GAPDHS蛋白64位發生質量偏移的蘇氨酸在制備重度少弱精診斷試劑中的用途的制作方法
本發明涉及醫學和分子診斷技術領域，具體涉及一種gapdhs蛋白64位發生質量偏移的蘇氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精診斷試劑中的用途。
背景技術：
不孕不育已成為全世界范圍內的生殖健康問題，其中由于男性因素造成的不育大概占50％左右，且近年來呈上升的趨勢。造成男性不育的主要原因是少精弱精癥。根據世界衛生組織標準規定，如果a級精子數<25％，(a+b)級精子數<50％，且精子活率低于60％的話，就可診斷為弱精子癥。少精子癥是指精液中的精子數目低于正常具有生育能力男性的一種病癥，當男性的精子在每毫升低于2千萬時，就為少精子癥。
目前關于精子蛋白質組的研究有很多。saraswat等利用uplc-ms的方法在人類精子中定量了667個蛋白，并且分析出了20個健康人和弱精癥患者精子中的差異蛋白(saraswatm,joenvaaras,jaintetal.humanspermatozoaquantitativeproteomicsignatureclassifiesnormo-andasthenozoospermia.molecular&cellularproteomics:mcp,16(1),57-72(2017).)。最新更新的人類精子蛋白質組共6198個蛋白(amarala,castilloj,ramalho-santosj,olivar.thecombinedhumanspermproteome:cellularpathwaysandimplicationsforbasicandclinicalscience.humanreproductionupdate,20(1),40-62(2014).)。gaigaiwang等利用高分辨質譜在人類精子中鑒定出4675個蛋白(wangg,guoy,zhoutetal.in-depthproteomicanalysisofthehumanspermrevealscomplexproteincompositions.journalofproteomics,79,114-122(2013).)。絡氨酸磷酸化對于精子的運動、獲能、超激運動等過程重要作用。chying-chyuanchan等通過對20組正常人和弱精癥患者的精子進行蛋白質組學分析發現有12種包括tubgcp2在內的蛋白發生了過磷酸化(chancc,shuiha,wuchetal.motilityandproteinphosphorylationinhealthyandasthenozoospermicsperm.journalofproteomeresearch,8(11),5382-5386(2009))。
非編碼氨基酸包括翻譯后修飾和氨基酸突變，是調控蛋白功能和結構的重要方式，因此將疾病狀態下異常的或者數量變化極大的非編碼氨基酸作為疾病的生物標志物，進而用于診斷疾病的進程具有重要意義。但目前還未有關于非編碼氨基酸作為與重度少弱精子疾病相關的生物標志物的報道。
技術實現要素：
針對上述現有技術，本發明的目的提供一種與重度少弱精子癥相關的生物標志物的篩選與應用。本發明首先利用nanohplc-ms/ms質譜系統和非標記定量蛋白質組學方法對多組重度少弱精疾病的精子蛋白非編碼氨基酸進行了深度的質譜分析；然后利用非限定氨基酸蛋白質修飾分析方法對質譜數據進行搜索，再經過多變量高斯混合分布聚類分析，盡可能大量的鑒定出精子蛋白組中非編碼氨基酸；最后通過正常和病人精子蛋白組中非編碼氨基酸的比較，得到與重度少弱精癥相關的蛋白非編碼氨基酸位點，從而將其作為重度少弱精癥的分子標志物。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
本發明的第一方面，提供了一種與重度少弱精子癥相關的生物標志物的篩選方法，包括如下步驟：
(1)提取精子細胞全蛋白；
(2)將精子細胞全蛋白采用凝膠電泳分離，切膠酶解，對酶解后的肽段進行脫鹽，制備得到樣品；
(3)將步驟(2)的樣品采用納流液相色譜分離，經納流液相色譜分離后的樣品再進行質譜檢測，采集質譜數據；
(4)利用非限定氨基酸蛋白質修飾分析方法對質譜數據進行搜索，再經過多變量高斯混合分布聚類分析，盡可能大量的鑒定出精子蛋白組中非編碼氨基酸；最后通過正常個體和重度少弱精個體精子蛋白組中非編碼氨基酸的比較，得到與重度少弱精癥相關的蛋白非編碼氨基酸位點，即為與重度少弱精子癥相關的生物標志物。
步驟(1)中，提取精子細胞全蛋白采用的方法為：將精子樣本采用dpbs洗滌，加入ripa裂解液超聲1～2min，置于冰上孵育30min裂解，離心，取上清。
優選的，在4℃的條件下離心，離心轉速為14,000g，離心時間為20min。
步驟(2)中，優選的，采用10％聚丙烯酰氨凝膠電泳(sds-page)對蛋白進行分離。
步驟(2)中，優選的，采用ziptip對酶解后的肽段進行脫鹽。
步驟(3)中，納流液相色譜分離的色譜條件為：流動相a：含有0.1％甲酸的水，流動相b：含有0.1％甲酸的乙腈；納流液相質譜分析系統為orbitrapelite(thermoscientific)
洗脫條件為：0-100min，95-68％流動相a，5-32％流動相b；100-120min，68-20％流動相a，32-80％流動相b；120-150min，20％流動相a，80％流動相b；
流速為300nl/min。
步驟(3)中，質譜檢測的條件為：350-1800m/z的全掃描，分辨率為60,000(m/z200)。二級圖譜掃描時，活化時間為10ms，隔離寬度為2m/z；碎裂方式為誘導碰撞解離(collision-induceddissociation,cid)，歸一化碰撞能量設定為35％，動態排出時間為90s。
