專利名稱:一種評估pc12細胞的神經元樣分化程度的裝置及方法
技術領域：
本發明屬于評估細胞分化程度領域，尤其是一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置及方法，特別是指從活體細胞的結構和功能兩方面綜合評估PC12細胞的神經元樣分化，更具體的說，是基于PC12細胞在神經生長因子(NGF)持續誘導分化作用下表現出不斷變化的表面微形貌及電生理特征，采用探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡技術 (HPICM)以及與其結合的膜片鉗技術，通過鑒定其相應的結構和功能特征參數來評估PC12 細胞的神經元樣分化程度的方法。
背景技術：
PC12細胞是大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，與神經元細胞在發生學上均來源于神經脊，經神經生長因子(NGF)誘導分化后在結構、功能上與類交感神經元細胞有很多相似之處，又相對易于培養，實踐中普遍將PC12細胞用作研究神經元的細胞模型，因此，準確鑒定 PC12細胞的神經元樣分化程度對于建立良好的神經元研究模型具有基礎性的重要意義。
NGF誘導PC12細胞分化過程主要體現在三個方面的變化胞體微形貌的變化、神經突起的生長和電興奮性的改變，而且這三方面的變化在神經細胞分化過程中又起到基礎性作用。眾所周知，在神經細胞分化過程中，離子通道對于細胞膜形貌變化和神經突起的生長起到關鍵性作用，其中鉀離子對于神經突起的生長更為重要。另外，神經元電興奮性取決于電壓敏感性Na+、K+通道的表達和功能的發揮，其興奮性發育的關鍵是河豚毒素(TTX)敏感型Na+通道，而NGF可上調PC12細胞中上述Na+、K+通道的表達。
目前，常用的評估PC12細胞神經元樣分化程度的方法主要有兩種一、在普通光學顯微鏡下觀察細胞胞體的變化和神經突起的生長狀態，普遍認為胞體變大，神經突起數量增多、長度增加、相互交錯，進而形成類神經網絡結構，是PC12細胞達到高度分化的標志；但這種評估更多的借助于經驗的積累，缺乏定量判斷依據。二、利用膜片鉗技術獲得 PC12細胞表面Na+、K+通道的信息，大量試驗證實神經元樣PC12細胞的細胞膜上有功能性電壓門控K+通道和TTX敏感型Na+通道，而且，PC12細胞經NGF作用時間越長，細胞分化程度越高，其TTX敏感型Na+電流越大。但是，只有70-80%的神經元樣PC12細胞符合這種規律。因此，將兩種手段結合起來，對NGF誘導分化作用下的PC12細胞胞體微形貌的變化、神經突起的生長狀態和電興奮性的改變進行定性定量的綜合分析可以更加準確地評估PC12 細胞的神經元樣分化程度。
然而，利用普通光學顯微鏡觀察細胞微形貌的變化和神經突起的生長狀態受到光學衍射極限的限制，其分辨率有限。為了保證既能觀察到活體細胞又不會損傷柔軟的細胞表面以免影響后續的膜片鉗實驗，掃描探針顯微鏡(SPM)技術是很好的選擇，其中，非接觸式掃描離子電導顯微鏡(SICM)無疑比接觸式的原子力顯微鏡(AFM)更具有優勢。然而，對于連續負反饋控制模式下的SICM而言，很難對垂直高度變化比較劇烈的神經元樣PC12細胞進行高分辨率地掃描成像。
發明內容
本發明的目的在于提供一種從結構和功能上綜合評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置及方法，它針對現階段常用的評估PC12細胞神經元樣分化程度方法的不足， 利用探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡技術(HPICM)以及與其結合的膜片鉗技術在活體 PC12細胞上對其神經元樣分化程度進行更加準確的評估。
本發明的技術方案一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于它是由在生理液態培養條件下非接觸式、高分辨率對活體生物樣品表面微結構進行探測的探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡HPICM，以及從功能上對經NGF誘導向神經元分化的 PC12細胞電興奮性進行評估的膜片鉗系統兩個部分構成的裝置；所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內浸于電解液中的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、內含細胞與細胞培養液的培養皿、HPICM掃描控制系統、Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺、膜片鉗放大器、數模/模數轉換器及計算機控制系統；所述充滿電解液的玻璃微探針的尖端和參比Ag/AgCl電極均置于培養皿的細胞培養液中；所述充滿電解液的玻璃微探針裝于Z向HPICM掃描探頭上；所述置于玻璃微探針內浸于電解液中的Ag/AgCl電極分別與膜片鉗放大器和HPICM掃描控制系統連接；所述參比Ag/AgCl電極與膜片鉗放大器連接；所述數模/模數轉換器分別于與膜片鉗放大器和計算機控制系統連接；所述Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺分別與HPICM掃描控制系統連接；所述HPICM掃描控制系統與計算機控制系統連接。
所述玻璃微探針均由硼硅酸鹽微電極玻璃毛細管經程控水平激光微電極拉制儀拉制而成，其中用于探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡的玻璃微探針要求尖端內壁直徑 50nm,電阻 150ΜΩ ；用于膜片鉗的玻璃微探針要求電阻3 6ΜΩ。
所述HPICM掃描控制系統、Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺采用英國 Ionscope公司的ICnano SICM掃描離子電導顯微鏡系統；所述ICnano SICM掃描離子電導顯微鏡系統自帶的圖像處理軟件SICM Image Viewer裝于計算機控制系統中。
所述膜片鉗放大器采用商用美國Axon膜片鉗Multiclamp 700B放大器。
所述數模/模數轉換器采用美國Molecular Device公司的Digidata 1440A數模 /模數轉換器。
所述計算機控制系統中安裝有膜片鉗系統的數據采集軟件；所述膜片鉗系統的數據采集軟件采用Clampex 10. 2數據采集及Origin 8. O分析軟件。
所述觀測細胞表面微結構時，細胞所處的細胞培養液為L15培養基，玻璃微探針內充灌的電解液亦為L15培養基；記錄離子通道電流時，細胞所處的細胞培養液是PC12細胞外液，玻璃微探針內充灌的電解液是PC12細胞內液。
一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的方法，其特征在于它包括以下步驟
(1)得到適合于利用HPICM技術觀測PC12細胞微形貌的玻璃微探針將由硼硅酸鹽玻璃毛細管拉制的玻璃微探針內充灌L15培養基，并裝于Z向HPICM掃描探頭上，玻璃微探針內置有Ag/AgCl電極；玻璃微探針的尖端和參比Ag/AgCl電極浸于PC12細胞的細胞培養液L15培養基中；通過膜片鉗技術測量玻璃微探針的電阻，選用阻值 150ΜΩ的微探針用于后續掃描；
(2)利用HPICM技術對NGF誘導分化不同時間點的活體神經元樣PC12細胞表面形貌進行掃描成像通過HPICM掃描軟件設定掃描參數，以HPICM掃描控制系統監控流入玻璃微探針電流的微小變化，控制玻璃微探針的跳躍狀態，記錄下在各個成像點流入微探針的電流減小到設定值時微探針的位置，即為活體神經元樣PC12細胞的表面三維拓撲結構；細胞的環境浴液和玻璃微探針的內液均為L15培養基；
(3)利用HPICM系統自帶的圖像處理軟件SICM Image Viewer掃描成像進行分析， 得到各個PC12細胞胞體體積Volume、細胞膜表面粗糙度RMS、細胞膜表面積kurf，然后統計分析NGF誘導分化不同時間的PC12細胞的這些形貌數據，得到NGF誘導分化不同時間的 PC12細胞胞體體積、細胞膜表面粗糙度、細胞膜表面積的差異性；這種差異性可作為從結構方面評估PC12細胞神經元樣分化的參考依據；
(4)得到適合于利用膜片鉗技術進行全細胞記錄的玻璃微探針充灌有PC12細胞內液的玻璃微探針裝于Z向HPICM掃描探頭上，玻璃微探針內內置有Ag/AgCl電極；玻璃微探針的尖端、參比Ag/AgCl電極和活體神經元樣PC12細胞都浸于PC12細胞外液中；也通過膜片鉗技術來測量此玻璃微探針的電阻，選用阻值3 6ΜΩ用于后續離子通道電流的記錄；
(5)利用膜片鉗技術在生理條件下記錄活體神經元樣PC12細胞的離子通道電流 玻璃微探針針尖進入PC12細胞外液后先補償玻璃微探針的電阻和電容，然后利用HPICM掃描控制系統將玻璃微探針準確定位于細胞胞體上的實驗位置，關閉HPICM掃描控制系統， 手動控制玻璃微探針以豎直方向緩慢接近細胞胞體，在接近過程中利用膜片鉗系統的數據采集軟件Clampex 10. 2持續監測電阻的變化，通過調整玻璃微探針的位置和微探針內的壓力使電阻達到GQ即形成高阻抗封接；通過膜片鉗記錄軟件中ZAP功能或人工吮吸將玻璃微探針鉗制的膜片打破，形成全細胞記錄模式；補償串聯電阻后，通過Clampex 10.2中預設的記錄方法protocol，即可記錄到生理條件下PC12細胞的離子通道電流；
(6)利用PC12細胞的離子通道電流計算出其對應的內向電流和電流密度，統計分析NGF誘導分化不同時間的PC12細胞的離子通道電流、內向電流和電流密度，得到隨著NGF 誘導分化時間的延長PC12細胞細胞膜離子通道電流、內向電流和電流密度的變化趨勢，以及不同時間點的差異性；這種變化趨勢和差異性可作為從功能方面評估PC12細胞神經元樣分化的參考依據。
本發明的優越性1、利用HPICM技術與膜片鉗技術相結合的手段可操作性強，能更加準確的從結構和功能兩方面來定性定量的綜合分析評估PC12細胞的神經元樣分化程度；2、探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡HPICM用于在活體細胞上觀測PC12細胞經NGF 誘導分化不同時間后胞體表面微形貌的變化和神經突起的生長狀態；膜片鉗系統用于記錄經NGF誘導分化后PC12細胞離子通道電流的變化；3、探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡 (HPICM)技術是由掃描離子電導顯微鏡(SICM)技術改進而來，它不僅秉承了 SICM的可直接在液態生理培養條件下非接觸式、高分辨率地探測活體生物樣品表面三維微觀結構的優點，而且克服了傳統SICM連續負反饋控制掃描模式的不足，實現了對高度急劇變化且表面形態復雜的活體生物樣品的納米尺度高分辨率掃描成像；這就為在生理條件下、非接觸式、 高分辨率觀察神經元樣PC12細胞提供了更理想的技術手段，同時，由于HPICM良好的開放性使得它可以與膜片鉗技術相結合，能夠對NGF誘導分化作用下PC12細胞胞體微形貌的變化、神經突起的生長狀態和電興奮性的改變進行綜合分析，從而使得在活體細胞上從結構和功能兩方面共同探討PC12細胞的神經元樣分化程度成為可能。
圖1為PC12細胞未經NGF誘導分化(control)、誘導分化3天(NGF 3d)、誘導分化6天(NGF 6d)、誘導分化9天(NGF 9d)的探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡(HPICM)成像，A組為單個PC12細胞的掃描成像，B組為與A組對應的PC12細胞表面中心IOXlOym 的高分辨率掃描成像。
圖2 為 NGF 誘導分化 3 天(NGF 3d)、6 天(NGF 6d)、9 天(NGF 9d)的 PC12 細胞的胞體體積(Volume)、細胞膜表面粗糙度(RMS)、細胞膜表面積(Ssurf)的統計分析結果(* 表示兩者差異明顯P < 0. 005，NS表示兩者差異不明顯)。
圖3為PC12細胞未經NGF誘導分化(control)、誘導分化3天(NGF 3d)、誘導分化6天(NGF 6d)、誘導分化9天(NGF 9d)的全細胞膜片鉗記錄，其中A組為PC12細胞在全細胞記錄模式下的離子通道電流圖，B為全細胞記錄時預設的protocol，C和D分別為NGF 誘導分化3天(NGF 3d)、6天(NGF 6d)、9天(NGF 9d)的PC12細胞的內向電流和電流密度的統計分析結果。
圖4為本發明所涉結合運用探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡技術(HPICM)與膜片鉗技術評估PC12細胞神經元樣分化程度的裝置結構示意圖。
具體實施方式
實施例一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置(見圖4)，其特征在于它是由在生理液態培養條件下非接觸式、高分辨率對活體生物樣品表面微結構進行探測的探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡HPICM，以及從功能上對NGF誘導分化的PC12細胞電興奮性進行評估的膜片鉗系統兩個部分構成的裝置；所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內浸于電解液中的Ag/AgCl電極、參比Ag/AgCl電極、內含細胞與細胞培養液的培養皿、HPICM掃描控制系統、Z向HPICM 掃描探頭、XY向HPICM掃描臺、膜片鉗放大器、數模/模數轉換器及計算機控制系統；所述充滿電解液的玻璃微探針的尖端和參比Ag/AgCl電極均置于培養皿的細胞培養液中；所述充滿電解液的玻璃微探針裝于Z向HPICM掃描探頭上；所述置于玻璃微探針內浸于電解液中的Ag/AgCl電極分別與膜片鉗放大器和HPICM掃描控制系統連接；所述參比Ag/AgCl電極與膜片鉗放大器連接；所述數模/模數轉換器分別于與膜片鉗放大器和計算機控制系統連接；所述Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺分別與HPICM掃描控制系統連接；所述 HPICM掃描控制系統與計算機控制系統連接。
所述玻璃微探針均由硼硅酸鹽微電極玻璃毛細管經程控水平激光微電極拉制儀拉制而成，其中用于探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡的玻璃微探針要求尖端內壁直徑 50nm,電阻 150ΜΩ ；用于膜片鉗的玻璃微探針要求電阻3 6ΜΩ。
所述HPICM掃描控制系統、Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺采用英國 Ionscope公司的ICnano SICM掃描離子電導顯微鏡系統；所述ICnano SICM掃描離子電導顯微鏡系統自帶的圖像處理軟件SICM Image Viewer裝于計算機控制系統中。
所述膜片鉗放大器采用商用美國Axon膜片鉗Multiclamp 700B放大器。[0030]所述數模/模數轉換器采用美國Molecular Device公司的Digidata 1440A數模
/模數轉換器。
所述計算機控制系統中安裝有膜片鉗系統的數據采集軟件；所述膜片鉗系統的數據采集軟件采用Clampex 10. 2數據采集及Origin 8. 0分析軟件。
所述觀測細胞表面微結構時，細胞所處的細胞培養液為L15培養基，玻璃微探針內充灌的電解液亦為L15培養基；記錄離子通道電流時，細胞所處的細胞培養液是PC12細胞外液，玻璃微探針內充灌的電解液是PC12細胞內液。
一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的方法
以NGF誘導分化處理前后的PC12細胞作為評估對象。將PC12細胞于35mm培養皿中培養2天，無血清同步化處理1天，此后加入50ng/ml NGF 2. 5S進行誘導分化，每2天換一次液。分別選取NGF誘導分化前、誘導分化3天、誘導分化6天、誘導分化9天的PC12 細胞進行結構和功能的綜合鑒定。
利用HPICM技術觀測細胞表面形貌變化時，將細胞置于室溫下L15培養基中；選取充灌有L15培養基、阻值 150M Ω、內徑 50nm的玻璃微探針作為掃描用探針；通過 HPICM掃描軟件設定好掃描參數后，首先手動控制玻璃微探針接近掃描區域，距離很近時設定探針以6ym/s的速度自動接近掃描位點，同時監控玻璃微探針的跳動和流入玻璃微探針電流的變化，以保證探針穩定接近，接近完成后即可開始對PC12細胞進行掃描成像 (見圖1A)。運用HPICM的zoom-in功能在得到的PC12細胞成像圖上選取胞體表面中心 IOXlOym的區域進行高分辨率掃描成像(見圖1B)。利用SICM Image Viewer分析軟件對掃描成像進行分析，得到NGF誘導分化不同時間點的PC12細胞胞體體積(Volume)、細胞膜表面粗糙度(冊幻、細胞膜表面積(kurf)的數據，用Origin 8. 0軟件進行統計分析(見圖2)。
利用膜片鉗技術觀測細胞電興奮性的變化時，將PC12細胞浸潤于PC12細胞外液中，將阻值3 6ΜΩ、充灌有PC12細胞內液的玻璃微探針作為膜片鉗用探針；利用HPICM控制系統將探針準確定位于細胞胞體上，手動控制探針以垂直方向逐步接近PC12細胞表面， 接近過程中利用膜片鉗系統的數據采集軟件ClampexlO. 2持續監測電阻的變化，直至電阻達到GQ即形成高阻抗封接。通過膜片鉗記錄軟件中ZAP功能或人工吮吸將玻璃微探針鉗制的膜片打破，此時形成全細胞記錄模式。實驗中鉗制電位為_70mV，采樣頻率為10kHz，低通濾波頻率為2kHz，在Clampex 10. 2中設置的protocol見圖!3B，補償串聯電阻后即可記錄NGF誘導分化不同時間點的PC12細胞的離子通道電流(見圖3A)，用Origin 8. 0軟件對內向電流和電流密度進行統計分析(見圖3C、3D)。
根據得到的未經NGF誘導分化(control)、誘導分化3天(NGF 3d)、誘導分化6 天(NGF 6d)、誘導分化9天(NGF 9d)的PC12細胞胞體體積(Volume)、細胞膜表面粗糙度 (RMS)、細胞膜表面積(Ssurf)、離子通道電流、內向電流和電流密度的記錄和統計數據，以此作為判斷依據可以從結構和功能兩方面綜合評估NGF誘導分化的PC12細胞的神經元樣分化程度。
以上對本發明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例， 不能被認為用于限定本發明的實施范圍。凡依本發明申請范圍所作的均等變化與改進等， 均應仍歸屬于本發明專利的涵蓋范圍之內。
權利要求
1.一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于它是由在生理液態培養條件下非接觸式、高分辨率對活體生物樣品表面微結構進行探測的探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡HPICM，以及從功能上對經NGF誘導向神經元分化的PC12細胞電興奮性進行評估的膜片鉗系統兩個部分構成的裝置；所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置包括充滿電解液的玻璃微探針、置于玻璃微探針內浸于電解液中的Ag/AgCl電極、 參比Ag/AgCl電極、內含細胞與細胞培養液的培養皿、HPICM掃描控制系統、Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺、膜片鉗放大器、數模/模數轉換器及計算機控制系統；所述充滿電解液的玻璃微探針的尖端和參比Ag/AgCl電極均置于培養皿的細胞培養液中；所述充滿電解液的玻璃微探針裝于Z向HPICM掃描探頭上；所述置于玻璃微探針內浸于電解液中的Ag/AgCl電極分別與膜片鉗放大器和HPICM掃描控制系統連接；所述參比Ag/AgCl電極與膜片鉗放大器連接；所述數模/模數轉換器分別于與膜片鉗放大器和計算機控制系統連接；所述Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺分別與HPICM掃描控制系統連接；所述 HPICM掃描控制系統與計算機控制系統連接。
2.根據權利要求
1所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于所述玻璃微探針均由硼硅酸鹽微電極玻璃毛細管經程控水平激光微電極拉制儀拉制而成，其中用于探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡的玻璃微探針要求尖端內壁直徑 50nm，電阻 150ΜΩ ；用于膜片鉗的玻璃微探針要求電阻3 6ΜΩ。
3.根據權利要求
1所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于所述HPICM掃描控制系統、Z向HPICM掃描探頭、XY向HPICM掃描臺采用英國Ionscope公司的ICnano SICM掃描離子電導顯微鏡系統；所述ICnano SICM掃描離子電導顯微鏡系統自帶的圖像處理軟件SICM Image Viewer裝于計算機控制系統中。
4.根據權利要求
1所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于所述膜片鉗放大器采用商用美國Axon膜片鉗Multiclamp 700B放大器。
5.根據權利要求
1所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于所述數模/模數轉換器采用美國MolecularDevice公司的Digidata 1440A數模/模數轉換器ο
6.根據權利要求
1所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于所述計算機控制系統中安裝有膜片鉗系統的數據采集軟件；所述膜片鉗系統的數據采集軟件采用Clampex 10. 2數據采集及Origin 8. O分析軟件。
7.根據權利要求
