一種抗肝素的血清總膽紅素(釩酸鹽氧化法)檢測試劑盒的制作方法

本發明涉及血清總膽紅素(釩酸鹽氧化法)檢測技術領域，特別涉及一種適合全自動生化分析儀的血清總膽紅素(釩酸鹽氧化法)檢測試劑。

背景技術：

總膽紅素是直接膽紅素和間接膽紅素二者的總和。總膽紅素來源主要有：①80%～85%的膽紅素來自衰老的紅細胞崩解;②約15%由造血過程中尚未成熟的紅細胞在骨髓中被破壞（骨髓內無效性紅細胞生成）而形成的;③少量來自含血紅素蛋白（hemoprotein），如肌紅蛋白、過氧化物酶、細胞色素等的破壞分解。

總膽紅素主要用來診斷是否有肝臟疾病或膽道是否發生異常，總膽紅素正常值在3.4～17.1μmol/L之間，17.1-34.2μmol/L可視為隱性疸;34.2-170μmol/L之間為輕度黃疸;170-340μmol/L為中度黃疸;大于340μmol/L則為重度黃疸。

臨床上常用的血清總膽紅素檢測方法有重氮法、膽紅素氧化酶法和釩酸鹽氧化法。重氮法試劑有較高的實驗靈敏度、試劑價格便宜、檢測操作方法簡單，但重復性不穩定;膽紅素氧化酶法具有特異性好、靈敏度高、重復性好，操作簡便等優點，但由于試劑價格較高，目前仍未廣泛使用。后來隨著釩酸鹽法檢測血液中膽紅素方法的出現以及在國內的逐漸推廣，臨床中的評價也較多，其擁有者良好的特異性和穩定性，得到了臨床使用者的好評，但是隨著臨床使用的逐漸推廣發現，在針對于臨床中使用肝素處理獲得的血漿樣本，在使用釩酸鹽法檢測總膽紅素時，造成檢測結果不準確，反應曲線異常且檢測結果不正常，容易導致檢測結果偏低甚至出現負值，這給臨床中的推廣和使用造成非常大的困擾。

技術實現要素：

針對于血清總膽紅素檢測，本發明提供了一種抗肝素的血清總膽紅素(釩酸鹽法)檢測試劑盒，該試劑盒與常規檢測方法相比，檢測結果不受肝素影響，且使用簡單、方便，具有很好的準確度、重復性及良好的檢測范圍，有利于試劑在臨床上的推廣應用。

本發明是通過以下措施實現的：

使用新型的表面活性劑取代原有的陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨作為加速劑，破壞游離膽紅素總的氫鍵，然后將加速破壞之后的膽紅素完全暴露出來，在PH=3附近，將釩酸鹽作用于樣本，樣本中的總膽紅素被氧化成膽綠素，膽紅素所特有的黃色減少，在波長450nm處檢測其被釩酸鹽氧化前后吸光度之差，其變化程度與樣本中的TBIL的含量成正比。

一種總膽紅素檢測試劑，包括試劑R1、R2，所述試劑R1、R2的組成如下：

試劑R1：

磷酸氫二鈉-苯甲酸緩沖液(pH2.9) 0.1mol/L

脂肪醇聚氧乙烯醚 5g/L-10 g/L

烷基酚聚氧乙烯醚(OP) 4 g/L -8g/L

聚乙二醇8000 1%-5.0%

曲拉通-305 2.5 g/L - 5g/L

氟化鈉 1.0g/L-2.0 g/L

乙二胺四乙酸四鈉 1g/L-2 g/L

試劑R2:

磷酸鹽緩沖液(pH7.0) 10mmol/L

乙二胺四乙酸二鈉 5g/L-10g/L

乙二胺四乙酸四鈉 1g/L-2g/L

偏釩酸鈉 4mmol/L

所述試劑在使用時R1：R2= 4:1,R1用量為240μl。

本發明的有益效果是：

1、本發明有限選擇了苯甲酸作為主要的緩沖液，既可以促進釩酸鹽對膽紅素的氧化作用，又可以對反應體系起到防腐的作用；

2、本發明中選用了脂肪醇聚氧乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚(OP)、聚乙二醇等非離子型表面活性作為膽紅素的加速劑，從而避免了陽離子表面活性劑與大分子肝素物質的聚合，并且能夠很好的起到充分加速的作用，三種表面活性劑具協同作用；

3、在試劑中在添加乙二胺四乙酸二鈉的同時，添加了少量的乙二胺四乙酸四鈉螯合劑，可以對不同的重金屬離子起到作用，并且乙二胺四乙酸四鈉能夠抑制釩酸鹽對其他物質的氧化，從而提高檢測結果的特異性。

4、本法明在試劑1中添加了曲拉通-305表面活性劑，能夠提高反應體系的澄清程度，提高產品的精密度。

5、本發明中優選了氟化鈉作為離子平衡劑，調整反應過程中離子濃度大小對反應的影響。

附圖說明

圖1 為兩種試劑的相關性曲線圖；

圖2 為本發明試劑開瓶穩定性;

圖3 實施例1試劑檢測操作方法

圖4 實施例2試劑抗干擾性能比較；

圖5 實施例1試劑與市場常見并得到認可的血清總膽紅素測定試劑盒對比檢測結果。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明：

實施例1

磷酸氫二鈉-苯甲酸緩沖液(pH2.9) 0.1mol/L

脂肪醇聚氧乙烯醚 5g/L-10 g/L

烷基酚聚氧乙烯醚(OP) 4 g/L -8g/L

聚乙二醇8000 1%-5.0%

曲拉通-305 2.5 g/L - 5g/L

氟化鈉 1.0g/L-2.0 g/L

乙二胺四乙酸四鈉 1g/L-2 g/L

試劑R2:

磷酸鹽緩沖液(pH7.0) 10mmol/L

乙二胺四乙酸二鈉 5g/L-10g/L

乙二胺四乙酸四鈉 1g/L-2g/L

偏釩酸鈉 4mmol/L

本實施例試劑的使用方法：

本實施例描述的血清總膽紅素(釩酸鹽氧化法)檢測試劑，在使用時采用全自動生化分析儀，如日立7180全自動分析儀等，利用兩點終點法進行測定。將樣本和試劑的比例設定為9：240：60，檢測波長為450nm，在樣品盤的對應位置放置好蒸餾水、標準品和樣本，操作如圖3。

實施例2

干擾性試驗：取新鮮混合血清，分成2等份，然后將每等份再分成5等份，加入不同的干擾物質，使其在血清中的濃度達到圖4的要求。然后分別用實施例1所得試劑，與市場常見并認可的血清總膽固醇試劑同時對比測定血清總膽固醇的含量,對照組測定結果與加入不同干擾物質后各組的測定結果見圖4。相對偏差(%)=(干擾樣本的測定均值－對照樣本的測定均值)/對照樣本的測定均值×100%。

由圖4可以看出，抗壞血酸≤20mmol/L、肝素≤0.5%、血紅蛋白≤200mg/L、甘油三酯≤22.6mmol/L情況對實施例1試劑測試結果沒有明顯干擾。與對照結果相比，本發明試劑抗肝素能力明顯，在其他干擾物質檢測上與對照產品一致，說明實施例1的試劑在準確度和抗干擾能力上達標。

實施例3

相關性實驗：利用實施例1配方配制試劑，與市場常見的國家食品藥品監督管理局認可的某公司的血清總膽紅素(釩酸鹽氧化法)試劑盒進行對照檢測，同時檢測了20個臨床血清樣本，檢測結果如圖5所示。并獲得了兩種試劑的相關性曲線（如圖1所示），通過檢測結果顯示，兩個試劑盒的相關系數為0.999，說明了兩者有極大的相關性。

試驗所用校準品和質控品分別為：

校準品：RANDOX926血清總膽紅素的含量為32.2 μmol/L。

質控品：RANDOX1005血清總膽固醇的靶值為29.3μmol/L，靶值范圍：23.2~35.4μmol/L。

實施例4

試劑開瓶穩定性驗證試驗：

將本發明實施例1~3中所得檢測試劑作為試驗組，取一種市售血清總膽紅素(釩酸鹽氧化法)檢測試劑盒作為對照組，試驗組與對照組試劑每組各自取相同的兩份，一份做15天開瓶穩定性試驗，將試劑開瓶放置在儀器的2-8℃冷藏箱中（15天不取出），作為15天開瓶穩定性檢測；另一份做37℃熱穩定性檢測試驗，封閉放置在37℃恒溫水浴鍋中（每天僅在檢測的時候取出，檢測完畢后，依然封口放回37℃水浴鍋中，連續7天），作為7天37℃熱穩定性驗證。將試劑同時在日立7180全自動生化分析儀器上，按照如下圖3方法進行檢測，并在儀器上建立標準曲線。取凍干粉質控品，溶解均勻后，平均分成15份，-20℃儲存，每天質控一個，并且跟蹤檢測結果，其開瓶跟蹤監測趨勢如圖2。