步驟(4)中，對質譜數據進行搜索的參數設置為：蛋白酶為胰蛋白酶，漏切位點設置為2，母離子質量偏差為10ppm，碎片離子的質量偏差為0.6da，盲搜上限設為1000，盲搜下限設為-200，蛋白fdr為0.01；
選擇肽段分數>200和fdr<0.01的肽段作為wildcardsearchtm搜索到的未知修飾數據，組成質量變化的一維數據矩陣(-200da-400da)，再將數據按照1da的變化范圍，0.5da為界限，分割成601個數據窗口。
步驟(4)中，多變量高斯混合分布聚類分析的方法為：針對每一個數據窗口，用r語言中的mclust程序包做高斯混合分布聚類分析，根據bic取最優值，再對每一個峰進行合并分析，然后用高斯分布擬合每一個峰，確定峰值；聚類之后的每個峰中所包含的肽段位點數據，根據位點氨基酸分布，選擇分布大于5％的數據作為一類非編碼氨基酸。
步驟(4)中，將正常個體和重度少弱精個體的非編碼氨基酸按照其檢測頻率的t檢驗(p<0.05)和比值(ratio>2)進行篩選，從而得到差異非編碼氨基酸。
上述篩選方法是用于獲得生物標志物，且不是以獲得疾病的診斷和治療結果為目的；經上述篩選方法獲得的生物標志物可用于重度少弱精子癥的理論研究或者新藥物的開發。
本發明的第二方面，提供根據上述篩選方法篩選得到的與重度少弱精子癥相關的生物標志物，所述生物標志物包括但不限于：
akap3蛋白208位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸(標記為s+79.96685；根據質量偏移值，確定該位置的絲氨酸發生了磷酸化修飾)；
akap4蛋白186位發生-113.05347質量偏移的天門冬酰胺(標記為n-113.05347)；
akap4蛋白186位發生-114.04278質量偏移的天門冬酰胺(標記為n-114.04278)；
akap4蛋白617位發生-17.02660質量偏移的谷氨酰胺(標記為q-17.02660)；
akap4蛋白733位發生+211.09682質量偏移的賴氨酸(標記為k+211.09682)；
atp5a1蛋白531位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸(標記為k+42.01108；根據質量偏移值，確定該位置的賴氨酸發生了乙酰化修飾)；
cox4i1蛋白87位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸(標記為k+42.01108；根據質量偏移值，確定該位置的賴氨酸發生了乙酰化修飾)；
gapdhs蛋白64位發生+79.96685質量偏移的蘇氨酸(標記為t+79.96685；根據質量偏移值，確定該位置的蘇氨酸發生了磷酸化修飾)；
和kiaa1683蛋白692位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸(標記為s+79.96685；根據質量偏移值，確定該位置的絲氨酸發生了磷酸化修飾)。
本發明的第三方面，提供akap3蛋白208位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。
優選的，akap3蛋白208位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸還可以作為重度少弱精治療的靶標，從而用于重度少弱精的治療。
進一步的，本發明還提供akap3蛋白208位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精的治療藥物中的用途。
本發明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標志物(akap3蛋白208位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸)的試劑。
本發明還提供一種治療重度少弱精的藥物，所述藥物中含有能夠使akap3蛋白208位絲氨酸進行磷酸化修飾的組分。
本發明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本akap3蛋白208位絲氨酸發生+79.96685質量偏移的頻次，若檢測頻次小于1.5時，被判為少弱精患者。
本發明的第四方面，提供akap4蛋白186位發生-113.05347質量偏移的天門冬酰胺作為生物標志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。
本發明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標志物(akap4蛋白186位發生-113.05347質量偏移的天門冬酰胺)的試劑。
本發明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本akap4蛋白186位天門冬酰胺發生-113.05347質量偏移的頻次，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者。
本發明的第五方面，提供akap4蛋白186位發生-114.04278質量偏移的天門冬酰胺作為生物標志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。
本發明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標志物(akap4蛋白186位發生-114.04278質量偏移的天門冬酰胺)的試劑。
本發明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本akap4蛋白186位天門冬酰胺發生-114.04278質量偏移的頻次，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者。
本發明的第六方面，提供akap4蛋白617位發生-17.02660質量偏移的谷氨酰胺作為生物標志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。
本發明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標志物(akap4蛋白617位發生-17.02660質量偏移的谷氨酰胺)的試劑。
本發明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本akap4蛋白617位谷氨酰胺發生-17.02660質量偏移的頻次，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者。
本發明的第七方面，提供akap4蛋白733位發生+211.09682質量偏移的賴氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。
本發明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標志物(akap4蛋白733位發生+211.09682質量偏移的賴氨酸)的試劑。
本發明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本akap4蛋白733位賴氨酸發生+211.09682質量偏移的頻次，檢測頻次小于3.5時，被判為少弱精患者。
本發明的第八方面，提供atp5a1蛋白531位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。
優選的，atp5a1蛋白531位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸還可以作為重度少弱精治療的靶標，從而用于重度少弱精的治療。
進一步的，本發明還提供atp5a1蛋白531位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精的治療藥物中的用途。
本發明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標志物(atp5a1蛋白531位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸)的試劑。
本發明還提供一種治療重度少弱精的藥物，所述藥物中含有能夠使atp5a1蛋白531位賴氨酸進行乙酰化修飾的組分。
本發明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本atp5a1蛋白531位賴氨酸發生+42.01108質量偏移的頻次，若檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者。
本發明的第九方面，提供cox4i1蛋白87位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。
優選的，cox4i1蛋白87位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸還可以作為重度少弱精治療的靶標，從而用于重度少弱精的治療。
進一步的，本發明還提供cox4i1蛋白87位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精的治療藥物中的用途。
本發明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標志物(cox4i1蛋白87位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸)的試劑。
本發明還提供一種治療重度少弱精的藥物，所述藥物中含有能夠使cox4i1蛋白87位賴氨酸進行乙酰化修飾的組分。
本發明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本cox4i1蛋白87位賴氨酸發生+42.01108質量偏移的頻次，若檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者。
本發明的第十方面，提供gapdhs蛋白64位發生+79.96685質量偏移的蘇氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。
優選的，gapdhs蛋白64位發生+79.96685質量偏移的蘇氨酸還可以作為重度少弱精治療的靶標，從而用于重度少弱精的治療。
進一步的，本發明還提供gapdhs蛋白64位發生+79.96685質量偏移的蘇氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精的治療藥物中的用途。
本發明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標志物(gapdhs蛋白64位發生+79.96685質量偏移的蘇氨酸)的試劑。
本發明還提供一種治療重度少弱精的藥物，所述藥物中含有能夠使gapdhs蛋白64位蘇氨酸進行磷酸化修飾的組分。
本發明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本gapdhs蛋白64位蘇氨酸發生+79.96685質量偏移的頻次，若檢測頻次小于3.5時，被判為少弱精患者。
本發明的第十一方面，提供kiaa1683蛋白692位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精的診斷試劑中的用途。
優選的，kiaa1683蛋白692位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸還可以作為重度少弱精治療的靶標，從而用于重度少弱精的治療。
進一步的，本發明還提供kiaa1683蛋白692位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸作為生物標志物在制備重度少弱精的治療藥物中的用途。
本發明還提供一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標志物(kiaa1683蛋白692位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸)的試劑。
本發明還提供一種治療重度少弱精的藥物，所述藥物中含有能夠使kiaa1683蛋白692位絲氨酸進行磷酸化修飾的組分。
本發明還提供一種重度少弱精的診斷方法，步驟為：檢測待測樣本kiaa1683蛋白692位絲氨酸發生+79.96685質量偏移的頻次，若檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者。
本發明的有益效果：
(1)本發明首次建立了一種與重度少弱精子癥相關的生物標志物的篩選方法，通過對大量樣本精子蛋白的質譜數據進行分析處理，盡可能大量的鑒定出精子蛋白組中非編碼氨基酸；最后通過正常和病人精子蛋白組中非編碼氨基酸的比較，得到與重度少弱精癥相關的蛋白非編碼氨基酸位點，從而將其作為重度少弱精癥的分子標志物。
(2)本發明進一步的對上述篩選方法得到的生物標志物進行研究，發現可以通過上述生物標志物的檢驗頻次來診斷重度少弱精癥，為重度少弱精癥提供了新的診斷和治療靶點。
附圖說明
構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構成對本申請的不當限定。
圖1：akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率的roc曲線。
圖2：健康和少弱精樣本中akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率比較。
圖3：akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-113.05347檢測頻率的roc曲線。
圖4：健康和少弱精樣本的akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-113.05347檢測頻率比較。
圖5：akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-114.04278檢測頻率的roc曲線。
圖6：健康和少弱精樣本的akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-114.04278檢測頻率比較。
圖7：akap4蛋白617位非編碼氨基酸q-17.02660檢測頻率的roc曲線。
圖8：健康和少弱精樣本的akap4蛋白617位非編碼氨基酸q-17.02660檢測頻率比較。
圖9：akap4蛋白733位非編碼氨基酸k+211.09682檢測頻率的roc曲線。
圖10：健康和少弱精樣本的非編碼氨基酸k+211.09682檢測頻率比較。
圖11：atp5a1蛋白531位賴氨酸乙酰化修飾k+42.01108檢測頻率的roc曲線。
圖12：健康和少弱精樣本的atp5a1蛋白531位賴氨酸乙酰化修飾k+42.01108檢測頻率比較。
圖13：cox4i1蛋白87位賴氨酸乙酰化修飾k+42.01108檢測頻率的roc曲線。
圖14：健康和少弱精樣本的cox4i1蛋白87位賴氨酸乙酰化修飾k+42.01108檢測頻率比較。
圖15：gapdhs蛋白64位蘇氨酸上的磷酸化修飾t+79.96685檢測頻率的roc曲線。
圖16：健康和少弱精樣本中gapdhs蛋白64位蘇氨酸上的磷酸化修飾t+79.96685檢測頻率比較。
圖17：kiaa1683蛋白692位絲氨酸磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率的roc曲線。
圖18：健康和少弱精樣本中kiaa1683蛋白692位絲氨酸磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率比較。
具體實施方式
應該指出，以下詳細說明都是例示性的，旨在對本申請提供進一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術和科學術語具有與本申請所屬技術領域的普通技術人員通常理解的相同含義。
需要注意的是，這里所使用的術語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式也意圖包括復數形式，此外，還應當理解的是，當在本說明書中使用術語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。
正如背景技術所介紹的，現有技術中還未有關于非編碼氨基酸作為與重度少弱精子癥相關的生物標志物的報道。基于此，本發明提出了一種與重度少弱精子癥相關的生物標志物的篩選方法與應用。
在本申請的一種實施方案中，提出了一種與重度少弱精子癥相關的生物標志物的篩選方法，包括如下步驟：
(1)提取精子細胞全蛋白；
(2)將精子細胞全蛋白采用凝膠電泳分離，切膠酶解，對酶解后的肽段進行脫鹽，制備得到樣品；
(3)將步驟(2)的樣品采用納流液相色譜分離，經納流液相色譜分離后的樣品再進行質譜檢測，采集質譜數據；
(4)利用非限定氨基酸蛋白質修飾分析方法對質譜數據進行搜索，再經過多變量高斯混合分布聚類分析，盡可能大量的鑒定出精子蛋白組中非編碼氨基酸；最后通過正常個體和重度少弱精個體精子蛋白組中非編碼氨基酸的比較，得到與重度少弱精癥相關的蛋白非編碼氨基酸位點，即為與重度少弱精子癥相關的生物標志物。
由于精子樣本的易得性，精子成熟后其轉錄和翻譯處于停滯狀態，這也為我們在蛋白質水平上研究少弱精子癥提供了方便，本申請首先利用nanohplc-ms/ms質譜系統和非標記定量蛋白質組學方法對多組重度少弱精疾病的精子蛋白非編碼氨基酸進行了深度的質譜分析；然后利用非限定氨基酸蛋白質修飾分析方法對質譜數據進行搜索，再經過多變量高斯混合分布聚類分析，盡可能大量的鑒定出精子蛋白組中非編碼氨基酸。最后將正常與患病組的非編碼氨基酸按照其檢測頻率的t檢驗(p<0.05)和比值(ratio>2)進行篩選，從而得到差異非編碼氨基酸。然后利用spss軟件作出差異非編碼氨基酸roc曲線，并計算其曲線下面積(auc)，進而判斷其診斷價值。
采用本申請的上述篩選方法，得到了系列與重度少弱精子癥相關的生物標志物，具體如下：
akap3蛋白208位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸(標記為s+79.96685；根據質量偏移值，確定該位置的絲氨酸發生了磷酸化修飾)；
akap4蛋白186位發生-113.05347質量偏移的天門冬酰胺(標記為n-113.05347)；
akap4蛋白186位發生-114.04278質量偏移的天門冬酰胺(標記為n-114.04278)；
akap4蛋白617位發生-17.02660質量偏移的谷氨酰胺(標記為q-17.02660)；
akap4蛋白733位發生+211.09682質量偏移的賴氨酸(標記為k+211.09682)；
atp5a1蛋白531位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸(標記為k+42.01108；根據質量偏移值，確定該位置的賴氨酸發生了乙酰化修飾)；
cox4i1蛋白87位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸(標記為k+42.01108；根據質量偏移值，確定該位置的賴氨酸發生了乙酰化修飾)；
gapdhs蛋白64位發生+79.96685質量偏移的蘇氨酸(標記為t+79.96685；根據質量偏移值，確定該位置的蘇氨酸發生了磷酸化修飾)；
和kiaa1683蛋白692位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸(標記為s+79.96685；根據質量偏移值，確定該位置的絲氨酸發生了磷酸化修飾)。
在本申請的另一種實施方案中，提出了一種用于重度少弱精診斷的試劑盒，所述試劑盒中包括特異性檢測上述生物標志物的試劑。
通過對上述生物標志物進行檢測，可以實現對重度少弱精癥的診斷。
在本申請的另一種實施方案中，提出了一種治療重度少弱精的藥物，所述藥物中含有能夠使akap3蛋白208位絲氨酸、gapdhs蛋白64位蘇氨酸或kiaa1683蛋白692位絲氨酸進行磷酸化修飾的組分，或者含有能夠使atp5a1蛋白531位賴氨酸或cox4i1蛋白87位賴氨酸進行乙酰化修飾的組分。
經研究發現，磷酸化修飾的akap3蛋白208位絲氨酸、gapdhs蛋白64位蘇氨酸和kiaa1683蛋白692位絲氨酸在重度少弱精樣本中顯著性的下調，乙酰化修飾的atp5a1蛋白531位賴氨酸或cox4i1蛋白87位賴氨酸也在重度少弱精樣本中顯著性的下調。由此可以合理預期，以上述生物標志物作為靶標，通過對多重度少弱精患者該靶標處的氨基酸進行磷酸化或乙酰化修飾，可以起到對重度少弱精的治療作用。
為了使得本領域技術人員能夠更加清楚地了解本申請的技術方案，以下將結合具體的實施例詳細說明本申請的技術方案。
本發明實施例中所用的試驗材料均為本領域常規的試驗材料，均可通過商業渠道購買得到。
實施例1：與重度少弱精子癥相關的生物標志物的篩選
具體篩選方法如下：
一、樣本處理及實驗分析
1.精子細胞全蛋白的提取：等量的重度少弱精和正常精子樣本分別用dpbs洗三次，加入等量ripa裂解液超聲1～2min，置于冰上孵育30min裂解，4℃離心14,000g×20min取上清。利用bradford方法測定蛋白濃度。
2.蛋白酶解：取約重度少弱精和正常精子樣本各150μg精子蛋白，使用10％聚丙烯酰氨凝膠電泳(sds-page)對蛋白進行分離，各分成5份進行切膠酶解。使用ziptip對肽段進行脫鹽。
3.質譜分析：納流液相色譜分離：a相：含有0.1％甲酸的水；b相：含有0.1％甲酸的乙腈
每個樣品分別用13.5μla相溶解,樣品進樣量為4μl，納流液相質譜分析系統為orbitrapelite(thermoscientific)。樣品分離之前分別用4μla相平衡自制的預柱和分析柱。預柱和分析柱的規格分別為：預柱(4cm×150μmi.d.,c18填料粒徑5μm,
質譜數據采集：350‐1800m/z的全掃描，分辨率為60,000(m/z200)。二級圖譜掃描時，活化時間為10ms，隔離寬度為2m/z。碎裂方式為誘導碰撞解離(collision-induceddissociation,cid)，歸一化碰撞能量設定為35％，動態排出時間為90s。
二、質譜數據分析
byonic分析：為了鑒定出精子蛋白的非編碼氨基酸，我們用byonictm分析21對正常與重度少弱精患者的精蛋白質譜數據。搜索參數如下：蛋白酶為胰蛋白酶，漏切位點設置為2，母離子質量偏差為10ppm，碎片離子的質量偏差為0.6da,盲搜上限設為1000，盲搜下限設為-200.蛋白fdr為0.01。
選擇肽段分數>200和fdr<0.01的肽段作為wildcardsearchtm搜索到的未知修飾數據，組成質量變化的一維數據矩陣(-200da-400da)，再將數據按照1da的變化范圍，0.5da為界限，分割成601個數據窗口。針對每一個數據窗口，用r語言中的mclust程序包做高斯混合分布聚類分析，根據bic取最優值，再對每一個峰進行合并分析，然后用高斯分布擬合每一個峰，確定峰值。聚類之后的每個峰中所包含的肽段位點數據，根據位點氨基酸分布，選擇分布大于5％的數據作為一類非編碼氨基酸。
將正常與患病組的非編碼氨基酸按照其檢測頻率的t檢驗(p<0.05)和比值(ratio>2)進行篩選，從而得到差異非編碼氨基酸。然后利用spss軟件作出差異非編碼氨基酸roc曲線，并計算其曲線下面積(auc)，進而判斷其診斷價值。
三、實驗結果：
經質譜數據分析和將正常與患病組的非編碼氨基酸比較，從而得到9個差異非編碼氨基酸，可以作為與重度少弱精子癥相關的生物標志物，具體如下：
1.akap3蛋白208位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸(標記為s+79.96685；根據質量偏移值，確定該位置的絲氨酸發生了磷酸化修飾)
我們發現akap3蛋白208位絲氨酸上發生了磷酸化修飾s+79.96685，經過比較發現這一磷酸化修飾在重度少弱精樣本顯著性下調了10.7倍，p值為7.49e-15<0.05。
為評價akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率對重度少弱精的診斷效能，本發明采用了roc曲線分析，auc為roc曲線下的面積，是最常用的評價roc曲線特征的參數，是重要的試驗準確度指標。若auc在0.7以下，則表示診斷的準確率較低；auc在0.7以上，則可以滿足臨床診斷的要求。
圖1為akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一磷酸化修飾的auc為0.856>0.7，說明具有較好的診斷效果，即akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685可以作為重度少弱精的診斷標志物。
在檢驗頻次為1.5時，靈敏度為73％，特異度為88.9％。當進行個體檢測時，檢測頻次小于1.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為11.1％)。
健康和少弱精樣本中akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率比較結果見圖2，由圖2可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發生了4.6次而在病理樣本中發生了0.4次(圖中實線)，并且其中位數(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。
鑒于上述結果，akap3蛋白208位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685可以作為少弱精子癥的潛在生物標志物，從而對這一病癥進行預測。
2.akap4蛋白186位發生-113.05347質量偏移的天門冬酰胺(標記為n-113.05347)
經過質譜數據分析，我們發現akap4蛋白的186位的天門冬酰胺有-113.05347的質量偏移(n-113.05347)，經過比較發現這一非編碼氨基酸n-113.05347在重度少弱精樣本顯著性下調了9.2倍，p值為4.60e-13<0.05。
圖3為akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-113.05347檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一非編碼氨基酸n-113.05347的auc為0.852>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為1.5時，靈敏度為65.1％，特異度為93.7％。當進行個體檢測時，檢測頻次小于1.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為6.3％)。
圖4比較了非編碼氨基酸n-113.05347在健康和少弱精樣本的檢測頻率，可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發生了2.9次而在病理樣本中發生了0.3次(圖中實線)，并且其中位數(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。
鑒于上述結果，akap4蛋白的186位點的天門冬酰胺n-113.05347這一非編碼氨基酸可以作為少弱精子癥的潛在生物標志物，從而對這一病癥進行預測。
3.akap4蛋白186位發生-114.04278質量偏移的天門冬酰胺(標記為n-114.04278)
經過質譜數據分析，我們發現akap4蛋白的186位的天門冬酰胺有-114.04278的質量偏移(n-114.04278)，經過比較發現這一非編碼氨基酸n-114.04278在重度少弱精樣本顯著性下調了7.3倍，p值為1.11e-11<0.05。
圖5為akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-114.04278檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一非編碼氨基酸n-114.04278的auc為0.817>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為0.5時，靈敏度為74.6％，特異度為84.1％。當進行個體檢測時，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為15.9％)。
健康和少弱精樣本的akap4蛋白186位非編碼氨基酸n-114.04278檢測頻率比較見圖6，由圖6可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發生了1.6次而在病理樣本中發生了0.2次(圖中實線)，并且其中位數(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。
鑒于上述結果，akap4蛋白的186位點的天門冬酰胺n-114.04278這一非編碼氨基酸可以作為少弱精子癥的潛在生物標志物，從而對這一病癥進行預測。
4.akap4蛋白617位發生-17.02660質量偏移的谷氨酰胺(標記為q-17.02660)
經過質譜數據分析，我們發現akap4蛋白的617位的谷氨酰胺有-17.02660的質量偏移(q-17.02660)，經過比較發現這一非編碼氨基酸q-17.02660在重度少弱精樣本顯著性下調了4.8倍，p值為2.21e-09<0.05。
圖7為akap4蛋白617位非編碼氨基酸q-17.02660檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一非編碼氨基酸q-17.02660的auc為0.802>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為0.5時，靈敏度為77.8％，特異度為79.4％。當進行個體檢測時，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為20.6％)。
健康和少弱精樣本的akap4蛋白617位非編碼氨基酸q-17.02660檢測頻率比較見圖8，由圖8可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發生了2.7次而在病理樣本中發生了0.6次(圖中實線)，并且其中位數(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。
鑒于上述結果，akap4蛋白的617位點的谷氨酰胺q-17.02660這一非編碼氨基酸可以作為少弱精子癥的潛在生物標志物，從而對這一病癥進行預測。
5.akap4蛋白733位發生+211.09682質量偏移的賴氨酸(標記為k+211.09682)
經過質譜數據分析，我們發現akap4蛋白的733位的賴氨酸有211.09682的質量偏移(k+211.09682)，經過比較發現這一非編碼氨基酸k+211.09682在重度少弱精樣本顯著性下調了4.4倍，p值為5.79e-11<0.05。
圖9為akap4蛋白733位非編碼氨基酸k+211.09682檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一非編碼氨基酸k+211.09682的auc為0.804>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為3.5時，靈敏度為74.6％，特異度為71.4％。當進行個體檢測時，檢測頻次小于3.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為28.6％)。
健康和少弱精樣本的非編碼氨基酸k+211.09682檢測頻率比較見圖10，由圖10可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發生了14次而在病理樣本中發生了3次(圖中實線)，并且其中位數(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。
鑒于上述結果，akap4蛋白的733位點的賴氨酸k+211.09682這一非編碼氨基酸可以作為少弱精子癥的潛在生物標志物，從而對這一病癥進行預測。
6.atp5a1蛋白531位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸
經過質譜數據分析，我們發現atp5a1蛋白531位賴氨酸上發生了乙酰化修飾k+42.01108，經過比較發現這一乙酰化修飾在重度少弱精樣本顯著性下調了10.5倍，p值為3.48e-16<0.05。
圖11為atp5a1蛋白531位賴氨酸乙酰化修飾k+42.01108檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一乙酰化修飾的auc為0.848>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為0.5時，靈敏度為76.2％，特異度為85.7％。當進行個體檢測時，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為14.3％)。
健康和少弱精樣本的atp5a1蛋白531位賴氨酸乙酰化修飾k+42.01108檢測頻率比較見圖12，可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發生了1.7次而在病理樣本中發生了0.2次(圖中實線)，并且其中位數(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。
鑒于上述結果，atp5a1蛋白531位賴氨酸上的乙酰化修飾k+42.01108可以作為少弱精子癥的潛在生物標志物，從而對這一病癥進行預測。
7.cox4i1蛋白87位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸(標記為k+42.01108)
經過質譜數據分析，我們發現cox4i1蛋白87位賴氨酸上發生了乙酰化修飾k+42.01108，經過比較發現這一乙酰化修飾在重度少弱精樣本顯著性下調了11.3倍，p值為5.06e-13<0.05。
圖13為cox4i1蛋白87位賴氨酸乙酰化修飾k+42.01108檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一乙酰化修飾的auc為0.803>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為0.5時，靈敏度為66.7％，特異度為95.2％。當進行個體檢測時，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為4.8％)。
圖14為健康和少弱精樣本的cox4i1蛋白87位賴氨酸乙酰化修飾k+42.01108檢測頻率比較，由圖14可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發生了1.1次而在病理樣本中發生了0.1次(圖中實線)，并且其中位數(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。
鑒于上述結果，cox4i1蛋白87位賴氨酸上的乙酰化修飾k+42.01108可以作為少弱精子癥的潛在生物標志物，從而對這一病癥進行預測。
8.gapdhs蛋白64位發生+79.96685質量偏移的蘇氨酸(標記為t+79.96685)
經過質譜數據分析，我們發現gapdhs蛋白的64位蘇氨酸上發生了磷酸化修飾t+79.96685，經過比較發現這一磷酸化修飾在重度少弱精樣本顯著性下調了4.1倍，p值為1.82e-14<0.05。
圖15為gapdhs蛋白64位蘇氨酸上的磷酸化修飾t+79.96685檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一磷酸化修飾的auc為0.868>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為3.5時，靈敏度為71.4％，特異度為92.1％。當進行個體檢測時，檢測頻次小于3.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為7.9％)。
圖16為健康和少弱精樣本中gapdhs蛋白64位蘇氨酸上的磷酸化修飾t+79.96685檢測頻率比較，由圖16可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發生了5.8次而在病理樣本中發生了1.4次(圖中實線)，并且其中位數(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。
鑒于上述結果，gapdhs蛋白64位蘇氨酸上的磷酸化修飾t+79.96685可以作為少弱精子癥的潛在生物標志物，從而對這一病癥進行預測。
9.kiaa1683蛋白692位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸(標記為s+79.96685)
經過質譜數據分析，我們發現kiaa1683蛋白692位絲氨酸上發生了磷酸化修飾s+79.96685，經過比較發現這一磷酸化修飾在重度少弱精樣本顯著性下調了22倍，p值為2.73e-10<0.05。
圖17為kiaa1683蛋白692位絲氨酸磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率的roc曲線，roc分析顯示這一磷酸化修飾的auc為0.808>0.7，說明具有較好的診斷效果。在檢驗頻次為0.5時，靈敏度為65.1％，特異度為95.2％。當進行個體檢測時，檢測頻次小于0.5時，被判為少弱精患者(假陽性率為4.8％)。
圖18為健康和少弱精樣本中kiaa1683蛋白692位絲氨酸磷酸化修飾s+79.96685檢測頻率比較，由圖18可以看出這一非編碼氨基酸在健康人樣本中平均發生了2.1次而在病理樣本中發生了0.1次(圖中實線)，并且其中位數(圖中虛線)相差較遠，說明在少弱精樣本中這一非編碼氨基酸有較大程度地丟失。
鑒于上述結果，kiaa1683蛋白692位絲氨酸上的磷酸化修飾s+79.96685可以作為少弱精子癥的潛在生物標志物，從而對這一病癥進行預測。
實施例2：臨床檢測驗證
以4例健康樣本、8例已臨床確診的重度少弱精樣本作為研究對象進行驗證，分別檢測上述樣本的akap3蛋白208位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸、akap4蛋白186位發生-113.05347質量偏移的天門冬酰胺、akap4蛋白186位發生-114.04278質量偏移的天門冬酰胺、akap4蛋白617位發生-17.02660質量偏移的谷氨酰胺、akap4蛋白733位發生+211.09682質量偏移的賴氨酸、atp5a1蛋白531位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸、cox4i1蛋白87位發生+42.01108質量偏移的賴氨酸、gapdhs蛋白64位發生+79.96685質量偏移的蘇氨酸和kiaa1683蛋白692位發生+79.96685質量偏移的絲氨酸各自的檢測頻次，并按實施例1中各生物標志物進行個體檢測時的判斷標準對待測樣本進行診斷。
結果表明：分別以上述各生物標志物進行單獨診斷時，診斷結果與已知結果一致。說明本發明篩選得到的9個生物標志物可以各自作為重度少弱精的診斷標志物。
以上所述僅為本申請的優選實施例而已，并不用于限制本申請，對于本領域的技術人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本申請的保護范圍之內。
- 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊！