一種己烯雌酚的血紅蛋白催化化學發光酶聯免疫檢測方法與流程

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種己烯雌酚的血紅蛋白催化化學發光酶聯免疫檢測方法。

背景技術：

隨著現代社會的迅猛發展，人們的物質生活水平顯著提高，隨之食品安全問題也越來越頻發。隨著現代的畜牧業逐步向集約化和規模化的方向發展，養殖戶為了降低動物的發病率和死亡率、提高飼料利用率、促進動物生長、縮短動物飼養周期等，獸藥及飼料添加劑在畜牧業生產中得到了廣泛的應用。然而過量使用的獸藥通過食物鏈對人體產生危害，如產生毒性反應、耐藥菌株產生、過敏反應、腸道菌群失調、影響生態環境和畜牧業健康發展等，所以必須嚴格控制獸藥的用量。

己烯雌酚(diethylstilbestrol，des)是人工合成的非甾體類雌激素，于1938年首次在英國一家實驗室人工合成，能產生與天然雌二醇相同的所有藥理與治療作用。des在獸醫臨床上主要用于發情不明顯動物的催情，還可用來治療胎衣不下、排出死胎，治療子宮炎等。另外，des在促進動物蛋白質的合成代謝，提高動物日增重和減少脂肪等方面的效果明顯，因此被廣泛用于豬、牛、羊、雞和水產品等的飼料中。

20世紀70年代末，大量的調查和研究報告表明des是一種致癌物質，會對人體健康產生嚴重危害，甚至可誘發人體產生癌變，而且在環境中降解慢，能夠在生物體中富集形成嚴重殘留，并通過食物鏈引發動物和人的癌變，引起少兒的發育早熟以及男性女性化。

隨著人們逐漸認識到高度殘留的雌激素會對人體產生潛在的致畸、致癌等危害，歐盟、美國、中國等國家從20世紀70年代末開始重視雌激素的殘留及危害問題，并先后頒布禁令，將des等合成性激素列為禁用獸藥。1999年我國開始實施殘留監控計劃，計劃中規定des為禁用獸藥。2002年中華人民共和國農業部公告修訂的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規定，對des及鹽、酯在在所有可食組織中要求不得檢出。然而，由于強大經濟利益的驅使，違法使用合成雌激素的現象依然存在，仍有不少養殖用戶違禁使用des，生產的動物及動物性食品嚴重危害消費者的身心健康。因此對動物及動物性食品進行des殘留監控是保證動物性食品安全的關鍵手段。

在des殘留檢測方法中，最早采用的是生物測定法和分光光度比色測定法。目前國外文獻報道用于檢測des殘留檢測的方法很多，其主要有氣相色譜法、氣-質聯用、高效液相色譜法、液-質聯用、毛細管電泳法、放射免疫法和酶聯免疫吸附法(elisa)等。酶聯免疫吸附法(elisa)以酶或輔酶為標記物標記抗原或抗體，在合適的載體上，與相應的抗體或抗原進行特異性吸附，形成抗體抗原復合物，用酶促反應的放大作用來顯示初級免疫學反應。elisa法是目前檢測動物性食品中des殘留的首選方法，它將酶促反應的高效率和免疫反應的高度專一性有機地結合起來，可對生物體內各種微量有機物的含量進行定量測定，是目前靈敏度高、適應性強、最有希望在生產和臨床中推廣應用的免疫測定技術。該方法已用于水產品中des的殘留檢測，目前已有多家公司的des檢測試劑盒上市，如德國拜發公司、荷蘭ed公司、英國randox公司等。化學發光免疫分析法集靈敏的化學發光分析和特異的免疫測定于一體，其以快速、敏感、特異等優勢可與放射免疫測定相媲美，又以其試劑無毒、安全穩定而優于后者，是一種很有發展前途的檢測技術。

已經上市的化學發光免疫分析法試劑盒通常選擇辣根過氧化物酶來標記抗原或抗體。該酶價格高且多數不穩定，所以有必要開發一種新物質，來模擬酶的天然結構的生物特性，以達到廉價、穩定、高催化活性檢測des的目的。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種己烯雌酚的血紅蛋白催化化學發光酶聯免疫檢測方法，模擬酶的天然結構的生物特性，可以廉價、穩定、高催化活性檢測des含量。

本發明提供了一種己烯雌酚的血紅蛋白催化化學發光酶聯免疫檢測方法，包括以下步驟：

s1，己烯雌酚人工抗原的合成

s11，己烯雌酚單羧基丙基醚的制備

將己烯雌酚溶于二甲基亞砜中，氮氣保護下加入碘化鉀和4-氯丁酸乙酯，其中，己烯雌酚：二甲基亞砜：碘化鉀：4-氯丁酸乙酯的比例為50mg：3ml：1-2mg：1-2ml，避光、70-80℃加熱回流，反應24h后，用乙酸乙酯萃取，收集上層溶液，干燥后得到固態物質；向固態物質中加入乙醇使之完全溶解，然后滴加2.0mol/l氫氧化鈉溶液，其中，乙醇與氫氧化鈉溶液的體積比例是2:1，反應3h后，調節ph至3-4；加入乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯與乙醇的體積比例是10:1，收集上層溶液，經冷凍干燥后得到己烯雌酚單羧基丙基醚，備用；

s12，己烯雌酚人工抗原的合成

將己烯雌酚單羧基丙基醚溶解在二甲基亞砜中，加入n-羥基丁二酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，其中，己烯雌酚單羧基丙基醚：二甲基亞砜：n-羥基丁二酰亞胺：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽＝50mg：2ml：35mg：40mg，30℃條件下攪拌反應10h，得到抗原溶液；

將牛血清蛋白溶解于ph7.4的0.01mol/lpbs緩沖液中，其中，牛血清蛋白：pbs緩沖液的比例為30mg：1ml，得到血清蛋白溶液；

將所述血清蛋白溶液加入到所述抗原溶液中，血清蛋白溶液中血清蛋白和抗原溶液中己烯雌酚單羧基丙基醚的質量比例為3:1，反應12h，然后調ph至8.5，4℃攪拌過夜，然后將得到的反應液在0.01mol/l、ph7.4的pbs緩沖液中透析72h，使用的透析袋的截留分子量為15000da，透析結束后，透析袋內透析液冷凍干燥，得到己烯雌酚人工抗原，備用；

s2，己烯雌酚抗體的制備

利用細胞融合技術將b淋巴細胞和骨髓瘤細胞進行融合，篩選出分泌特異性抗體的雜交瘤細胞，通過擴大培養雜交瘤細胞，制備己烯雌酚抗體；

s3，己烯雌酚酶標抗原的合成

向二甲基亞砜中分別加入己烯雌酚人工抗原、二環己基碳二亞胺和n-羥基丁二酰亞胺，在25℃避光反應12h，然后離心棄沉淀，將混合物的上清液于4℃保存；

將牛血紅蛋白溶解于0.01mol/l的ph7.4的pbs緩沖液中，逐滴加入4℃保存的混合物的上清液，4℃攪拌反應6h，然后將得到的混合液冷凍干燥，得到己烯雌酚酶標抗原；

s4，己烯雌酚elisa分析

利用所述己烯雌酚抗體、己烯雌酚酶標抗原對待測樣品進行酶聯免疫檢測，獲得測試樣品中的己烯雌酚含量。

優選的，上述己烯雌酚的血紅蛋白催化化學發光酶聯免疫檢測方法，s11中，己烯雌酚：二甲基亞砜：碘化鉀：4-氯丁酸乙酯的比例為50mg：3ml：1mg：1ml。

優選的，上述己烯雌酚的血紅蛋白催化化學發光酶聯免疫檢測方法，s11、s12、s3中，所述冷凍干燥的條件均是-20℃、真空度30pa。

優選的，上述己烯雌酚的血紅蛋白催化化學發光酶聯免疫檢測方法，s3中，向3ml二甲基亞砜中分別加入50mg己烯雌酚人工抗原、30mg二環己基碳二亞胺和30mgn-羥基丁二酰亞胺，在25℃避光反應12h，然后1200r/min離心5min棄沉淀，將混合物的上清液于4℃保存；

將100mg牛血紅蛋白溶解于5ml0.01mol/l的ph7.4的pbs緩沖液中，逐滴加入4℃保存的混合物的的上清液，4℃攪拌反應6h，然后將得到的混合液冷凍干燥，得到己烯雌酚酶標抗原。

優選的，上述己烯雌酚的血紅蛋白催化化學發光酶聯免疫檢測方法，所述己烯雌酚elisa分析具體包括：

(1)包被：將己烯雌酚抗體用0.04mol/lph9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至濃度為5μg/ml，加到酶標板上，每孔100μl，在37℃孵育2.0h，取出后用洗滌液清洗酶標板3次；

(2)封閉：每孔加入100μl的封閉液，25℃孵育2.5h后，然后用洗滌液清洗酶標板3次；

(3)加標準品：在步驟(2)的酶標板中，選取若干孔作為標準對照孔，其中1孔為空白對照，加入100μl超純水，其余每孔均加入己烯雌酚標準溶液50μl和己烯雌酚酶標抗原50μl，37℃孵育2h，取出后用洗滌液清洗酶標板3次，其中不同的標準對照孔加入不同濃度的己烯雌酚標準溶液；

(4)加實際樣品：在步驟(2)的酶標板中，選取另外的若干孔作為樣品孔，其中1孔為空白樣品，加入100μl超純水，其余每孔均加入待測樣品溶液50μl、己烯雌酚酶標抗原50μl，37℃孵育2h，取出后用洗滌液清洗酶標板3次；

(5)發光：每孔加入顯色劑，37℃孵育40min；

(6)終止：加終止液終止反應；

(7)測定：在420nm波長測定各孔發光值，記錄不同標準對照孔的發光值，并繪制標準曲線，最后根據標準曲線計算待測樣品溶液中己烯雌酚的濃度。

本發明還提供了一種上述方法使用的試劑盒，其特征在于，包括己烯雌酚抗體、0.04mol/lph9.6碳酸鹽緩沖液、洗滌液、封閉液、己烯雌酚酶標抗原、顯色劑和終止液。

優選的，上述試劑盒中，每100ml洗滌液中有99.95ml的0.01mol/lph9.6pbs緩沖液和0.05ml的吐溫20；

所述封閉液為0.04mol/lph9.6的碳酸鹽緩沖液；

所述顯色劑為0.04mol/lph9.6魯米諾；

所述終止液為2mol/l硫酸。

與現有技術相比，本發明提供的一種己烯雌酚的血紅蛋白催化化學發光酶聯免疫檢測方法，具有以下有益效果：

1、血紅蛋白(hb)是人和動物體內含量最多的蛋白質之一，hb分子中每一條肽鏈與一個亞鐵血紅素結合，血紅素位于肽鏈折疊所形成的介電常數較低的疏水環境中。hb的三維空間結構為底物的參與提供了特異結合空間與識別位點，這是hb體現高催化活性的重要原因之一。

2、本發明首次以價廉的牛血紅蛋白(hb)作為過氧化物模擬酶代替辣根過氧化物酶，制備出hb標記的des；在des與載體蛋白之間插入不同的間隔臂，合成不同的des人工抗原，探討間隔臂對elisa靈敏度的影響，確定最佳des人工抗原；通過合成并選擇各種類型底物，篩選出高效化學發光增強劑；通過免疫試驗，制備抗des單克隆抗體，優化elisa反應條件，建立des的化學發光酶聯免疫分析方法，進而研制出des殘留檢測試劑盒，用于食品安全快速檢測。

3、以價廉的牛血紅蛋白(hb)作為過氧化物模擬酶代替辣根過氧化物酶，制備出hb標記的des，大大降低了檢測成本。辣根過氧化物酶的價格大概是250元/100mg，牛血紅蛋白的價格大概是4元/100mg，成本降低60多倍。

附圖說明

圖1是測定des的標準曲線；

圖2是des、hb、des-hb的紫外檢測圖譜，

其中，圖2中a線條為己烯雌酚，圖2中b線條為bsa，圖2中c線條為己烯雌酚人工抗原。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式對本發明進行詳細說明，但應當理解本發明的保護范圍并不受具體實施方式的限制。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件操作，未注明的實驗材料來源均為市售，由于不涉及發明點，故不對其步驟進行詳細描述。

當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。

下述方法中，6-8周齡balb/c雌性小鼠，8周齡雌性icr小鼠，sp/0骨髓瘤細胞，由揚州大學獸醫學院比較醫學中心提供。

本發明提供了一種己烯雌酚的血紅蛋白催化化學發光酶聯免疫檢測方法，包括以下步驟：

s1，己烯雌酚(des)人工抗原的合成及鑒定

己烯雌酚(des)屬于人工合成的雌激素，其分子量小于1000da。由于分子量小而且不具有免疫原性，屬于半抗原，它必須連接到大分子蛋白質載體上形成完全抗原后才能誘導機體產生免疫反應。為了與蛋白質載體偶聯，化合物必須具有一定的功能基團，因為des不具有這樣的基團，因此需要對其進行衍生反應合成具有功能基團且與des結構相似的化合物，des結構中的－oh(羥基)是己烯雌酚的重要基團，也是其結構中的活潑基團，通過－oh對des進行結構修飾，衍生出一個羥基，再與蛋白質載體上的氨基連接。

s11，己烯雌酚單羧基丙基醚(des-cpe)的制備

將50mg的己烯雌酚(des)溶于3ml二甲基亞砜中，氮氣保護下加入1-2mg催化劑碘化鉀和1-2ml4-氯丁酸乙酯，避光、70-80℃加熱回流，反應24h后，用3ml乙酸乙酯萃取，收集上層溶液，干燥后得到固態物質；向固態物質中加入2ml乙醇使之完全溶解，然后滴加1ml2.0mol/l氫氧化鈉溶液，反應3h后，加入5.0mol/l鹽酸溶液調節ph至3-4；加入20ml乙酸乙酯萃取，收集上層溶液，經干燥后得到己烯雌酚單羧基丙基醚，保存在干燥器中備用。

s12，己烯雌酚人工抗原的合成

將50mg的己烯雌酚單羧基丙基醚溶解在2ml的二甲基亞砜中，加入35mg的n-羥基丁二酰亞胺(nhs)，40mg的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，30℃條件下攪拌反應10h，得到抗原溶液；

將150mg的牛血清蛋白(bsa)溶解5ml的ph7.4的0.01mol/lpbs緩沖液中，得到血清蛋白溶液；

將上述的血清蛋白溶液加入到上述的抗原溶液中，反應12h，然后用5mol/lnaoh調ph至8.5，4℃攪拌過夜(攪拌12h)，然后將得到的反應液在0.01mol/l、ph7.4的pbs緩沖液中透析72h，使用的透析袋的截留分子量為15000da，透析結束后，透析袋內透析液冷凍干燥，得到己烯雌酚人工抗原，-20℃保存備用；

s13，人工抗原的分析鑒定

使用紫外可見分光光度計己烯雌酚人工抗原進行鑒定、偶聯比及濃度測定。包括：

將上述己烯雌酚單羧基丙基醚、己烯雌酚人工抗原、bsa分別用20％甲醇(溶劑為pbs)溶液稀釋成適當濃度的溶液，以20％甲醇(溶劑為pbs)溶液作為對照，用紫外可見光分光光度計進行掃描，結果如圖2所示，

己烯雌酚在240nm處有吸收峰(圖2中a線條)，bsa在280nm處有吸收峰(圖2中b線條)，己烯雌酚人工抗原(圖2中c線條)吸收峰值響應度有所變化，說明己烯雌酚人工抗原以成功構建。

分別測定在260nm處的紫外吸收光值為0.213，在280nm處的紫外吸收光值為0.167，按照下面公式計算：蛋白質濃度(mg/ml)＝1.45×od280-0.74×od260得到己烯雌酚人工抗原蛋白質濃度為6.41mg/ml。

s2，己烯雌酚抗體的制備及鑒定

利用己烯雌酚人工抗原制備己烯雌酚抗體，利用細胞融合技術將b淋巴細胞和骨髓瘤細胞進行融合，篩選出分泌特異性抗體的單個雜交瘤細胞，通過擴大培養分裂增殖的細胞群，制備己烯雌酚抗體。包括以下步驟：

s21，使用以下試劑：

不完全dmem培養基的配制方法為：dmem粉劑1袋，nahco33.7g，溶于超純水1l，1mol/l鹽酸調節ph值到7.0-7.2，過濾除菌，4℃保存備用。

100×ht貯存液：稱取136.1mg次黃嘌呤和38.8mg胸腺嘧啶核苷，加超純水到100ml，置50℃水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃凍存。

100×a貯存液：稱取1.76mg氨基喋呤溶于90ml超純水中，滴加1mol/lnaoh0.5ml中和，再補超純水到100ml，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃凍存。

20％完全dmem培養基：小牛血清50ml，加不完全dmem培養基至250ml，4℃保存備用。

ht培養基：20％完全dmem培養基99ml，加100×ht貯存液1ml，無菌條件下配制。

hat培養基：20％完全dmem培養基98ml，加100×ht貯存液1ml，100×a貯存液1ml，無菌條件下配制。

s22，小鼠免疫；

利用己烯雌酚人工抗原、選擇6-8周齡balb/c雌性小鼠進行免疫。按免疫原、免疫劑量進行分組，每組三只。第3次免疫后一周，自小鼠斷尾采血，利用間接競爭酶聯免疫吸附法檢測小鼠血清內抗體效價及藥物抑制情況，選擇抗血清效價高、競爭抑制強的小鼠，五免后兩周，以雙倍蛋白量的免疫原(己烯雌酚人工抗原)直接腹腔注射加強免疫，3-5d后取小鼠脾臟中的b淋巴細胞，備用。

s23，骨髓瘤細胞的準備；

融合前10d復蘇sp/0骨髓瘤細胞，用20％小牛血清(v/v)的培養基培養。當細胞呈對數生長，此時細胞生長狀態良好，渾圓透亮，性狀規則，大小均一，邊緣清晰，排列整齊，呈半致密分布。此時，按照1:3的體積比例稀釋傳代，一般每2-3d進行一次傳代或擴大培養。最后選取生長旺盛、狀態良好、處于對數生長期的sp/0骨髓瘤細胞，備用。

s24，飼養細胞的準備；

融合前1d，取8周齡雌性icr小鼠1-2只，斷頸處死，置于75％酒精中浸泡5min，腹部朝上固定，移至超凈工作臺上操作。使用10ml無菌注射器吸取不完全dmem培養基緩慢注入小鼠腹腔內，然后右手固定注射器，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部兩側1min，然后再抽回，1200r/min離心5min，棄上清hat培養基重懸，細胞計數，依據計數結果，補加hat培養基，使細胞濃度為2×10⁵個/ml。

s25，細胞融合；

用10ml不完全dmem培養基將sp/0骨髓瘤細胞輕輕吹下，收集于細胞瓶內，加入s22中的小鼠脾臟(小鼠脾臟中含有大量的b淋巴細胞)，混勻，1200r/min離心5min后棄盡上清，打散細胞，然后將融合管置于37℃水浴中，先慢后快地1min內加完1mlpeg溶液，邊加邊攪拌，靜止90s后先慢后快地加入30ml不完全dmem培養基終止反應。37℃水浴靜置10min，500r/min離心10min后棄盡上清，細胞重懸至80mlhat培養基中。將細胞懸液滴加到鋪有飼養細胞的96孔細胞培養板中，每孔兩滴，置于培養箱中培養。

s26，細胞培養

培養箱中培養24h后可觀察有無污染，48-72h后初步判斷b淋巴細胞與sp/0骨髓瘤細胞融合是否成功，4-5d后可補加hat培養基，9-10d后可換用ht培養基，15d后可用20％完全dmem培養基。觀測細胞生長情況，待細胞克隆長至1/3-1/2培養孔面積時，可進行陽性細胞株的篩選。

s27，陽性雜交瘤細胞的篩選；

采用ielisa聯合cielisa檢測方法篩選陽性雜交瘤細胞，然后采用有限稀釋法進行亞克隆，最后轉移到細胞培養瓶中擴大培養，收集培養上清液中的己烯雌酚抗體，并即時凍存。傳代培養30代后，上清液中的己烯雌酚抗體一直保持1:256000，效果穩定。

s28，己烯雌酚抗體鑒定；

采用動物體內誘生單克隆抗體的方法大量制備腹水。選擇8周齡icr雌性小鼠，每只腹腔注射滅菌液體石蠟0.5ml，7-10d后，將處于對數生長期的陽性雜交瘤細胞以不完全dmem培養基稀釋后接種至小鼠腹腔內，3×10⁵/只。每天觀察小鼠腹水產生狀況，7-9d后，用12號針頭采集腹水，3000r/min離心10min，棄去油脂、細胞以及其他沉淀物質，純化后小管分裝，-20℃保存備用。

然后分別測定s27中細胞上清液抗體效價和s28中腹水的抗體效價。

s3，己烯雌酚酶標抗原的合成與鑒定

向3ml二甲基亞砜中分別加入50mg己烯雌酚人工抗原、30mg二環己基碳二亞胺(dcc)和30mgn-羥基丁二酰亞胺，在25℃避光反應12h，然后1200r/min離心5min棄沉淀，將混合物的上清液于4℃保存；

將100mg牛血紅蛋白溶解于5ml0.01mol/l的ph7.4的pbs緩沖液中，逐滴加入4℃保存的混合物的的上清液，4℃攪拌反應6h，然后將得到的混合液冷凍干燥，得到己烯雌酚酶標抗原。

s4，己烯雌酚elisa分析

利用所述己烯雌酚抗體、己烯雌酚酶標抗原對待測樣品進行酶聯免疫檢測，獲得測試樣品中的己烯雌酚含量。

(1)包被：將己烯雌酚抗體用0.04mol/lph9.6pbs緩沖液稀釋至濃度為5μg/ml，加到酶標板上，每孔100μl，在37℃電熱恒溫培養箱中將酶標板孵育2.0h，取出后用洗滌液洗板3次。

(2)封閉：每孔加入100μl的封閉液，放入25℃恒溫箱中2.5h后，然后用洗滌液洗板3次，其中，封閉液為0.04mol/lph9.6的碳酸鹽緩沖液。

(3)加標準品：在步驟(2)的酶標板(包被有抗體的酶標板)中，選取若干孔作為標準對照孔，其中1孔為空白對照，加入100μl超純水，其余每孔均加入己烯雌酚標準溶液50μl和己烯雌酚酶標抗原50μl，37℃電熱恒溫培養箱中孵育2h，取出后用洗滌液清洗酶標板3次，其中不同的標準對照孔加入不同濃度的己烯雌酚標準溶液。

(4)加實際樣品：在步驟(2)的酶標板中，選取另外的若干孔作為樣品孔，其中1孔為空白樣品，加入100μl超純水，其余每孔均加入待測樣品溶液50μl、己烯雌酚酶標抗原50μl，37℃電熱恒溫培養箱中孵育2h，取出后用洗滌液清洗酶標板3次。

(5)發光：每孔加入0.04mol/lph9.6魯米諾50μl，37℃電熱恒溫培養箱中孵育40min。

(6)終止：每孔50μl加入2mol/l硫酸終止反應。

(7)測定：在420nm波長測定各孔發光值，記錄不同標準對照孔的發光值，并繪制標準曲線(圖1所示)，標準曲線為y＝-0.4657x+0.7373，r²＝0.9925，其中y表示縱坐標ln(1+b/b0)，b表示發光值，b0表示己烯雌酚濃度為0的發光值，x表示橫坐標lg(1+cdes),cdes表示己烯雌酚濃度，記錄樣品孔的發光值，最后根據標準曲線計算待測樣品中己烯雌酚的濃度。

需要說明的是，s11、s11、s3中，所述冷凍干燥的條件均是-20℃、真空度30pa。

需要說明的是，上述步驟，步驟(1)-(4)中，每100ml洗滌液中有99.95ml的0.01mol/lph9.6pbs緩沖液和0.05ml的吐溫20。

下述表1是己烯雌酚elisa分析方法的穩定性試驗，分別測定了空白對照和濃度為15ng/mldes的標準樣品的發光值，如表1所示。結果表明在3個月時間內，發光值變化不大，說明本方法所建立的體系具有較好的穩定性，制成的試劑盒可長期保存。

表1體系穩定性實驗的發光值

另外，我們利用本發明的方法測定了雞肉中的des的含量，如表2所示。結果表明，當des的含量大于5.0μg/kg時，回收率大于90％，結果滿意。

表2雞肉中des的回收率實驗結果(n＝6)

我們利用本發明的方法測定了魚肉中的des的含量，如表3所示。分別測定了0.5μg/kg、5.0μg/kg、10.0μg/kg的樣品。結果表明，測定結果的rsd小于3.2％，回收率大于88％，結果滿意。

表3魚肉肉中des的回收率實驗結果(n＝6)

本發明首次以價廉的牛血紅蛋白(hb)作為過氧化物模擬酶代替辣根過氧化物酶，制備出hb標記的des，大大降低了檢測成本。辣根過氧化物酶的價格大概是250元/100mg，牛血紅蛋白的價格大概是4元/100mg，成本降低60多倍。

盡管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和范圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬于本發明權利要求及其等同技術的范圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。