1所述一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，其特征在于所述觀測細胞表面微結構時，細胞所處的細胞培養液為L15培養基，玻璃微探針內充灌的電解液亦為L15培養基；記錄離子通道電流時，細胞所處的細胞培養液是PC12細胞外液，玻璃微探針內充灌的電解液是PCl2細胞內液。
8.一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)得到適合于利用HPICM技術觀測PC12細胞微形貌的玻璃微探針將由硼硅酸鹽玻璃毛細管拉制的玻璃微探針內充灌L15培養基，并裝于Z向HPICM掃描探頭上，玻璃微探針內置有Ag/AgCl電極；玻璃微探針的尖端和參比Ag/AgCl電極浸于PC12細胞的細胞培養液 L15培養基中；通過膜片鉗技術測量玻璃微探針的電阻，選用阻值 150ΜΩ的微探針用于后續掃描；(2)利用HPICM技術對NGF誘導分化不同時間點的活體神經元樣PC12細胞表面形貌進行掃描成像通過HPICM掃描軟件設定掃描參數，以HPICM掃描控制系統監控流入玻璃微探針電流的微小變化，控制玻璃微探針的跳躍狀態，記錄下在各個成像點流入微探針的電流減小到設定值時微探針的位置，即為活體神經元樣PC12細胞的表面三維拓撲結構；細胞的環境浴液和玻璃微探針的內液均為L15培養基；(3)利用HPICM系統自帶的圖像處理軟件SICMImage Viewer掃描成像進行分析，得到各個PC12細胞胞體體積Volume、細胞膜表面粗糙度RMS、細胞膜表面積kurf，然后統計分析NGF誘導分化不同時間的PC12細胞的這些形貌數據，得到NGF誘導分化不同時間的PC12 細胞胞體體積、細胞膜表面粗糙度、細胞膜表面積的差異性；這種差異性可作為從結構方面評估PC12細胞神經元樣分化的參考依據；(4)得到適合于利用膜片鉗技術進行全細胞記錄的玻璃微探針充灌有PC12細胞內液的玻璃微探針裝于Z向HPICM掃描探頭上，玻璃微探針內內置有Ag/AgCl電極；玻璃微探針的尖端、參比Ag/AgCl電極和活體神經元樣PC12細胞都浸于PC12細胞外液中；也通過膜片鉗技術來測量此玻璃微探針的電阻，選用阻值3 6ΜΩ用于后續離子通道電流的記錄；(5)利用膜片鉗技術在生理條件下記錄活體神經元樣PC12細胞的離子通道電流玻璃微探針針尖進入PC12細胞外液后先補償玻璃微探針的電阻和電容，然后利用HPICM掃描控制系統將玻璃微探針準確定位于細胞胞體上的實驗位置，關閉HPICM掃描控制系統，手動控制玻璃微探針以豎直方向緩慢接近細胞胞體，在接近過程中利用膜片鉗系統的數據采集軟件Clampex 10. 2持續監測電阻的變化，通過調整玻璃微探針的位置和微探針內的壓力使電阻達到GQ即形成高阻抗封接；通過膜片鉗記錄軟件中ZAP功能或人工吮吸將玻璃微探針鉗制的膜片打破，形成全細胞記錄模式；補償串聯電阻后，通過Clampex 10. 2中預設的記錄方法protocol，即可記錄到生理條件下PC12細胞的離子通道電流；(6)利用PC12細胞的離子通道電流計算出其對應的內向電流和電流密度，統計分析 NGF誘導分化不同時間的PC12細胞的離子通道電流、內向電流和電流密度，得到隨著NGF誘導分化時間的延長PC12細胞細胞膜離子通道電流、內向電流和電流密度的變化趨勢，以及不同時間點的差異性；這種變化趨勢和差異性可作為從功能方面評估PC12細胞神經元樣分化的參考依據。
專利摘要
一種評估PC12細胞的神經元樣分化程度的裝置，由探針跳躍模式掃描離子電導顯微鏡HPICM，以及膜片鉗系統兩個部分構成的裝置；評估方法得到適合于利用HPICM技術觀測PC12細胞微形貌的玻璃微探針；利用HPICM技術對NGF誘導分化不同時間點的活體神經元樣PC12細胞表面形貌進行掃描成像；利用HPICM系統自帶的圖像處理軟件掃描成像進行分析；得到適合于利用膜片鉗技術進行全細胞記錄的玻璃微探針；利用膜片鉗技術在生理條件下記錄活體神經元樣PC12細胞的離子通道電流；利用PC12細胞的離子通道電流計算出其對應的內向電流和電流密度。優越性利用HPICM技術與膜片鉗技術相結合的手段可操作性強，能更加準確的從結構和功能兩方面來定性定量的綜合分析評估PC12細胞的神經元樣分化程度。
文檔編號G01Q60/44GKCN102353818SQ201110164434
公開日2012年2月15日 申請日期2011年6月23日
發明者劉曉, 張彥軍 申請人:國家納米技術與工程研究院導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan