常細胞的重要部分明顯地被除去了。用兩維檢測繪制圖43A-D的直方圖。而在圖43E-G描述了同樣數的一維直方圖。
此外，在圖43E示出未處理在線樣品完成結果，圖43F示出在脫機樣品上的結果，以及在圖43G中示出由該樣品CD5子種群貧化后的結果。
正如上述討論的那樣，細胞的重疊種群可能對血液疾病的診斷以及治療是重要的，例如，某些未發育完全的細胞表示CD4和CD8二種受體。當利用電檢測參數或最小數目的光參數或簡單的結合它們時，細胞子種群重疊百分比的分析結果的獲得是不適用的。例如，在一些光檢測儀器中，利用三檢測參數，獲得重疊數據，三參數是正方向和90°光散射兩者以及熒光。在一個正常全血樣品中重疊種群的一個例子是CD2和CD8子種群，在CLL(慢性淋巴白血液)中發現了種群異常重疊。在CLL疾病的情況，CD5和CD8種群重疊。
參見圖44，用于完成細胞重疊分類的方法和裝置的第一個實施例一般用(800)來標記，儀器或分析器(800)包括一生物樣品(802)，該樣品包含至少第一組活的生物細胞(未示出)，包括至少兩個重疊白血細胞種群或子種群，例如在或從一全血樣品得到的樣品。
在定量和/或定性測定或分析中，生物樣品(802)的細胞卷入生物反應，生物樣品(802)可能包括一緩沖液，細胞加到該緩沖液中。
生物樣品(802)經過通路(804)與至少一個經過通路(808)的一反應物(806)混合，在分析器(800)中在-RBC除去部位(810)從該混合物中除去RBC，如在第一原申請中所述，從部位(810)除去RBC有多種途徑，例如關于部位(20)所枚舉的。
除去RBC后的該混合物的第一部分經通路(814)送到WBC分析器(812)，這就獲得一個用于生物樣品(802)總的或全部WBC種群的標樣或對照樣品。分析器(812)可能是與分析器(86)相同，也可能是一光檢測分析器，如在美國專利申請號025442，申請日1987.3.13和美國專利申請號129954，申請日1987.12.4，題目Multi-Part Differential Analyzing Apparatus Utilizing Light Scatter Technioues的文獻中所描述的，這兩個文獻作為本申請的參考文獻。單一的檢測參數可以是電的，例RF或DC或光的，如中位角光散射(Scatter)或任何所希望的光參數。
該混合物的第二部分經通路(818)送到一“X”除去部位(816)，部位(816)除去第一重疊種群細胞“X”，通過加入鍵合X專用抗體的合適磁性微球來除去或貧化X細胞。如前所述，利用一磁鐵或一磁場，從該混合物中磁性除去鍵合細胞。除去X細胞后剩余的混合物經通路(820)送到分析器(812)。除去X部分的混合物的分析結果然后在比較器(822)中與第一混合物部分的分析結果比較，從而得到在生物樣品(802)中X細胞的百分比。
該混合物的第三部分經通路(826)送到第二除去部位(824)，部位(824)除去第二重疊種群細胞“Y”，通過加入合適的鍵合Y專用抗體的磁性微球除去Y細胞，除去Y細胞剩余的混合物經通路(828)送到分析器(812)，然后把該混合物除去“Y”后部分的分析結果與第一、第二混合物部分的分析結果在比較器(822)中比較，以檢驗在生物樣品(802)中是否有X和Y種群的重疊。這個方法證明X和Y種群重疊，僅要實際知道X和Y種群或種群比，或若X和Y貧化的種群的總和大于100%。
在大多數情況，該混合物的第四部分經通路(832)送到除去部位(830)，部位(830)除去X和Y種群(X+Y)。通過加入合適的鍵合有X和Y專用抗體的磁性微球除去X和Y，除去X和Y的剩余的混合物然后經通路(834)送到分析器(812)，然后把除去“X”+“Y”的混合物部分的分析結果與其他部分的結果比較，從而得到在生物樣品中X和Y種群重疊的百分比。
這樣，分析器(800)利用通路或通道(814)(818)或(826)可完成細胞單重疊的分類，而利用所有四通路可完成完全的重疊分類。分析器(800)的一個最重要的特征是僅利用單一分析參數，例如一電參數或一光參數可以分析這些混合物。可以利用其他結合，但在每種情況，僅單一檢測參數或特性對完成原申請的重疊分類是必須的。這樣的分析也可能用多檢測參數獲得。
雖然結合分析器(800)的方法和裝置的具體的分析儀器實施例沒有舉例說明，但是，一個這樣的儀器可以是儀器(540)。再次，重疊方法和裝置可以僅在儀器(540)的單一通道上實踐，或在一單通道儀器上實踐，沒有舉例說明。
現在，參照圖45A-45D，圖示了一組一維點散布重疊特性結果，這是利用類似于分析儀器(540)的一典型的分析方法以及關于儀器(800)的描述從全血樣得到的。在每種情況生物樣品都是28微升全血樣品，在第一通道(814)與所使用的122微升緩沖液混合，該樣品部分用上述提及的RBC優選溶胞劑300微升溶胞4秒，然后用120微升猝滅劑猝滅，然后送到分析器(812)中。
在圖45A的直方圖中示出了用一維電檢測參數(這里是DC)分析這部分的數據結果，這些數據得到兩個清晰可辨的數據峰(836)和(838)，如前所述，峰(836)表示在樣品中L和B的百分比，而峰(838)表示N、E和M的百分比。
參照上述方法，對該樣品中的X和Y細胞種群先后進行貧化處理，在這種情況，X種群是L種群的CD2子種群，而Y種群是L種群的CD20子種群。該樣品的第二部分送到部位(816)，在那里，用60微升鍵合有CD2專用抗體的磁性微球與該樣品部分混合，攪拌、溶胞、猝滅，然后放在一磁場中，以除去CD2子種群，此后留下的混合物送到分析器(812)，得到圖45B中的兩個數據峰(840)和(842)。峰(840)是剩余的L種群，然在比較器(822)中將它與峰(836)比較，從而得到在該樣品中CD2子種群的百分比。
該樣品的第三部分送到部位(824)，在那里50微升鍵合有CD20專用抗體的磁性微球與該樣品混合，攪拌、溶胞、猝滅，然后放在一磁場中，以除去CD20子種群。除去CD20剩余的混合物然后送到分析器(812)中，得到在圖45C中的兩個數據峰(844)和(846)，峰(844)是剩余的L，然后把它與峰(836)比較，從而獲得在該樣品中CD20子種群的百分比。
如果CD2和CD20子種群的正常的有關百分比是已知的，那么這對確定這些子種群是重疊的可能是充分的。還有，如果兩個子種群百分比的和大于總的100%，顯然，這也指出這兩個子種群重疊。在小重疊百分比情況，獲得重疊子種群的百分比，以確證這些子種群重疊是重要的。為獲得這一重疊百分比進一步貧化是必須的。
該樣品的第四部分送到部位(830)，在其中鍵合有CD2專用抗體的磁性微球和鍵合有CD20專用抗體的磁性微球被混合，以除去CD2和CD20子種群。剩余的CD2和CD20貧化的混合物送到分析器(812)，得到圖45D中的兩個數據峰(848)和(850)，峰(848)仍然是剩余的L，把它與峰(836)比較，得到用CD20和CD2專用抗體除去子種群的百分比。然后，把這結果與單獨的CD2和CD20的結果比較，如果有的話，獲得重疊百分比。
計算確切的重疊百分比，如下Ⅰ.子種群“A”(CD2)a. (數據峰(838))/(數據峰(842)) ××[數據峰(840)]＝A′b. (數據峰(836)-A′)/(數據峰(836)) ＝子種群A(CD2)的百分比Ⅱ.子種群“B”(CD20)
a. (數據峰(838))/(數據峰(846)) ××數據峰(844)＝B′b. (數據峰(836)-B′)/(數據峰(836)) ＝子種群B(CD20)的百分比Ⅲ.子種群“A+B”(CD2+CD20)(數據峰(838))/(數據峰(850)) ××數據峰(848)＝A′+B′(數據峰(836)-(A′+B′))/(數據峰(836)) ＝子種群A+B的百分比Ⅳ.重疊部分[子種群“A”+子種群“B”]-子種群“A+B”＝重疊在表Ⅵ中示出這些結果(從兩個分別配制結果取平均)表Ⅵ峰 相對百分比 峰 相對百分比對照 836 35.7 838 64.3CD2840 7.1 842 92.9CD20844 33.6 846 66.4CD2+CD20848 3.5 850 96.5
在表Ⅵ中的相對百分比是總百分比100的兩個峰的百分比。計算的CD2的百分比為86.2，CD20是8.9而CD2+CD20是93.5，因此，重疊百分比是(CD2+CD20)-(CD2+CD20)＝(86.2+8.9)-93.5＝1.6。
貧化第二樣品，得到在圖46A-D中示出CD2和CD8子種群的百分比重疊。而且，該樣品的第一部分沒有貧化送到通道(814)，得到圖46A所示的對照數據，這個數據得到明顯可辨的數據峰(852)(854)。而且峰(852)指出在該樣品中L和B的百分比。
如前所述在通道(818)中對第二樣品部分進行CD2貧化處理，得到在圖46B中兩個數據峰(856)和(858)，剩余的L峰(856)再與對照峰(852)比較，得到在該樣品中CD2子種群的百分比。
在通道(826)中，對第三樣品部分進行CD8子種群貧化處理，得到在圖46C中兩個數據峰(860)和(862)。峰(860)與對照峰(852)比較，得到在該樣品中CD8子種群的百分比。
在通道(832)中，對第四樣品部分進行CD2+CD8子種群的貧化處理，得到在圖46D中的兩個數據峰(864)和(866)。峰(864)與對照峰(852)比較得到在該樣品中CD2+CD8子種群的百分比。
這些結果在表Ⅶ中給出如下
表Ⅶ峰 相對百分比 峰 相對百分比對照 852 30.3 854 69.7CD2856 9.0 858 91.0CD8860 22.1 862 77.9CD2+CD8864 7.6 866 92.4計算CD2的百分比為77.3，CD8為34.7，CD2+CD8為81.1，因此，重疊百分比是(77.3+34.7)-81.1＝30.9。
現在參照圖46-60，示出了本發明的實施例。
參見圖47，一個用于完成遮蔽或部分遮蔽細胞(具體地，為舉例目的，這些細胞形成所研究的一白血細胞種群的子種群)分類的方法和裝置的第一實施例總的用(900)來標記。儀器或分析器(900)包括一生物樣品(902)，它包含至少第一組活的生物細胞(未示出)，包括至少兩個白血細胞種群，如象在或來自一全血樣品，至少這些白血細胞種群之一包括一所研究的白血細胞種群的子種群，其檢測特性由該白血細胞種群所遮蔽。這個檢測特性通過具有專用的單克隆抗體的微球鍵合到該白血細胞種群的子種群被移動，但是，這種移動的檢測特性將被第二個白血細胞種群遮蔽或部分遮蔽。
在定量和/或定性測定或分析中，生物樣品(902)的細胞卷入生物反應，生物樣品(902)也包括一緩沖液，生物細胞加入到該緩沖液中。生物樣品(902)經通路(904)與至少一個經通路(908)的反應物(906)混合。在分析器(900)中，在RBC除去部位(910)從該混合物中除去RBC。
如在第一個原申請中所述，從部位(910)除去RBC有多種途徑，如關于部位(20)所列舉的，利用溶胞和/或微球。
除去RBC后的混合物的第一部分經通路(914)送到一白血細胞分析器(912)。從而得到一用于分析所研究的一遮蔽白血細胞子種群的生物樣品(902)的白血細胞種群的標樣或對照樣品。該標準種群可以是白血細胞種群總量的一部分;可以是沒有遮蔽所研究子種群的移動或未移動檢測特性的第二白血細胞種群;可以是微球組成的人造種群，它也沒有遮蔽所研究子種群的移動或未移動的檢測特性或一白血細胞種群，進入其中，該子種群的檢測特性將全部或部分移動。這種人造種群可由微球組成，該微球沒有抗體或細胞鍵合其上，并形成一檢測特性，它不遮蔽第一白血細胞種群或所研究的白血細胞子種群的移動的特性。分析器(912)可以是和分析器(86)相同，分析(912)利用兩個電檢測參數，如RF或DC。
在所檢測的白血細胞種群的之一中，所研究的白血細胞種群的子種群被遮蔽。該混合物的第二部分經通路(918)送到一白血細胞種群的子種群移動部位(916)。該白血細胞種群的子種群鍵合到白血細胞微球上，該微球具有鍵合其上的專用于該子種群的單克隆抗體，以改進(改變或移動)生成物濁度和/或這些細胞的體積參數。
帶有移動的白血細胞種群的子種群的混合物然后經通路(920)送到分析器(912)。通常所研究的白血細胞種群的子種群涉及所研究的該白血細胞種群的百分比，在比較器(922)中，白血細胞分析器(912)由原始的或未移動細胞混合物的那些結果被比較，從而得到該白血細胞種群的百分比。
儀器(900)可能基本上與儀器(540)相同，僅利用通路(514)和(518)，而沒有磁場(592)。儀器(900)也可以是一個時序型儀器，如儀器(56)，在其中，同樣的樣品部分被計數，然后移動，重新計數并比較。
參見圖48A，示出了一感性或理想的點散布圖，它表示一個通常的至少兩個細胞或形成體的組或種群(926)和(928)的檢測特性的點散布圖。種群(926)包括子種群，細胞(927)被種群(926)遮蔽或掩蔽種群或子種群，細胞(927)被種群或(926)遮蔽或掩蔽，并且不可能將它們區分開鑒定。具有反應試劑鍵合其上的微球與此混合，反應試劑是專用于或檢測在種群(927)白細胞上的特殊分子的，但是，與反應劑微球鍵合或鍵合到反應劑微球上的(927)細胞檢測特性由一種群(928)將從(926)種群移位并全部或部分遮蔽，形成如圖48B所示的種群(927′)。為了說明和舉例目的，用WBC，種群(924)是M′種群(926)是L，種群(927)和(927′)是L子種群，而種群(928)是G。作為舉例，這些點散布圖的結果示作離散區域，雖然區域(924)，(926)和(928)實際上是各個檢測數據點的大多數。而且，用RF和濁度來描述點散布圖，當然其他參數和DC或其他組合也被應用，和通常在圖26A-D和圖57-60所示。除了數據組(924)，(926)和(928)之外，還示出第四個人造種群(930)，例如一個沒有細胞或抗體鍵合其上的微球種群，它也可用于本發明。
在本發明中，標準或對照種群包括檢測或計數至少L種群(926)和其他組的各種組合，以確定所研究的白血細胞子種群，在這些例子中它們是L子種群，如CD4或CD8。得到標準種群，因為所研究的L子種群的檢測特性被移到G種群(928)中，它全部或部分遮蔽了所研究的L子種群。通常，為了獲得所研究的子種群的百分含量的正確分析，在移動前和后得到一對照種群，以標準化這個子種群的百分比。
如上所述，標準種群可以是(1)白血細胞種群(924)、(926)和(928)的總數，在這種情況，人造種群(930)通常不利用;
(2)M種群(924)，它不遮蔽所研究的子種群的移動或未移動的檢測特性;
(3)人造種群(930)，它也不遮蔽所研究的子種群的移動或未移動的檢測特性;或(4)G種群(928)，進入該種群的子種群的檢測特性將部分或全部移動。這種標準種群提供用于本發明的方法的標準化種群。
現在參照圖49A和49B，給出了利用依據儀器(900)的方法從一全血樣品得到的點散布圖描述結果的兩個組。參照圖49A描述了一未移動或對照的點散布圖。在這個例子中，淋巴細胞的CD8子種群是所研究的白血細胞種群的子種群。
對照生物樣品(902)是25微升全血樣品與100微升緩沖液混合，反應物(906)是300微升RBC溶胞劑，如前所述，它與生物樣品(902)混合并攪拌5秒鐘，以120微升猝滅劑猝滅該混合物，如前所述，再次攪拌5秒鐘，然后送到白血細胞分析器(912)。該分析器(912)得到第一淋巴細胞計數L1965，它包括所研究的CD8白血細胞種群的子種群。淋巴細胞包含在方框(932)中，該方框最好在(934)處開啟，以消除碎屑，如從計數中除去老化的嗜中性細胞，也得第一全體白血細胞計數T1是4862，它包括在方框(932)那些細胞以及在方框(932)之外的在M和G組(936)和(938)中的細胞。
樣品混合物(902)或它的第二部分與50微升鍵合有T8專用單克隆抗體的2.2微米微球的2%溶液攪拌15秒。如應用混和物(902)的第二部分，用上述提及的方法之一除去RBC。然后將移動的混合送到白血細胞分析器(912)，從而獲得圖49B所示的點散布圖。CD8白血細胞種群子種群現在從在方框(932′)中淋巴細胞移動到G細胞組(938′)中。
CD8白血細胞種群子種群原來由在方框(932)中L遮蔽或部分遮蔽，而現在由細胞組(938′)中G細胞遮蔽或部分遮蔽。白血細胞分析器(912)得到L為764的第二計數L2(由965降低)，以及第二全部白血細胞計數T2為4864。
如果總的白血細胞計數是相同的，那么，僅僅通過減去就可能得到CD8計數。但是，如果不是那種情況，并且通常將不是這種情況，那么這個百分比將被標準化，例如，用兩個總的白血球計數(L1)/(T1) = (X)/(T2) ,X= ((L1)(T2))/(T1) = ((965)(4864))/4862 =965.4CD8的百分比＝ ((X-764)100)/(X) ＝ ((965.4-764)100)/965.4 ＝20.86
所得到的CD8百分比可與用流動細胞計數器得到23.0%比較。如以前所述，其他對照種群也可利用。
如圖50A和50B所示，用類似方法可得到CD4白血細胞種群的子種群百分比。在這個例子中，微球鍵合T4專用單克隆抗體，并且攪拌30秒。在圖50A給出了對照點散布圖。而且得到在方框(940)中L的第一淋巴細胞計數1171，并得到第一總的白血細胞計數4863，包括M和G細胞(942)和(944)。
在圖50B示出移動的點散布圖，它給出了第二L計數878和第二白血細胞總計數4857。總的CD4白血細胞子種群是24.9%，它可與流動細胞計數器得到計數28.6%比較。
在上述例子中，用RF和濁度得到那些點散布圖，其他檢測參數也可利用，例如見圖57-60，但是RF參數在L和剩余的白血細胞之間給出一個好的分界。在這些例子中，所有白血細胞被計數，但在組(936)和(942)中M可以不管，因為M既不遮蔽移動或未移動的CD4，又不遮蔽移動或不移動的CD8，CD4和CD8白血細胞種群子種群是所研究。
在圖51-53中示出了來自不同樣品的三個附加的CD8百分比例子。在圖51A中，在方框(946)中得到第一L計數1520，而在方框(946)中的L和方框(948)中剩余細胞和細胞但計數得到第一總的白血細胞計數4861。在圖51B中的方框(946′)得到第二移動的L計數1030，而包括在方框(946′)和(948′)的那些細胞的第二總的白血細胞計數4856，得到CD8百分比是32.2，而流動細胞計數器給出的是CD8百分比是34.6。
在同樣方法中，圖52A和52B的點散布圖給出第一和第二L計數1393，930，以及第一和第二白血細胞計數4864，4861。CD8百分比是33.2，它可以與流動細胞計數器的百分比31.2比較。圖53A和53B的點散布圖給出了第一和第二L計數1031和778，以及第一和第二白血細胞計數4862和4860。得到CD8百分比是24.5，這可以與流動細胞計數器的百分比21.7比較。
在圖54-56中示出了來自不同樣品的得到CD4百分比的附加的例子。在圖54A中，在方框(950)中得到第一L計數1372，通過在方框(950)計數L和在方框(952)中計數剩余細胞和細胞組計數得到第一總的白血細胞計數4764。在圖54B中的方框(950′)中得到第二移動的L計數670，而包括在方框(950′)和(952′)中那些細胞的第二白血細胞計數4855。得到CD4百分比是52.1，而流動細胞計數器的百分比是54.4。
在同樣方法中，圖55A和55B的點散布圖給出了第一和第二L計數1684和956，而第一和第二白血細胞計數4863和4862，得到CD4百分比是43.2，這可與流動細胞計數器百分比45.3比較。圖56A和56B的點散布圖給出了第一和第二L計數1234和542，而第一和第二白血細胞計數4859和4857。得到CD4百分比是56.1，它可與流動細胞計數器的百分比56.3比較。
圖57-60說明其他電檢參數組合，形成點散布圖。在圖57A和B中，為了說明用DC和濁度點散布圖。在方框(954)得到第一L計數868，用在方框(954)計數L和在方框(956)中計數剩余細胞和細胞組得到第一總的白血細胞計數4827。由圖57B的方框(954′)中得到第二移動L計數664，而包括在方框(954′)和(956′)中那些細胞的第二總的白血細胞計數4813，得到CD8百分比是23.2。
用DC和RF作檢測參數圖示在圖58A和58B的點散布圖。在圖58A中，第一L計數926是在方框(958)中得到，利用計數方框(958)的L和計數在方框(960)中剩余細胞和細胞組得到第一總的白血細胞計數4848。在圖58B的方框(958′)中得到第二移動的L計數776，包括在方框(958′)和(960′)那些細胞的第二總的白血細胞計數4855，得到CD8百分比是16.3。
僅用單一DC檢測參數圖示在圖59A和59B的點散布圖，在圖59A中第一L計數935是在方框(962)中得到，而計數在方框(962)中的L和計數在方框(964)中剩余細胞和細胞組得到第一總的白血細胞計數3918。在圖59B的方框(962′)得到第二移動的L計數825，而包括在方框(962′)和(964′)中那些細胞的第二總的白血細胞計數是4029，所得到的CD8百分比是11.8。
僅用單個RF檢測參數圖示在圖60A和60B的點散布圖，在圖60A中，由方框(966)得到第一L計數969，利用計數方框(966)中的L和方框(968)中剩余細胞和細胞組，得到第一總的白血細胞計數3880，在圖60B的方框(966′)得到第二移動L計數779，而包括在方框(966′)的(968′)中那些細胞的第二總的白血細胞計數4069，得到CD8百分比是19.6。
圖57-60的點散布圖沒有被最佳化，并且這些數據如所示沒有清楚分離。這特別由圖59A和B以及圖60A和B中可以看到，因為這些圖的每一個都是由同樣的數據得來。這特別在圖60A和B中所示，因為得到的結果是11.8，這遠離在圖57A和B中得到結果23.2。還有，雖然2.2微米直徑的微球用作例子，其他大小也可被利用。
在上述的例子中，用作標準種群的是用總的白血細胞種群的總計數因為說總計數是恒定的標準種群也可是不干擾的白血細胞計數(924)或人造種群(930)(圖48)，它不被所研究的白血細胞種群子種群影響或遮蔽，無論是移動前或移動后。因為該白血細胞種群不受影響，除了細胞碎片、漂泊的微球或其他象差外，它的第一和第二計數應是相同的。用一組也不被遮蔽的微球可形成人造種群。此外，雖然利用全血樣品來描述本發明的方法和裝置，也可能有些例子，在那里希望應用除去RBC和/或WBC種群的一些的樣品部分。顯然，RBC一直被除去，但在本發明的裝置內或外可討論。這種除去或制備可以在多種普通途徑完成，例如利用溶胞試劑，密度或離心技術，如菲科爾(ficoll)、葡聚糖、“血沉棕黃層”等等。在利用本發明的自動分析器中，在分析樣品中利用全血樣品對速度和完整性來說將是優選的。
在上述的技術見解中，本發明的許多改進和變化是可能的。樣品(12)、(42)、(150)、(180)、(294)、(322)、(342)和(902)可包括全血、含細胞的人的體液、或含有形成體，如細菌、病毒和真菌的其他流體。確定的微球量是表明單位稀釋劑體積中微球的重量。雖然樣品的體積在大約20微升左右，例如用于實施例中的全血樣品，如果需要較小或較大的樣品體積也可應用，例如對于一具體的儀器或技術小到大約2微升到任何體積樣品是實際的也可被應用。雖然這些例子中一些是按時序步完成的，這些步也可同時完成。同時分析允許最小復雜儀器類型使用，因此可以理解在所附權利要求的范圍內，本發明按不同于前面具體描寫方式也可實踐。
權利要求
1.一種至少從一個樣品的一部分至少獲得一個被遮蔽或被部分遮蔽種群的分析方法，該樣品至少具有包括至少一個研究的種群子種群的第一細胞種群和一個第二細胞種群，其特征在于對至少包括第一細胞種群及其子種群的第一種群進行電檢測和進行計數，以便獲得第一計數；把研究的細胞種群子種群移出所述第一細胞種群后，并使其至少部分地轉移到第二細胞種群中。對至少包括第一細胞種群及其子種群的剩余的第一種群進行檢測和計數，以便得到第二計數；以及把所述第一和第二計數比較，以便獲得所研究細胞種群子種群的百分含量。
2.如權利要求1的方法，其進一步的特征在于利用兩個不同的電參數對所述種群進行電檢測和計數。
3.如權利要求1的方法，其進一步的特征在于利用一個單一的電參量對所述種群進行電檢測和計數。
4.如權利要求1的方法，其進一步的特征在于通過提供一種上面鍵合有對所研究細胞種群子種群上的特定分子是專用性的反應劑的微球，將該所研究細胞種群子種群轉移，然后使所述微球同所述樣品混合，以便使該微球鍵合在所研究的細胞種群子種群上，并至少移動該所研究細胞種群子種群的一個檢測特性。
5.如權利要求4的方法，其進一步的特征在于提供單克隆抗體在形成所述特定分子的所研究的細胞種群的子種群上形成所述的反應物和抗原。
6.如權利要求1的方法，其進一步的特征在于提供具有至少第一白血細胞種群組成所述第一細胞種群，和第二白血細胞種群組成該第二白血球種群的全血樣品。
7.如權利要求6的方法，其進一步的特征在于，通過提供上面鍵合有對該CD4白血細胞種群子種群是專用的單克隆抗體的微球，使所述CD4白血細胞種群子種群轉移，使這些微球同所述樣品混合，以鍵合所述CD4子種群，以便移動至少該CD4子種群的一個檢測特性。
8.如權利要求6的方法，其進一步特征在于借助于上面鍵合有對所述CD8白血細胞種群子種群是專用的單克隆抗體的微球使CD8白血細胞種群子種群移動，并使所述微球同所述樣品混合，以便使這些微球鍵合所述CD8子種群，從而至少使所述CD8子種群的一個檢測特性移位。
9.如權利要求6的方法，其進一步的特征在于所述全血樣品包括一個紅血細胞種群，并將該紅血細胞種群從該樣品中除去而不明顯地損害所述白血細胞種群的有關的性質和/或數量。
10.如權利要求6的方法，其進一步特征在于，至少對第一白血細胞種群及其子種群，以及第二白血細胞種群進行檢測和計數，以便在所研究的白血細胞種群進行所述移動之前得到一個第三計數，以及至少對剩余的第一白血細胞種群及其子種群和包括所述研究的移動白血細胞子種群的第二白血細胞種群進行檢測和計數，以便在所研究的白血細胞種群子種群經該轉移后得到一第四計數，把該第一和第二計數至少同第三和第四計數之一進行比較，以便得到所研究的白血細胞種群子種群的百分含量。
11.如權利要求10的方法，其進一步的特征在于把所述第一和第二計數同該第三和第四計數二者比較，以便標準化這個百分含量。
12.如權利要求10的方法，其進一步的特征在于，對全部白血細胞種群及其子種群進行檢測和計數，以便得到該第三和第四計數。
13.如權利要求6的方法，其進一步的特征在于，對一個標準種群進行檢測和計數，以便在所研究的白血細胞種群子種群進行所述移動之前得到第三計數，在所研究的白血細胞種群子種群經所述移動之后對該標準種群進行檢測和計數，以便得到第四計數，并將該第三和第四計數相比較，以便標準化該百分含量。
14.如權利要求13的方法，其進一步的特征在于，所述標準種群是一個由非干擾的微球構成的人造種群。
15.如權利要求13的方法，其進一步的特征在于所述標準種群是一個非干擾的白血細胞種群。
16.如權利要求13的方法，其進一步的特征在于所述標準種群是一個全部白血球種群的總體。
17.一種為至少從一個樣品的一部分至少獲得一個被遮蔽或部分被遮蔽種群的分析結果的裝置，該樣品至少具有包括至少一個所研究的種群子種群的第一細胞種群和一個第二細胞種群，其特征在于包括用于對至少包括第一細胞種群及其子種群的第一種群進行電檢測和計數，以便得一第一計數的組件(912);用于使所研究的細胞種群子種群從該第一細胞種群中移出并至少部分地轉移到第二細胞種群中的組件(916);用于對至少包括第一細胞種群及其子種群的剩余第一種群進行電檢測和計數，以得到第二計數的組件(912);用于比較所述的第一和第二計數，以便獲得所研究的細胞種群的子種群的百分含量的組件(922)。
18.如權利要求17的裝置，其進一步的特征在于組件(912)是用于利用兩個不同電參量對所述種群進行檢測和計數的。
19.如權利要求17的裝置，其進一步的特征在于組件(912)用于利用一個單一的電參量對所述種群進行電檢測和計數的組件。
20.如權利要求17的裝置，其進一步的特征在于組件(916)是用于借助于鍵合反應物微球移動所研究的細胞種群子種群，該反應物是專用于在所述研究的細胞種群子種群上的一特殊分子，還包括一個用于使所述微球同該樣品混合、以便鍵合所研究的細胞種群子種群、并至少使該研究的所述細胞種群子種群的一個檢測特性移位的組件。
21.如權利要求20的裝置，其進一步特征在于組件(906)，用于提供一單克隆抗體，在形成所述特殊分子的所述研究的細胞種群的子種群上形成所述的反應物和抗原。
22.如權利要求17的裝置，其進一步特征在于全血樣品(902)，至少帶有構成所述第一細胞種群的第一白血細胞種群和構成所述第二白血細胞種群的第二白血細胞種群。
23.如權利要求22的裝置，其進一步的特征在于用于使CD4白血細胞種群子種群轉移的組件(916)包括提供上面鍵合有一個專門用于CD4白血細胞種群子種群的單克隆抗體的微球的組件和用于所述微球同該樣品混合，以鍵合到所述CD4子種群、以便至少使所述CD4子種群的一個檢測特性移動的組件。
24.如權利要求22的裝置，其進一步特征在于，用于使CD8白血細胞種群子種群轉移的組件(916)包括提供鍵合有一個專門用于CD8白血細胞種群子種群的單克隆抗體微球的組件和用于使所述微球同該樣品混合、以便使鍵合所述CD8子種群，從而至少使該CD8子種群的一個檢測特性移動的組件。
25.如權利要求22的裝置，其進一步特征在于，所述全血樣品包括一個紅血細胞種群和用于使所述紅血細胞種群從該樣品中去除而不明顯地損害所述白血細胞種群的相關的性質和/或數量。
26.如權利要求22的裝置，其進一步的特征在于用于至少對第一白血細胞種群及其子種群和第二白血細胞種群進行檢測和計數，以便在所述研究的白血細胞種群子種群進行所述轉移之前得到第三計數的組件，和用于至少對剩余的第一白細胞種群及其子種群和包括所述的轉移過所研究的白血細胞子種群的第二白血細胞種群進行檢測和計數，以便在所述研究的白血細胞種群子種群進行所述轉移后得到第四計數的組件和用于使所述第一和第二計數至少同該第三和第四計數的一個比較，以便得到所研究的白血細胞種群子種群的百分含量的組件。
27.如權利要求26的裝置，其進一步的特征在于組件(922)用于使所述第一和第二計數同所述第三和第四計數二者比較，以便標準化該百分含量。
28.如權利要求26的裝置，其進一步的特征在于包括用于對所有的白血細胞種群及其子種群進行檢測和計數，以便得到所述第三和第四計數的組件。
29.如權利要求22的裝置，其進一步的特征在于，包括用于對一個標準種群檢測和計數，以便在所研究的白血細胞種群子種群進行所述轉移之前得到第三計數的組件，以及用于在所研究的白血球細胞種群子種群進行所述轉移之后對該標準種群進行檢測和計數，以便得到第四計數的組件和用于使所述第三和第四計數相比較，以便標準化該百分含量的組件。
30.如權利要求29的裝置，其進一步的特征在于該標準種群是一個由非干擾的微球構成的人造的種群。
31.如權利要求19的裝置，其進一步的特征在于所述標準種群是一種非干擾的白血細胞種群。
32.如權利要求29的裝置，其進一步的特征在于該標準種群是所有白血球種群的總體。
全文摘要
一種用于完成篩選被遮蔽或部分被遮蔽的細胞，以便計算出一種或多種細胞種群的子種群的方法和儀器(900)。一個包括被遮蔽的所研究的子種的白血細胞種群與標準種群同時被首先計數(912)。一個沒有遮蔽所研究的子種群的移位過或沒有移位的檢測特性的第二白血細胞種群；一個也沒有遮蔽所研究的子種群移位過的或沒有移位檢測特性的微球形成的人造種群，或者一個將使該子種群的檢測特性全部和部分地轉移到其中的白血細胞種群，然后通過使帶有對所研究的白血細胞種群是專用的單克隆抗體的微球健合到細胞種群(916)上的方法，使所研究的該白血細胞種群子種群的檢測特性移位。
文檔編號G01N15/14GK1057339SQ9110396
公開日1991年12月25日 申請日期1991年5月17日 優先權日1990年5月17日
發明者詹姆斯·咔里·赫德森, 卡洛斯·M·羅德里庫茨, 湯姆斯·拉塞爾, 沃拉斯·H庫爾特 申請人:科特電子公司