專利名稱:嵌合動物的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物工程技術領域：
的方法，具體是一種嵌合動物的制備方法。
背景技術：
抗體是一種可以高度專一地識別和結合抗原物質的一種蛋白質，是動物抵御和清除外源病原體和內源變異細胞的屏障。抗體作為疾病預防、診斷和治療藥物在臨床使用已有上百年的發展歷史，如中華人民共和國藥典2005年版(三部)收錄的基于特異抗體的藥物制劑有白喉抗毒素、破傷風抗毒素、多價氣性壞疽抗毒素、肉毒抗毒素、抗蝮蛇毒血清、抗五步蛇血清、抗炭疽血清和抗狂犬病血清等，這些抗體是通過超免疫注射馬匹獲得高效價抗血清，經胃酶消化、鹽析提純、凍干后制成，有效成分為馬抗體的(Fab)2部分，作為異源蛋白馬抗體的(Fab)2注射給人體時易于引起過敏反應，危害患者生命，因此，發展對人體沒有免疫反應的人抗體生產技術具有重大的意義。
經對現有技術的文獻檢索發現，Tomizuka等在《Nature Genetics》(《自然遺傳學》，1997年16卷133頁)上發表了題為“Functional expression and germlinetransmission of a human chromosome fragment in chimaeric mice”(“一段人染色體片斷在崁合小鼠功能表達和在種系細胞中遺傳”)的論文提出如下技術方案將含人免疫球蛋白基因組座位的染色體片斷通過分子生物學技術轉入小鼠，同時對小鼠本身的內源免疫球蛋白基因組座位(locus)進行遺傳學操作進行沉默，這樣的轉染色體小鼠從功能上能夠重組免疫球蛋白序列單元，表達各種人抗體。再用常規動物免疫，即可達到小鼠生產的人抗體。但在這種轉染色體小鼠技術方案中，由于抗體基因組十分冗長、其產生及調節極為復雜，操作過程極其復雜、周期長、成功率低、難于普及應用。
發明內容本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種嵌合動物的制備方法，使其簡便易行、成本低、易成功、周期短、可在短時間內生產多種類型抗體。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括下列步驟
①準備新鮮的人臍血細胞首先在無菌條件下用20ml的注射器抽吸斷臍后靠胎盤側的臍血(10-20ml)，然后將臍血在室溫下轉運至實驗室，每個小鼠胚胎需要注射100-200ul新鮮的人臍血細胞，不需要將人臍血干細胞進行分離、純化；②注射于早期的動物胚胎囊腔內在無菌操作下，用注射器將100-200ul新鮮的人臍血細胞混懸液(上述轉運至實驗室的臍血)注射于早期小鼠胚胎囊腔內，同時應避免損傷動物胚胎；③使注射后的早期小鼠胚胎繼續發育至新生動物，最后發育至成年小鼠對孕有注射后胚胎的小鼠進行飼養，并密切觀查，直至生出小鼠后代，然后使該小鼠后代發育為成年小鼠。
本發明的操作簡單在無菌條件下，用注射器將新鮮的人臍血細胞注射于9-11天大小的小鼠胚胎囊腔內，注射后的胚胎繼續發育至新生小鼠，最后發育至成年小鼠。用免疫方法和聚合酶鏈式反應技術測定顯示，在胚胎囊腔中注射人細胞的成年小鼠血液中存在成熟的人抗體，以及分泌人抗體的免疫細胞，一旦準備出能夠產生人抗體的小鼠，本領域的科研人員就可以用傳統的動物免疫技術免疫能夠產生人抗體的小鼠生產多克隆抗體，用B-細胞與骨髓瘤細胞融合技術制備單克隆抗體。
本發明的操作在大動物，如馬、牛、豬，羊上更容易操作，因為這些大動物的胚胎體積相對較大，更容易準確將人細胞注射到胚胎囊腔內，甚至胚胎囊腔中更精確的位置，從而準備出可以產生人抗體的大動物。在獲得本發明含人細胞崁合動物的基礎上，本領域的科技人員就能夠常規的動物免疫方法用各種抗原對含人細胞崁合動物進行免疫大規模制備抗原特異的人多克隆抗體；還可以利用常規的細胞融合技術，準備人單克隆抗體。這些人抗體可以用于對人類疾病的預防和治療，避免動物抗體給人體帶來的過敏和副作用，促進人抗體藥物的開發。
