專利名稱：波長分散電泳儀的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種電泳儀，用于分別測定脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及其類型物，更確切地說，它是一種波長分散電泳儀，特別適用于測定由不同波長的多種熒光電泳所標記的試樣發出的熒光。
以往DNA堿基序例的測定方法是這樣的用放射自顯影術將分離的結構轉拍成照片，然而用這種方法處理放射性元素很麻煩，而且廢刀廢時。為此，就考慮了這樣工作的系統在電泳分離期間通過DNA通過熒光標記實時地測定DNA斷片(L.M.史密斯等，自然，第321卷，674-679頁(1986年))。用這種方法，當特定的DNA的一端固定時，在另一端或中間做上熒光標記，以便分出四種DNA斷片組，每一種DNA斷片的另一端的核酸堿基分別為腺膘(A)，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)或(G)。這時，用發射不同波長的熒光電泳來標記各個堿基試樣，然后將四種斷斷片組放在一起由凝膠電泳分離。電泳在較短的DNA斷片上移動速度更快些，因此當某一試樣進入一固定距離的某一處被激光照射后，DNA斷片便從照射過的地方通過，其中最短的斷片會成功地發出熒光。由于不同堿基試樣發射波長不同，所以可用波長來測定不同的堿基試樣。而斷片的長度則可用移動的時長來測定。
為辯別四種不同波長的熒光。L.M.史密斯等轉換四種發射不同波長的濾光器。此外，美國應用生物系統股份公司出售一種儀器，儀器上有一淺盤式凝膠可供測量多種試樣。此儀器內有一激光束照射著凝膠平面的一個點。熒光從這里發射穿過一旋轉濾光器，熒光由光敏部位測定，測定大量試樣時，用激光交替照射不同部位，直線掃描凝膠并檢測光敏部位，用這種方法取得各項信息。
以前的工藝是采用旋轉濾光器，沒有考慮增強被測定部位接收熒光的量，更確切地說，在測定水平方向(與電泳垂直的方向)10Cm之內的電泳盤表面區域時，激光照射每個點的周期為一個掃描周期(通常為1秒鐘左右)的 1/200 假設激光束的寬度為0.5mm，另外由于四個濾光旋轉與四個堿基樣本相對應，測定每個堿基試樣的周期則僅是每個點周間的四分之一。最終，測定一個堿基試樣某一點所用的時間僅為一個整測定時間的 1/800 ，因此由于吸收的熒光量很小，所以靈敏度不高。
本發明的目標是要提供一個高靈敏度的波長分散電泳儀。該儀器采用沒有旋轉濾光器的簡單裝置，在整個檢測周期內接受各種波長的熒光。
為達到上述目標，本發明的波長分散電泳儀的構造是這樣的;一個測量區(即一個復蓋了水平方向上一段固定長度的區域，此固定長度是予先確定的，自電泳盤上的電泳起點起始)同時被一光束照射，發射的熒光由一直視棱鏡(即一復合棱鏡，它由一組不同材料做成的棱鏡組合而成，該鏡使D線的偏斜幾乎為零，并將其兩面的其他線分散開)產生波長散射，而后透鏡系統使波長的散射聚焦在一圖象增強器上，平面探測器檢測聚焦的圖象。
也就是說，本發明的波長分散電泳儀達到其目標的方法是這樣的通過在聚焦透鏡前配置一直視棱鏡來聚焦熒光(在聚焦透鏡和電泳盤之間)使其能進行波長分散并同時將分散的熒光聚焦。
更具體的說，該電泳儀有用電泳分離一試樣組的裝置，該試樣組是由標有至少二種熒光電泳標記的試驗組成。激發裝置用以激發已標定試樣的熒光電泳，使試樣發射熒光，探測裝置用于探測發射出的熒光;本發明的波長分散電泳儀含有一直視棱鏡。它能分散各種波長的熒光，并將其配置在上面所說的探測器前。
更詳細地說，本發明的波長分散電泳儀的典型結構如下ⅰ)由平行配置的多個移動通道所構成的電泳分離裝置;ⅱ)所說的激發裝置是指形成激發光的裝置，激發光與所有移動通道相交，并垂直射入移動通道;ⅲ)由平面檢測器構成所述的檢測裝置;Ⅵ)直視棱鏡和探測裝置的安排可以使熒光圖象按垂直方向(移動方向)進行波長分散。
通常，把激光束作為激發光，一般情況下，激光束可看作一平行光束，在測量區域內的那段光束基本上是圓環狀，其直徑為0.3mm或小于0.3mm。
多種熒光標記物之間的波長差異及直視棱鏡角度分散之間的差異都得到完善的處理，以致使圖象增強器上基于不同電泳的熒光圖象之間的間隔在0.1mm以上，原因是在當今具有圖象增強器的熒光探測器上，其熒光圖象的位置分辯力是0.03～0.05mm。
另外，直視棱鏡前通常配置一切割激發激光束的濾光器(位于直視棱鏡與電泳盤之間)。
相應地，這些裝置的排列順序為移動通道，濾光器，直視棱鏡，聚光透鏡，圖象增強器和平面探測器。
移動通道是凝膠做成的，如眾所周知的聚丙烯酰胺凝膠。通常使用的電泳盤具有多條移動通道。一般，電泳盤的結構是凝膠被夾在面熒平盤的支架之間。
通常平面探測器的輸出信號經一檢測電路傳到監視器，也可經過檢測電路和計算機傳送到輸出裝置，如繪圖儀，陰極射線管，這一輸出信號是經過處理和分析的。
眾所周知，圖象增強器可將光學圖象聚焦在其感光熒光屏上，然后轉換成光電子，這些光電子又被放大為次電子被投射到熒光屏上，從而可看到清晰的密度圖象。該設備是一種光信號放大器。
上面所描述的本發明的波長分散電泳儀避免了以前那種使用旋轉濾光器的缺陷。而且本發明的電泳儀使用的是直視棱鏡，它不同于傳統的信號棱鏡，它由多種棱鏡組成。發射的光路并不完全不同于入射的光路，僅基于波長導致分散。因此，利用透鏡系統并以波長分散的形式，無失直的熒光圖象能在圖象增強儀或高靈敏度的平面探測器上聚焦。
假設，熒光圖象在水平方向上出現，熒光圖象在垂直方向上產生波長分散，則各種波長是由其在垂直方向上的不同部位來區分的，而所照射的不同部位是由水平方向的坐標來區分的。垂直方向的散射表示帶有不同熒光標記的基本物質，而水平方向的位置則反映了加載位置的不同并表示了試樣的差異性。
本發明很好的利用了已知的熒光檢測型的電泳儀技術，只是更新了區分熒光波長的測量方法，尤其是采用了直視棱鏡和激發激光束的(不同)進入方向。
圖1是一原理圖，展示了一臺波長分散電泳儀的結構，是該發明的具體裝置。
圖2A是一個解釋性的圖解，示出了一個DNA堿基序列的例子。
圖2B是一個解釋性的圖解，說明了確定DNA堿基序列的原理。
圖3是一個截面圖，展示了用于該發明的波長分散電泳儀具體裝置的直視棱鏡。
現對本發明的具體裝置作一圖解說明。
圖1顯示了整個儀器的結構，圖2A、2B說明了堿基序列判決的原理，圖3是復合棱鏡的工作原理。
要測定其序列的DNA16的一端(見圖2A)用熒光電泳F1作標記，另一端(〔A〕組)備有一組斷片，每一段片為腺膘呤堿基(A)，同時備有類似的其他幾組堿基斷片;胞嘧啶(C)，烏嘌呤，(G)和胸腺嘧啶(T)，然后對不同的斷片組變換使用標定的熒光電泳即對C、G和T分別改用F2、F3和F4。最后將〔A〕、〔C〕、〔G〕和〔T〕堿基斷片組放在一起并將試樣放到電泳凝膠上的試樣槽18內，以便進行電泳，一個試樣用一條移動通道(31)在這裝置中，電泳盤17可容納多條移動通道31，這樣便可同時測定大量的試樣，如圖2B所示，較短的DNA斷片移動得快些。因此，用光照射一段距離的某一點(在這一裝置中為20～30cm)，這段距離是事先確定并從電泳的起始點開始的，然后在觀察通過這一點的DNA斷片發射出的各種熒光時，便可從經歷的時間周期來測定堿基的長度，通過熒光的波長可確定在另一端的堿基種類。
電泳凝膠含有3-8重量百分比的聚丙烯酰凝膠，其厚度為0.2mm，寬度為20cm，長度為30cm，電泳凝膠夾在石英平盤中間。雖然圖2B中DNA帶15只出現在移動通道31的左邊，但實際上DNA帶可出現在移動通道31的各個通道上。
至于激發光，以所使用的激光束13(圖1)為例，激光器2發射出激光束13，經鏡子3適當地反射，反射光水平地進入凝膠盤1的一面，且基本與盤子的表面平行。測定區域是電泳盤上水平方向的10cm范圍。
從凝膠發射出去的熒光圖象以及包含多條移動通道的激發光在直線部位上所發射出的電泳都通過濾光器4以供切割激發光直視棱鏡14迫使激發光波長分散，分散的圖象通過聚焦鏡5在圖象增強器6上聚焦，形成所發射的區域圖象。平面檢測器7接收了分散的和增強后的圖象。檢測器的水平位置表示了發射區的座標，而垂直方向則與波長的分散相對應，因此，從一組DNA斷片發出的熒光信號在檢測器上接收到的是一條或幾條水平線，波長分散的熒光信號在檢測器上獲得至少4條的水平線，檢測電路9采集了這些信號，信號檢測的狀態可在監控器8上觀察到，另外，檢測電路9產生的信號可由存儲器10，計算機11和輸出設備12進行處理和分析。
這里進一步給出一個例子，波長為488nm的激光束作為激發光，同時FITC(異硫氰酸熒光素的發射波長為515nm)和它的同質異能素(發射波長為535nm，555nm，575nm)作為熒光電泳，正如圖3所說明的，棱鏡的折射組合系數為n2和n3不同波長的折射角所產生的散射角
可由下列公式
這里uout表示偏差角，λ為波長，α2分別為第一塊棱鏡20和第三塊棱鏡22的頂角，n2為第一和第三塊棱鏡的平均折射系數(“平均折射系數”指的是四種熒光波長取平均值后的折射系數)。
η1為空氣的折射系數，η3為第二塊棱鏡21的平均折射系數。進一步說，
為第一塊棱鏡20和第三塊棱鏡22的光學成分玻璃的ηd值(D線折射系數為587.6nm)ηd3為第二塊棱鏡21的光學成分玻璃的ηd值，νd2為第一和第三塊棱鏡的光學成分玻璃的νd值(D線折射系數的散射)，νd3′為第二塊棱鏡的光學成分玻璃的νd值，λF、λC和λd(下線、C線、D線的波長分別為486.1nm，656.3nm和587.6nm，另外，折射系數n1取值為1。
當頂角α2取值為15°，“SFS1”和“FK5”分別取值于第一塊棱鏡和第二塊棱鏡的材質，得出折射系數η2為1.92，折射系數η3為1.4第二塊棱鏡21的頂角α3為
另外，νd2＝21，ηd2＝1.92，νd3＝70，ηd3＝1.4進而，可算出下式
這里，假設波長之間的差值△λ＝20nm，透鏡和透鏡圖象之間的距離L＝60mm，進而在圖象增強器上散射△l為l＝0.095·△λ·L＝0.11(mm)即0.11mm的散射加在圖象增強器上。另舉一個要求更大散射的例子，設α2＝30°，L＝100mm得出更大的散射為0.36mm，這里不同的波長可令人滿意地分辯出來。順提一下，圖象增強器上的位移分辯力為0.03mm圖3中的數19表示一入射光束，數19′，19″，19″表示輸出光束，輸出光束分別具有D線波長、比D線長的波長以及比D線短的波長。
根據本發明的波長分散電泳儀，不需要更大地改變光路就能完成波長的分散，因此可以通過沒有失真的波長分散來測定熒光圖象，這一發明體系不同先前的技術手段，不需要用不同的旋轉濾光器來分別接收不同的波長。在整個測量周期內，使用一個簡單的裝置就能接收到足夠飭渴褂玫母髦植煌ǔさ撓猓虼嘶竦昧朔淺８叩牧槊舳取
權利要求
1.電泳儀是用電泳方法分離試樣組的裝置，試樣組由標以至少二種熒光電泳的試樣組成，激發裝置用于激發已標定的試樣的熒光電泳使試樣發射熒光，檢測裝置用于檢測發射出的熒光。而波長分散電泳儀的特殊是一個復合棱鏡(14)，該鏡是由多種用不同材料做成的一組棱鏡組成，它將不同波長的熒光分散，并將熒光投射在所說的檢測裝置前面。
2.權利要求1中所說的波長分散電泳儀中的電泳分散裝置實際是由鄉條并行配置的移動通道(31)組成，所說的激發裝置是由激發光(13)組成，激發光與所有的移動通道(31)相交，并垂直射入移動通道(31)，檢測裝置是一種平面檢測器(7)，復合棱鏡(14)和檢測裝置的安排應使是波長分散發生在與熒光圖家垂直的方向上。
3.權利要求2中所說的波長分散電泳儀的復合鏡前配置一濾光器(4)，用于切割。
4.波長分散電泳儀的組成ⅰ，一個電泳盤(17)，它包括多條移動通道(31)，對標有至少兩種熒光電泳的試樣組成的一組試樣進行電泳;ⅱ一個濾光器(4)用于切割激發光;ⅲ，一個復合棱鏡(14)，它是由不同材料做成的多個棱鏡組成;Ⅳ)一個聚焦透鏡(5);Ⅴ，一個圖象增強器(6);Ⅵ，一個平面熒光檢測器(7)，上述部件按ⅰ，-Ⅵ，的順序排列放置。另有一個激發光裝置，導致激光束(13)射入以便與所有的移動通道(31)垂直相交。
5.權利要求4中的波長分散電泳儀中的激光束(13)是一種平行光束，其截面為環形，在電泳盤(17)的測量區域內，其直徑不超過3mm。
全文摘要
波長分散電泳儀用于測定標有多種熒光電泳的脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及其類似物試樣發射出的不同波長的熒光。為了分離和分辯各種熒光電泳的發射波長，儀器中裝有一個直視棱鏡(14)，該鏡置于一平面熒光檢測器(7)和一電泳盤(17)之間，直視棱鏡(14)分離熒光波長的方法是采用一簡單的裝置將不同波長的熒光分離開作測定，靈敏度高且不會破壞熒光圖象。
文檔編號G01N27/447GK1037214SQ8810743
公開日1989年11月15日 申請日期1988年10月29日 優先權日1987年10月30日
發明者神原秀記, 伊藤嘉敏 申請人:株式會社日立制作所