一種微藻總脂含量的快速測定方法與流程

本發明屬于能源微藻脂類含量測定技術領域，具體涉及一種微藻總脂含量的快速測定方法。

背景技術：

目前對于微藻脂類含量的測定方法主要有以下兩種：

1、索氏提取法

步驟如下：（1）準確稱取3-4g干燥的藻粉，裝入已稱重并編號的濾紙包中，封好包口備用。將索氏提取器各部位充分洗滌并用蒸餾水潤洗后烘干，脂肪燒瓶在103±2℃的烘箱內干燥至恒重。（2）將濾紙筒放入索氏提取器的抽提筒內，連接已干燥至恒重的脂肪燒瓶，由抽提器冷凝管上端加入石油醚至瓶內容積的2/3處，通入冷凝水，將燒瓶浸在水浴中加熱，用一小團脫脂棉輕輕塞入冷凝管上口。（3）水浴溫度應控制在使提取液每6-8min回流一次為宜。（4）抽提時間為4-5h，提取完畢，用毛玻璃板接取一滴提取液，如無油斑則表明提取完畢。（5）提取完畢，取下脂肪燒瓶，回收石油醚。待燒瓶內石油醚僅剩下1-2mL時，在水浴上蒸盡殘留的溶劑，于95-105℃干燥2h，置于干燥器中冷卻至室溫后稱量。繼續干燥30min后冷卻稱量，反復干燥至恒重（GB/T 5009.6—2003, 食品中脂肪的測定）。

2、有機溶劑抽提-重量法

取100mg藻粉加入2mL質量百分數為10%的二甲亞砜-甲醇溶液，分別于50℃抽提30min、冰浴抽提30min后，離心收集上清液于預先烘干的玻璃瓶中，藻渣加入乙醚/正己烷4mL（1:1，v/v），冰浴抽提1h，離心收集上清液至同一玻璃瓶中，重復上述過程直到藻渣變白。在合并的抽提液中加入2mL蒸餾水，震蕩分相，移取有機相至另一玻璃瓶中，在通風櫥中用氮氣吹至較小體積，將濃縮液轉移至預先稱重過的1.5mL塑料離心管中，用氮氣吹干至恒重，即得總脂含量(Khozin-Goldberg I, Shrestha P, Cohen Z. Mobilization of arachidonyl moieties from triacylglycerols into chloroplastic lipids following recovery from nitrogen starvation of the microalga Parietochloris incisa. Biochimica Et Biophysica Acta, 2006, 1738: 63–71)。

以上兩種微藻總脂含量的測定方法都十分耗時費力，對于大規模分析的樣品及需要連續快速監測的樣品測定十分不利。因此，有必要研制一種方便快捷、靈敏度高且成本低廉的微藻總脂含量的測定方法以解決上述技術問題。

技術實現要素：

為克服現有技術中無法實現大規模分析及連續快速監測微藻總脂含量的問題，本發明提供了一種微藻總脂含量的快速測定方法，該方法所用試劑價廉易得，使用常規測試儀器即可完成，并且測定快速準確。

本發明為解決上述技術問題采用如下技術方案，一種微藻總脂含量的快速測定方法，其具體步驟為：

步驟（1）、乙基香草醛試劑的配制，將0.12g乙基香草醛溶解于20mL蒸餾水中，再用質量百分含量為85%的磷酸定容至100mL得到乙基香草醛試劑；

步驟（2）、有機溶劑抽提-重量法測定微藻總脂含量，收集培養結束的藻液，分別取500mL和1000mL藻液，置于離心機中于10000r/min的離心速率離心5min后棄上清，并用蒸餾水清洗，將藻泥置于冷凍干燥機中干燥5h，干燥后稱量藻粉的質量分別為72.5mg和125.2mg，分別取藻粉加入2mL體積百分數為10%的二甲亞砜的甲醇溶液，分別于50℃抽提30min、冰浴抽提30min后，離心收集上清液于預先烘干的玻璃瓶中，藻渣加入體積比為1:1的乙醇-正己烷溶液，冰浴抽提1h，離心收集上清液至同一玻璃瓶中，重復上述過程直至藻渣變白，在合并的抽提液中加入2mL蒸餾水，震蕩分層，移取有機相至另一玻璃瓶中，氮氣吹干至恒重，即得總脂含量分別為27.13%和25.12%，取平均值為26.13%對測定樣品進行標定；

步驟（3）、標準曲線的繪制，分別取1mL、2mL、5mL、8mL和10mL步驟（2）收集培養結束的藻液置于離心機中于10000r/min的離心速率離心5min，清洗后反復離心得到藻泥，分別用蒸餾水定容至1mL，加入到10mL具塞比色管中，再分別加入摩爾濃度為18mol/L的硫酸溶液2mL，于沸水浴中孵化10min，60℃水浴孵化10min，加入步驟（1）得到的乙基香草醛試劑5mL，于37℃保溫15min，再常溫水浴10min，然后在分光光度計中于417nm處測定吸光光度值，最終得到吸光光度值與微藻總脂濃度的標準曲線；

步驟（4）、待測微藻總脂含量的測定，收集工業生產過程中培養結束的藻液，取5mL置于離心機中于10000r/min的離心速率離心5min，清洗后反復離心得到藻泥，用蒸餾水定容至1mL，加入到10mL具塞比色管中，再加入摩爾濃度為18mol/L的硫酸溶液2mL，于沸水浴中孵化10min，60℃水浴孵化10min，加入步驟（1）得到的乙基香草醛試劑5mL，于37℃保溫15min，再常溫水浴10min，然后在分光光度計中于417nm處測定吸光光度值，根據步驟（3）得到的吸光光度值與微藻總脂濃度的標準曲線最終確定待測微藻總脂的含量。

本發明中微藻可以與乙基香草醛試劑反應生成一種紅色物質，這是乙基香草醛反應可以用于測定脂肪含量的基礎，試劑中的磷酸與乙基香草醛的羥基作用后產生芳香族磷酸酯，并且改變了乙基香草醛分子中的電子分配，使醛基變成酯基；另一方面，不飽和脂類與硫酸作用可以水解生成碳鎓離子，磷酸酯與這種碳鎓離子發生反應，最終生成紅色醌化物，在417nm處存在最大吸收峰，得到的吸光度值需要傳統微藻總脂含量測定方法的標定，最終得到藻類總脂含量。本發明具有方便快捷、靈敏度高和成本低廉等優點。

附圖說明

圖1是四種香草醛類試劑和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）反應后生成的紅色醌化物在分光光度計上400-1100nm可見光范圍內的連續波長掃描，可以看出四種反應試劑的紅色生成物的最大吸收峰均存在于417nm處，其中乙基香草醛法的吸光度值最大，表明其測定方法最為靈敏；

圖2是在417nm處測定乙基香草醛法與蛋白核小球藻反應液的吸光度值和藻液總脂濃度的線性回歸曲線，由圖可以看出該方法測定的吸光度值與小球藻脂肪酸含量之間存在很好的線性回歸關系（R²=0.997，P <0.001），表明乙基磷酸香草醛法分析可以用于測定小球藻總脂含量。

具體實施方式

以下通過實施例對本發明的上述內容做進一步詳細說明，但不應該將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明上述內容實現的技術均屬于本發明的范圍。

實施例

1、實驗材料

實驗藻種采用中科院水生所購買的蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）藻株，以HGZ作為微藻的培養基進行種子液制備，取處于穩定生長期的柵藻母液（濃度>10⁹個/mL）離心收集藻細胞，使用HGZ培養基配方（章宗涉, 黃祥飛．淡水浮游生物研究方法．北京：科學出版社，1991），按照1.2×10⁶個/mL的初始濃度進行接種，置于培養箱中進行為期14天的培養，光照條件為60μmol/m²?s，培養溫度25℃。

2、香草醛類試劑的配制

香草醛類試劑可能均可與藻類脂肪酸發生反應，顯色反應會因試劑不同有所差異，分別選取了四種試劑：香草醛、丁香草醛、鄰香草醛和乙基香草醛進行對比測試，具體試劑的配制方法為：分別準確稱取0.12g香草醛類試劑（香草醛、丁香草醛、鄰香草醛和乙基香草醛）溶解于20mL蒸餾水中，再用質量濃度為85%的磷酸溶液定容至100mL備用。

3、波長掃描

將處于對數生長期的小球藻藻液取出，分別準確量取體積5mL 4份，在10000r/min條件下進行離心，清洗后復離心，用蒸餾水定容至1mL，加入10mL具塞比色管中，再加入摩爾濃度為18mol/L的硫酸溶液2mL，于沸水浴中孵化10min，60℃水浴孵化10min，分別加入配制好的香草醛類試劑5mL，于37℃保溫15min，再常溫水浴10 min。使用分光光度計在400-1100nm之間進行波長掃描，結果表明四種試劑與小球藻反應后，均在417nm處找到最大吸收峰，其中乙基香草醛試劑在417nm處的吸光度值最高，表明該方法測定微藻的脂肪酸含量最靈敏。

4、微藻總脂含量的測定

（1）、乙基香草醛試劑的配制，將0.12g乙基香草醛溶解于20mL蒸餾水中，再用質量百分含量為85%的磷酸定容至100mL得到乙基香草醛試劑；

（2）、有機溶劑抽提-重量法測定微藻總脂含量，收集培養結束的藻液，分別取500mL和1000mL藻液，置于離心機中于1000r/min的離心速率離心5min后棄上清，并用蒸餾水清洗，將藻泥置于冷凍干燥機中干燥5h，干燥后稱取藻粉的質量分別為72.5mg和125.2mg，分別取藻粉加入2mL體積百分數為10%的二甲亞砜的甲醇溶液，分別于50℃抽提30min、冰浴抽提30min后，離心收集上清液于預先烘干的玻璃瓶中，藻渣加入體積比為1:1的乙醇-正己烷溶液，冰浴抽提1h，離心收集上清液至同一玻璃瓶中，重復上述過程直至藻渣變白，在合并的抽提液中加入2mL蒸餾水，震蕩分層，移取有機相至另一玻璃瓶中，氮氣吹干至恒重，即得總脂含量分別為27.13%和25.12%，取平均值為26.13%對測定樣品進行標定；

（3）、標準曲線的繪制，分別取1mL、2mL、5mL、8mL和10mL步驟（2）收集培養結束的藻液置于離心機中于10000r/min的離心速率離心5min，清洗后反復離心得到藻泥，分別用蒸餾水定容至1mL，加入到10mL具塞比色管中，再分別加入摩爾濃度為18mol/L的硫酸溶液2mL，于沸水浴中孵化10min，60℃水浴孵化10min，加入步驟（1）得到的乙基香草醛試劑5mL，于37℃保溫15min，再常溫水浴10min，然后在分光光度計中于417nm處測定吸光光度值，最終得到吸光光度值與微藻總脂濃度的標準曲線；

（4）、待測微藻總脂含量的測定，收集工業生產過程中培養結束的藻液，取5mL置于離心機中于10000r/min的離心速率離心5min，清洗后反復離心得到藻泥，用蒸餾水定容至1mL，加入到10mL具塞比色管中，再加入摩爾濃度為18mol/L的硫酸溶液2mL，于沸水浴中孵化10min，60℃水浴孵化10min，加入步驟（1）得到的乙基香草醛試劑5mL，于37℃保溫15min，再常溫水浴10min，然后在分光光度計中于417nm處測定吸光光度值，根據步驟（3）得到的吸光光度值與微藻總脂濃度的標準曲線最終確定待測微藻總脂的含量。

以上實施例描述了本發明的基本原理、主要特征及優點，本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明原理的范圍下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進均落入本發明保護的范圍內。