本發明的制備方法具有下述優點簡便易行、成本低、易成功、周期短、能夠大規模制備特異的人源多克隆抗體，克服鼠源抗體人源化不足以及轉基因動物操作復雜的困難，促進人源單克隆抗體藥物的開發。(1)能夠大規模制備特異的人多克隆抗體，一方面避免直接用抗原免疫人體帶來的不適、副作用和潛在安全等風險，另一方面克服動物抗體帶來的過敏和不能滿足部分過敏體質人群的缺點；(2)能夠制備人源多克隆抗體，克服鼠源抗體人源化不足，以及轉基因動物操作復雜的困難，促進人源單克隆抗體藥物的開發。
具體實施方式下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如張龍翔、張庭芳、李令媛等人在《生化實驗方法和技術(第二版)》(北京高等教育出版社，2001)和JohnM.Walker等人在《Theproteinprotocolshandbook(secondedition)》(《蛋白質實驗手冊(第二版)》)，totowa，NewJersey，HumanaPress，2002)中所述的條件。
實施例1小鼠1的操作過程在無菌條件下用20ml的注射器抽吸斷臍后靠胎盤側的臍血(10-20ml)，然后將臍血在室溫下轉運至實驗室，在無菌條件下，將上述從醫院轉運至實驗室的臍血倒入60平方毫米大小的平皿，用注射器直接從平皿中抽取100-200ul新鮮的人臍血細胞混懸液(來自上海市第五醫院)注射于9天大小的小鼠胚胎(C57BL/6與昆明小鼠雜交后的胚胎)的囊腔內，并讓此胚胎繼續發育至新生小鼠，最后發育至成年小鼠，標記為實驗小鼠1。
免疫熒光組織化學鑒定從成年實驗小鼠1和未經過任何操作的小鼠(陰性對照)的尾中各取一滴血滴在載玻片上，做成血涂片，分別編號，用甲醇固定5分鐘，用PBS緩沖液(pH7.2～7.4，含NaCl 137mmol/L、KCl2.7mmol/L、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO41.4mmol/L)漂洗3次，用0.1％的胰蛋白酶(100ml0.1mg胰蛋白酶，含0.1％氯化鈣)于37℃消化20分鐘，再經PBS漂洗3次后，用1∶10的山羊血清于37℃封閉血涂片10分鐘；最后進行熒光抗體染色(1)滴加MouseAnti-HumanIgG(鼠抗人IgG)(γchainspecific，1∶10稀釋)第一抗體，于4℃濕盒內孵育過夜，然后用PBS充分沖洗；(2)在血涂片上滴加山羊抗鼠lgG-FITC(1∶100稀釋)第二抗體，于37℃濕盒中孵育30分鐘，然后用PBS漂洗；(3)滴加DAPI(1∶10000稀釋)，于37℃濕盒中孵育20分鐘，用PBS漂洗、晾干、封片，用熒光顯微鏡進行觀察。結果顯示實驗小鼠1出現特異性陽性信號，陰性對照小鼠未出特異性信號。
人抗體蛋白水平鑒定剪小鼠尾，取一滴血，接入1.5毫升塑料離心管中，超聲破碎，用含0.9％NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mM，pH7.2)進行稀釋至1/2、1/4和1/16，分別取0.5μl，點在硝酸纖維素膜上，空氣中涼干。用空白小鼠血液樣品作陰性對照，人血液樣品作陽性對照，經過3％牛血清白蛋白封閉，與抗人IgG抗體的小鼠抗體-辣根過氧化酶(HRP，1∶16)孵育，DAB底物顯色，結果實驗小鼠1在1/2、1/4兩個稀釋濃度，陽性對照都出現陽性信號，空白小鼠未出信號。
人抗體K鏈基因鑒定針對人的抗體的K鏈基因設計聚合酶鏈式反應引物IgGLKf-r上游引物5’-gtggctgcaccatctgtcttcatc-3’，下游引物5’-ctaacactctcccctgtt-3’；聚合酶鏈式反應反應體系(50μL)為10×superTaq緩沖液III10μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，superTaq酶(5U/μL)(申能博采，上海)0.5μL，重蒸水32μL；聚合酶鏈式反應反應條件為94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，40個循環，最后循環為95℃1min，55℃1min，72℃延伸10min。聚合酶鏈式反應產物用凝膠電泳檢測，實驗結果顯示混合人血的空白小鼠血液樣品，以及實驗小鼠1血液樣品都擴增出了長度為315bp的目標條帶，而空白小鼠血液樣品未擴增出目標條帶。
人抗體重鏈基因鑒定針對人的抗體重鏈基因設計引物，目標條帶長度127bp，上游引物5’-gactccgacggctccttcttcc-3’，下游引物5’-ggctcttctgcgtgtagtggttgt-3’；聚合酶鏈式反應反應體系(50μL)為10×Taq聚合酶緩沖液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，Taq酶(5U/μL)(賽百盛，上海)0.5μL，重蒸水37μL；聚合酶鏈式反應反應條件為94℃3min，94℃0.5min，58℃0.5min，72℃0.5min，40個循環，最后循環為95℃0.5min，58℃0.5min，72℃延伸10min。聚合酶鏈式反應產物用凝膠電泳檢測，實驗結果顯示在人血DNA樣品，含1％人血的空白小鼠血液樣品，以及實驗小鼠1血液樣品都擴增出了長度為127bp的目標條帶，而空白小鼠血液樣品未擴增出目標條帶。
實施例2小鼠2的操作過程在無菌條件下用20ml的注射器抽吸斷臍后靠胎盤側的臍血(10-20ml)，然后將臍血在室溫下轉運至實驗室，在無菌條件下，將上述從醫院轉運至實驗室的臍血倒入60平方毫米大小的平皿，用注射器直接從平皿中抽取100-200ul新鮮的人臍血細胞混懸液(來自上海市第五醫院)注射于11天大小的小鼠胚胎(C57BL/6與昆明小鼠雜交后的胚胎)的囊腔內，并讓此胚胎繼續發育至新生小鼠，最后發育至成年小鼠，標為實驗小鼠2。
免疫熒光組織化學鑒定從成年實驗小鼠2和未經過任何操作的小鼠(陰性對照)的尾中各取一滴血滴在載玻片上，做成血涂片，分別編號，用甲醇固定5分鐘，用用PBS緩沖液(pH7.2～7.4，含NaCl137mmol/L、KCl2.7mmol/L、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO41.4mmol/L)漂洗3次，用0.1％的胰蛋白酶(100ml0.1mg胰蛋白酶，含0.1％氯化鈣)于37℃消化20分鐘，再經PBS漂洗3次后，用1∶10的山羊血清于37℃封閉血涂片10分鐘，最后進行熒光抗體染色(1)滴加MouseAnti-HumanIgG(鼠抗人IgG)(γchainspecific，1∶10稀釋)第一抗體，于4℃濕盒內孵育過夜，然后用PBS充分沖洗；(2)在血涂片上滴加山羊抗鼠lgG-FITC(1∶100稀釋)第二抗體，于37℃濕盒中孵育30分鐘，然后用PBS漂洗；(3)滴加DAPI(4’，6-diamidino-2-phenylindole，4’，6-二瞇基-2-苯基吲哚)(1∶10000稀釋)，于37℃濕盒中孵育20分鐘，用PBS漂洗、晾干、封片，用熒光顯微鏡進行觀察。結果顯示實驗小鼠2出現特異性陽性信號，陰性對照小鼠未出特異性信號。
人抗體蛋白水平鑒定剪小鼠尾，取一滴血，接入1.5毫升塑料離心管中，超聲破碎，用含0.9％NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mM，pH7.2)進行稀釋至1/2、1/4、1/16，分別取0.5μl，點在硝酸纖維素膜上，空氣中涼干；用空白小鼠血液樣品作陰性對照，人血液樣品作陽性對照，經過3％牛血清白蛋白封閉，與抗人IgG抗體的小鼠抗體-辣根過氧化酶(HRP，1∶16)孵育，DAB底物顯色，結果實驗小鼠2在1/2，1/4兩個稀釋濃度，陽性對照都出現陽性信號，空白小鼠未出信號。
人抗體K鏈基因鑒定針對人的抗體的K鏈基因設計聚合酶鏈式反應引物IgGLKf-r上游引物5’-gtggctgcaccatctgtcttcatc-3’，下游引物5’-ctaacactctcccctgtt-3’；聚合酶鏈式反應反應體系(50μL)為10xsuperTaq聚合酶緩沖液bufferIII10μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，superTaq酶(5U/μL)(申能博采，上海)0.5μL，重蒸水32μL；聚合酶鏈式反應反應條件為94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，40個循環，最后循環為95℃1min，55℃1min，72℃延伸10min。聚合酶鏈式反應產物用凝膠電泳檢測，實驗結果顯示人血的空白小鼠血液樣品，以及實驗小鼠2血液樣品都擴增出了長度為315bp的目標條帶，而空白小鼠血液樣品未擴增出目標條帶。
人抗體重鏈基因鑒定針對人的抗體重鏈基因設計引物，目標條帶長度127bp，上游引物5’-gactccgacggctccttcttcc-3’，下游引物5’-ggctcttctgcgtgtagtggttgt-3’，聚合酶鏈式反應反應體系(50μL)為10xTaq聚合酶緩沖液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，Taq酶(5U/μL)(賽百盛，上海)0.5μL，重蒸水37μL，聚合酶鏈式反應反應條件為94℃3min，94℃0.5min，58℃0.5min，72℃0.5min，40個循環，最后循環為95℃0.5min，58℃0.5min，72℃延伸10min。聚合酶鏈式反應產物用凝膠電泳檢測，實驗結果顯示在人血DNA樣品，含1％人血的空白小鼠血液樣品，以及實驗小鼠2血液樣品都擴增出了長度為127bp的目標條帶，而空白小鼠血液樣品未擴增出目標條帶。
實施例3操作過程在無菌條件下用20ml的注射器抽吸斷臍后靠胎盤側的臍血(10-20ml)，然后將臍血在室溫下轉運至實驗室，在無菌條件下，將上述從醫院轉運至實驗室的臍血倒入60平方毫米大小的平皿，用注射器直接從平皿中抽取100-200ul新鮮的人臍血細胞(來自上海市第五醫院)注射于10天大小的小鼠胚胎(C57BL/6與昆明小鼠雜交后的胚胎)的囊腔內，并讓此胚胎繼續發育至新生小鼠，最后發育至成年小鼠，標為實驗小鼠3。
免疫熒光組織化學鑒定從成年實驗小鼠3和未經過任何操作的小鼠(陰性對照)的尾中各取一滴血滴在載玻片上，做成血涂片，分別編號，用甲醇固定5分鐘，用用PBS緩沖液(pH7.2～7.4，含NaCl137mmol/L、KCl2.7mmol/L、Na2HPO44.3mmol/L、KH2PO41.4mmol/L)漂洗3次，用0.1％的胰蛋白酶(100ml0.1mg胰蛋白酶，含0.1％氯化鈣)于37℃消化20分鐘，再經PBS漂洗3次后，用1∶10的山羊血清于37℃封閉血涂片10分鐘，最后進行熒光抗體染色(1)滴加MouseAnti-HumanIgG(鼠抗人IgG)(γchainspecific，1∶10稀釋)第一抗體，于4℃濕盒內孵育過夜。然后用PBS充分沖洗；(2)在血涂片上滴加山羊抗鼠lgG-FITC(1∶100稀釋)第二抗體，于37℃濕盒中孵育30分鐘，然后用PBS漂洗；(3)滴加DAPI(1∶10000稀釋)，于37℃濕盒中孵育20分鐘，用PBS漂洗、晾干、封片，用熒光顯微鏡進行觀察。結果顯示實驗小鼠3出現特異性陽性信號，陰性對照小鼠未出特異性信號。
人抗體蛋白水平鑒定剪小鼠尾，取一滴血，接入1.5毫升塑料離心管中，超聲破碎，用含0.9％NaCl的磷酸鈉緩沖液(10mM，pH7.2)稀釋至1/2、1/4、1/16，分別取0.5μl，點在硝酸纖維素膜上，空氣中涼干。用空白小鼠血液樣品作陰性對照，人血液樣品作陽性對照，經過3％牛血清白蛋白封閉，與抗人IgG抗體的小鼠抗體-辣根過氧化酶(HRP，1∶16)孵育，DAB底物顯色，結果實驗小鼠3在1/2，1/4兩個稀釋濃度，陽性對照都出現陽性信號，空白小鼠未出信號。
人抗體K鏈基因鑒定針對人的抗體的K鏈基因設計聚合酶鏈式反應引物IgGLKf-r上游引物5’-gtggctgcaccatctgtcttcatc-3’，下游引物5’-ctaacactctcccctgtt-3’；聚合酶鏈式反應反應體系(50μL)為10xsuperTaq聚合酶緩沖液III10μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，superTaq酶(5U/μL)(申能博采，上海)0.5μL，重蒸水32μL；聚合酶鏈式反應反應條件為94℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，40個循環，最后循環為95℃1min，55℃1min，72℃延伸10min，聚合酶鏈式反應產物用凝膠電泳檢測，實驗結果顯示混合人血的空白小鼠血液樣品，以及實驗小鼠3血液樣品都擴增出了長度為315bp的目標條帶，而空白小鼠血液樣品未擴增出目標條帶。
人抗體重鏈基因鑒定針對人的抗體重鏈基因設計引物，目標條帶長度127bp，上游引物5’-gactccgacggctccttcttcc-3’，下游引物5’-ggctcttctgcgtgtagtggttgt-3’。聚合酶鏈式反應反應體系(50μL)為10xTaq聚合酶緩沖液5μL，MgCl2(25mmol/L)4μL，dNTPs(10mmol/L)1.5μL，上游引物和引物下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，Taq酶(5U/μL)(賽百盛，上海)0.5μL，重蒸水37μL；聚合酶鏈式反應反應條件為94℃3min，94℃0.5min，58℃0.5min，72℃0.5min，40個循環，最后循環為95℃0.5min，58℃0.5min，72℃延伸10min。聚合酶鏈式反應產物用凝膠電泳檢測，實驗結果顯示在人血DNA樣品，含1％人血的空白小鼠血液樣品，以及實驗小鼠3血液樣品都擴增出了長度為127bp的目標條帶，而空白小鼠血液樣品未擴增出目標條帶。
權利要求
1.一種嵌合動物的制備方法，其特征在于，具體步驟包括①準備新鮮的人臍血細胞首先在無菌條件下用注射器抽吸斷臍后靠胎盤側的臍血，然后將臍血在室溫下轉運至實驗室；②注射于早期的動物胚胎囊腔內在無菌條件下，用注射器將上述轉運至實驗室的臍血注射于早期小鼠胚胎囊腔內；③使注射后的早期小鼠胚胎繼續發育至新生動物，最后發育至成年小鼠對孕有注射后胚胎的小鼠進行飼養，直至生出小鼠后代，然后使該小鼠后代發育為成年小鼠。
2.根據權利要求
1所述的嵌合動物的制備方法，其特征是，步驟①中，所述的以注射器抽吸斷臍后靠胎盤側的臍血，抽吸的體積為10-20ml。
3.根據權利要求
1所述的嵌合動物的制備方法，其特征是，步驟②中，所述的用注射器將上述轉運至實驗室的臍血注射于早期小鼠胚胎囊腔內，注射的臍血為100-200ul。
4.根據權利要求
1所述的嵌合動物的制備方法，其特征是，步驟②中，所述的早期小鼠胚胎，是指9-11天大小的小鼠胚胎。
專利摘要
一種嵌合動物的制備方法，屬于生物工程技術領域：
。本發明方法具體步驟包括①準備新鮮的人臍血細胞首先在無菌條件下用注射器抽吸斷臍后靠胎盤側的臍血，然后將臍血在室溫下轉運至實驗室；②注射于早期的動物胚胎囊腔內在無菌條件下，用注射器將上述轉運至實驗室的臍血注射于早期小鼠胚胎囊腔內；③使注射后的早期小鼠胚胎繼續發育至新生動物，最后發育至成年小鼠對孕有注射后胚胎的小鼠進行飼養，直至生出小鼠后代，然后使該小鼠后代發育為成年小鼠。本發明方法簡便易行、成本低、易成功、周期短、能夠大規模制備特異的人源多克隆抗體，可克服鼠源抗體人源化不足以及轉基因動物操作復雜的困難，促進人源單克隆抗體藥物的開發。
文檔編號A01K67/027GK1994073SQ200610148227
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月28日
發明者吳際, 李榮秀 申請人:上海交通大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan