專利名稱：馬傳貧病馬與接種弱毒疫苗馬的血清抗體鑒別診斷試劑的制作方法
技術領域：
本發明是一種含有不明結構抗原或抗體的醫用配制品，用于馬傳貧病馬與接種弱毒疫苗馬的血清抗體的鑒別診斷試劑。
馬傳染性貧血病(簡稱馬傳貧)是各國養馬業的大敵之一，為世界廣泛存在的馬的傳染病。為了預防本病，我國首創馬傳貧驢白細胞弱毒疫苗，用于馬匹免疫預防。但是患本病馬匹與接種過弱毒疫苗的馬匹均可出現血清學反應。如依各國現行的免疫擴散試驗法、中和試驗法、補體結合法檢查，則兩者無法區分，使診斷工作無法進行。
本發明的目的是采用現代高技術中的淋巴細胞雜交瘤技術，研制出僅對馬傳貧驢白細胞弱毒株系特異的單克隆抗體(McAb)，并制成酶聯McAb試劑，以免疫斑點(DB)試驗法鑒別診斷馬傳貧病馬與接種弱毒疫苗馬匹。
下面詳細說明馬傳貧病馬與接種弱毒疫苗馬的血清抗體鑒別診斷試劑的制造方法。
一、雜交瘤細胞株的建立用馬傳貧驢白細胞弱毒免疫BALB/C鼠，以免疫鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞，采用雜交瘤細胞融合法進行細胞融合。對雜交瘤細胞生長孔上清液，用ELISA和IF法進行分泌McAb的檢測，對培養上清液抗體檢測陽性孔的細胞，再用96孔細胞培養板以有限稀釋法作三次克隆化培養和增殖，然后轉入細胞培養瓶中傳代培養，并連續培養60代，以此獲得了分泌抗馬傳貧驢白細胞弱毒株系特異McAb的雜交瘤細胞株。
二、McAb的制備和純化1、McAb的制備取雜交瘤細胞(1×107/ml)0.5ml接種到預先腹腔注射0.5ml降值烷的BALB/C鼠的腹腔內，經10-14天，BALB/C鼠的腹部膨大后，無菌抽取腹水，再接種到第二代BALB/C鼠的腹腔，如此在BALB/C鼠腹腔傳三代后，大批接種第四代小鼠，無菌收集腹水，經200g離心力離心，10分鐘后，收集上清液備用。
2、McAb的純化(1)硫酸銨沉淀法將所獲得腹水以50%的飽和硫酸銨反復沉淀3次，用PH7.2、0.02M的PBS透析，至無銨離子為止。
(2)柱層析用SephadexG200凝膠過濾，收集第一個峰，用蔗糖濃縮，凍干后置-20℃條件下存用。
三、酶聯McAb試劑的制備采用過碘酸氧化法1、稱取辣根過氧化物酶5mg溶于1ml、0.3M碳酸氫鈉溶液中，電磁攪拌下加入0.1ml、1%的二硝基氟苯無水乙醇溶液，室溫避光攪拌1小時。
2、加入1ml、0.06M過碘酸鈉溶液，室溫避光電磁攪拌30分鐘。
3、加入1ml、0.16M乙二醇溶液，室溫避光電磁攪拌1小時。
4、對1000ml、0.01MPH9.5碳酸鹽緩沖液透析，4℃過夜，中間換液三次。
5、加入5mgMcAb(以0.1MPH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋至1ml)室溫避光攪拌3小時。
6、加5mg硼氫化鈉4℃作用3小時。
7、裝透析袋，以0.02MPH7.4的PBS透析，4℃下放置24小時，中間換液2-3次。
8、電磁攪拌下逐滴加入等體積100%飽和硫酸銨4℃靜置1小時，400G離心力離心15分鐘，棄上清液，沉淀物用50%飽和硫酸銨洗二次，按前方法離心，沉淀溶于少量滅菌的0.02MPH7.4PBS中，4℃下對0.02MPH7.4PBS透析過夜，換液數次至無銨離子為止。用紫外分光光度計測OD403nm和OD280nm。
9、計算酶標記抗體的McAb量、酶量、克分子比值。
10、酶標記抗體，以滅菌的0.02MPH7.4PBS稀釋成一定濃度(200μg/ml)分裝安瓶，-20℃低溫保存。
四、使用方法采用免疫斑點試驗法。
應用硝酸纖維素膜或混合纖維素脂膜作固相載體。
操作步驟(1)點樣將陽性、陰性對照及受檢血清用微量進樣器或玻璃棒沾約2.5ml，點在膜的指定位置上，室溫干燥15分鐘。
(2)用含0.05%Tween-20的0.02MPBS(PH7.2)漂洗三次，每次3-5分鐘。
(3)將膜浸入抗原-酶聯McAb試劑溶液中，室溫下1小時，抗原-酶聯McAb試劑用(2)項溶液稀釋。
(4)重復(2)項(5)將膜浸入底物溶液(PH7.6的0.05M Tris-HCl 20ml;DAB 3mg;30%H2O260ml)30分鐘。
(6)用蒸餾水漂洗。終止反應，判讀結果，顯紅棕色為陽性，即馬傳貧驢白細胞弱毒疫苗免疫馬。這樣就區分開了馬傳貧病馬與接種過馬傳貧驢白細胞弱毒疫苗馬。
用本發明的試劑鑒別診斷馬傳貧病馬與接種過弱毒疫苗的馬，結果準確，方法簡單。
權利要求
1.一種馬傳貧病馬與接種過弱毒疫苗馬的鑒別診斷試劑，其特征在于，采用淋巴細胞雜交瘤技術，研制出的僅對馬傳貧驢馬白細胞弱毒株系特異的單克隆抗體(McAb)并制成酶聯單克隆抗體(McAb)試劑，以免疫斑點(DB)試驗法鑒別診斷馬傳貧病馬與接種過驢白細胞弱毒疫苗馬。
全文摘要
本發明是一種馬傳貧病馬與接種弱毒疫苗馬的血清抗體鑒識診斷試劑，這種試劑是利用淋巴細胞雜交瘤技術，獲得了分泌抗馬傳貧驢白細胞弱毒株系特異的單克隆抗體(McAb)的雜交瘤細胞株，再對單克隆抗體(McAb)進行制備和純化。采用過碘酸鈉氧化法，制備出了酶聯單克隆抗體(McAb)試劑，以免疫斑點(DB)試驗法來鑒別診斷馬傳貧病馬與接種弱毒疫苗馬。
文檔編號G01N33/577GK1042940SQ8810808
公開日1990年6月13日 申請日期1988年12月1日 優先權日1988年12月1日
發明者蘆景良, 孔憲剛, 寧希德, 張日闊, 褚桂芳, 相文華 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所