一種免疫側向層析定量檢測試劑及其制備方法、檢測方法與流程

本發明涉及鏈霉親和素標記物與生物素偶聯物在側向層析定量檢測中的應用技術領域，特別涉及一種免疫側向層析定量檢測試劑及其制備方法、檢測方法。

背景技術：

免疫側向層析技術的主要特點是檢測速度快，操作簡單，因此在很多領域得到了廣泛的應用。它是以條狀纖維材料為固相，如硝酸纖維素膜，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上預包被的該待測物特異性受體發生高親和性免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區域，通過對該特定區域的分析得到實驗結果，從而達到檢測目的。常用的標記物如酶、膠體金顆粒、彩色微球、熒光微球、有機熒光分子。

酶法標記是利用酶催化底物的原理，其缺點是檢測范圍窄、受溫度影響大；膠體金標記是通過靜電吸附原理標記，再對捕獲線上膠體金顆粒的富集顯色判定結果，其缺點是重復性差，靈敏度不高；彩色微球可以采用共價的化學交聯法也可以采用物理吸附法標記，但定量檢測的缺點是捕獲線上色度不均一；熒光微球的本質和彩色微球一樣，是將有機熒光分子摻入或包被乳膠微球而制成，其缺點是微球分子阻礙大、特異性低、微球容易凝聚；上述方法均難以做到精確定量，從而限制了這類產品的實際應用。在已經商品化的定量免疫層析診斷試劑中，也有用熒光分子標記，而一般的熒光染料因為它們的激發光和檢測光的波長位于可見光區，容易形成高背景的熒光干擾，降低了檢測靈敏度。

鏈霉親和素生物素系統是一種新型生物反應系統，此系統幾乎可與目前研究成功的各種標記物結合，且一個鏈霉親和素分子也能結合4個生物素分子，目前已應用于酶法檢測微量抗原、分離DNA片段和蛋白、在細胞水平的定位觀察研究。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題之一在于針對現有免疫側向層析定量檢測試劑條所存在的檢測靈敏度差的問題而提供一種操作簡單便捷、檢測速度快，定量準確的免疫側向層析定量檢測試劑。

本發明所要解決的技術問題之二在于提供上述免疫側向層析定量檢測試劑的制備方法。

本發明所要解決的技術問題之三在于提供上述免疫側向層析定量檢測試劑的檢測方法。

作為本發明的第一方面的免疫側向層析定量檢測試劑，包括測試條，所述測試條包括底板和按樣品流動方向依次設置在所述底板上的樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，在所述硝酸纖維素膜上設置有檢測線和質控線，按樣品流動方向所述檢測線在前，質控線在后，所述檢測線上包被有檢測線蛋白，所述質控線上包被有質控線蛋白，其特征在于，

所述檢測線蛋白為能與抗體免疫標記復合物結合，形成免疫復合物；所述質控線蛋白能與參照標記復合物特異性結合；

還包括抗體免疫標記復合物凍干品和參照標記復合物兩者混合物的凍干品；

所述抗體免疫標記復合物是以近紅外熒光分子染料標記鏈霉親和素與活化的生物素偶聯能與體內的疾病標志物特異性結合的生物素標記特異性抗體結合而形成的抗體免疫標記復合物；

所述參照標記復合物是以近紅外熒光分子染料標記鏈霉親和素與活化的生物素標記參照物結合而形成。

作為本發明第二發明的免疫側向層析定量檢測試劑的制備方法，具有如下步驟：

1)制備近紅外熒光分子染料標記鏈霉親和素；

2)活化的生物素偶聯能與體內的疾病標志物特異性結合得到生物素標記特異性抗體，活化的生物素標記參照物得到活化的生物素標記參照物；

3)將步驟1)制備的近紅外熒光標記的鏈霉親和素分別與步驟2)制備的生物素標記特異性抗體、活化的生物素標記參照物混合，發生鏈霉親和素生物素放大反應，形成抗體免疫標記復合物和參照標記復合物，將所述抗體免疫標記復合物和參照標記復合物混合后凍干形成兩者混合物的凍干品；

4)將檢測線蛋白和質控線蛋白分別包被到所述硝酸纖維素膜上的檢測線位置和質控線位置，在所述硝酸纖維素膜上形成檢測線和質控線；

5)將樣品墊和吸水墊分別粘貼到硝酸纖維素膜的兩端，切割成測試條并裝入塑料卡槽組裝成試劑卡；

6)將步驟3)的抗體免疫標記復合物和參照標記復合物兩者混合物的凍干品與步驟5)的試劑卡裝入包裝袋內組裝成免疫側向層析定量檢測試劑盒，免疫側向層析定量檢測試劑處于干燥低溫保存狀態。

在本發明的一個優選實施例中，所述近紅外熒光分子染料為發射波長為650-1000nm的近紅外熒光分子染料。

在本發明的而一個優選實施例中，所述近紅外熒光分子染料為琥珀酰亞胺酯IRDye800。

在本發明的一個優選實施例中，所述參照物為抗兔IgG抗體。

作為本發明第三方面的免疫側向層析定量檢測試劑的檢測方法，具有如下步驟：

1)將抗體免疫標記復合物和參照標記復合物兩者混合物的凍干品復溶恢復至使用狀態得到抗體免疫標記復合物和參照標記復合物兩者的混合復溶液；

2)將待測抗原分別與抗體免疫標記復合物和參照標記復合物兩者的混合復溶液以1:2比例混勻，取100ul加到測試條樣品墊上；

3)將試劑卡用近紅外熒光檢測儀讀取檢測線和質控線，以儲存的標準曲線計算待測物濃度。

本發明使用硝酸纖維素膜作為固相載體，將特定蛋白質固定在上面形成檢測線和質控線，組裝成由樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊組成的試劑卡；用近紅外熒光標記的鏈霉親和素與生物素標記的抗體，發生每個鏈霉親和素能結合四個分子生物素的信號放大反應，形成標記復合物。在檢測過程中，標記復合物與待測物樣本反應后，再與固相上的檢測線和質控線分別反應，形成相應的免疫復合物，最后用紅外熒光檢測儀對試劑卡視窗進行掃描，并根據熒光強度和標準曲線計算標本中待測物的濃度。本發明操作簡單便捷、檢測速度快，定量準確，可以應用于疾病診斷、毒品以及食品安全等的檢測。

本發明利用紅外熒光染料的優勢，應用了鏈霉親和素生物素系統，克服了以一般熒光染料為標記物的側向層析技術所呈現的背景熒光干擾大，靈敏度低，定量不精確的缺點，建立了一種基于近紅外熒光染料標記鏈霉親和素、再與生物素偶聯物反應的檢測方法。本發明的工作原理為：使用劃膜儀，將能與被檢測物特異性結合的蛋白質固定在硝酸纖維素膜的檢測線上，將能與參照物形成特異性結合的蛋白質固定在硝酸纖維素膜的質控線上，檢測時，先將凍干品恢復至使用狀態，形成的近紅外熒光染料偶聯鏈霉親和素—生物素標記第二抗體復合物、參照物標記復合物，這些標記復合物與待測物樣本反應后，再與固相上的檢測線和質控線分別反應，形成相應的免疫復合物，使用紅外熒光檢測儀掃描檢測卡視窗，以參照物的熒光強度作為參照，代入標準曲線計算待測物的濃度。

本發明所采用的方法是雙抗體夾心法檢測抗原。當使用雙抗夾心法檢測待測物時，在免疫層析試紙上將特定的抗體固定于檢測線，將能與參照物形成特異性結合的蛋白質固定于質控線，此質控體系與檢測體系不發生交叉反應，無干擾性，質控線通常包被的是兔IgG。近紅外熒光染料標記鏈霉親和素與生物素偶聯抗體先發生生物反應，形成特異識別待測抗原的檢測抗體標記復合物與參照物標記復合物。將檢測樣本加至標記復合物中，待測物與檢測抗體發生特異性反應形成檢測抗體標記免疫復合物，此時存在著檢測抗體標記免疫復合物和參照標記復合物，再加樣至樣品墊上，檢測抗體標記免疫復合物與檢測線上的捕獲抗體反應，即形成近紅外熒光染料偶聯鏈霉親和素生物素標記的檢測抗體-待測抗原-捕獲抗體形式的雙抗體夾心復合物，參照標記復合物即羊抗兔IgG復合物與質控線上蛋白兔IgG發生特異性抗原抗體反應。反應結束后，用紅外熒光掃描儀讀取檢測卡視窗的熒光強度，取檢測線與質控線的熒光強度的比值，代入標準曲線進行計算。參照標記復合物與質控線上的固定蛋白均不與檢測體系發生反應，因此質控線是作為內控標準，也可作為實驗有效性的判斷依據。

本發明中使用的熒光掃描儀為常用的實驗掃描儀器，例如美國LI-COR公司的Odyssey近紅外成像系統。

本發明與其他側向層析檢測方法比較，具有以下的優點：

材料背景信號和生物背景信號低，信噪比高，檢測靈敏度高。目前的側向層析檢測法很多是用一般的熒光染料進行標記。但是，在一般的熒光染料的波長范圍內，生物物質會產生干擾背景熒光，同時硝酸纖維素膜也會產生很強的干擾背景熒光，因此，使用基于硝酸纖維素為固相和一般熒光染料標記的蛋白芯片檢測靈敏度低，檢測結果不夠穩定。而用近紅外標記，則具有低背景的優勢，而且具有很高的信噪比，從而獲得很高的檢測靈敏度；同時引入生物素鏈霉親和素系統，每個鏈霉親和素分子有四個生物素結合部位，可同時以多價形式結合生物素化的大分子，這種結合具有極高的親和力，親和常數可為抗原-抗體反應的百萬倍，其反應呈高度專一性，不可逆反應性，產物的穩定性高，此系統的上述優點可極大地提高檢測方法的靈敏度和準確性，而且實驗成本低。

附圖說明

圖1為本發明測試條的結構示意圖。

圖2為近紅外熒光檢測儀掃描測試條的視窗圖。

圖3為CRP標準曲線示意圖。

具體實施方式

本發明的免疫側向層析定量檢測試劑，包括圖1所示的測試條，該測試條包括采用PVC材料制成的底板100和按樣品流動方向依次設置在底板100上的樣品墊200、硝酸纖維素膜300、吸水墊400，在硝酸纖維素膜300上設置有檢測線T和質控線C，按樣品流動方向檢測線T在前，質控線C在后，檢測線T上包被有檢測線蛋白，質控線C上包被有質控線蛋白。

下面以雙抗體夾心法檢測C反應蛋白(CRP)為例來詳細說明本發明。

1.生物素標記CRP單克隆抗體和羊抗兔IgG多克隆抗體

CRP單克隆抗體(深圳菲鵬)和羊抗兔IgG多克隆抗體(杭州隆基公司)分別用PBS透析，按照每1ml 2mg/ml抗體，加入約27ul 10m生物素酰化物(美國Thermo Fisher Scientifc公司)的比例混合，室溫反應1小時。反應結束后，將標記物置入生物素標記試劑盒提供的脫鹽柱純化，以去除多余的生物素。收集蛋白樣品，加入0.005％ProClin300防腐，2-8℃保存。

2.制備凍干品

取出近紅外熒光鏈霉親和素偶聯物1mg/ml，用稀釋液(1％BSA，0.02％ProClin300，PBS)稀釋至0.8ug/ml；將生物素標記CRP抗體用稀釋液(1％BSA，0.02％ProClin300，PBS)稀釋至2.5ug/ml，再在其中加入生物素標記羊抗兔IgG多克隆抗體使其濃度為0.2ug/ml；將近紅外熒光鏈霉親和素和生物素標記物等體積混勻，將液體加至棕色凍干玻璃瓶中，凍干后取出。

3.測試條制作

1)配制劃膜稀釋液：Na₂HPO₄ 0.142％，KH₂PO₄ 0.027％，蔗糖2％，ProClin3000.02％，調節PH至7.4；

2)將CRP包被抗體(深圳菲鵬公司)用劃膜稀釋液配制至0.8mg/ml，兔IgG配制至0.5mg/ml；

3)將硝酸纖維素膜300粘貼到底板100上，用劃膜儀將配制的CRP包被抗體和兔IgG包被至硝酸纖維素膜上形成檢測線T和質控線C，37℃干燥24h；

4)將樣品墊200和吸水墊400分別粘貼在底板100上并位于硝酸纖維素膜的兩側，配示意圖如圖1；

5)切割后形成測試條，將測試條與步驟2)的凍干品一起放入包裝袋內裝配成免疫側向層析定量檢測試劑，包裝封口備用。

4.制作標準曲線

1)試驗前準備：標準品、封口的檢測卡、凍干品恢復至室溫；

2)配制加樣液：將CRP標準品(羅氏生物公司)37.1ug/ml取3ul用稀釋液(1％BSA，PBS)稀釋至0.5565ug/ml，再對半稀釋，各濃度為0.27825ug/ml、0.139125ug/ml、0.0695625ug/ml、0.03478125ug/ml、0.01739062ug/ml、8.69531ng/ml、4.347655ng/ml、2.173828ng/ml；取凍干復溶劑，每瓶加200ul；取各標準品50ul加到100ul凍干復溶液中，混勻，此時各標準品濃度為0.1855ug/ml、0.092ug/ml、0.046ug/ml、0.023ug/ml、0.0115ug/ml、5.75ng/ml、2.875ng/ml、1.4375ng/ml、0.71875ng/ml；

3)加樣：吸取加樣液100ul加至檢測卡的加樣孔，計時15min；

4)閱讀，分析：將檢測卡放入紅外掃描儀用熒光強度I＝L0.5掃描檢測卡視窗，附圖2所示掃描圖。每個濃度做兩次重復性實驗，取檢測線與質控線信號比值(T/C)的均值與濃度制作標準曲線，具體數據如下表1所示，附標準曲線示意圖如圖3。

表1

5.檢測臨床樣本

1)試驗前準備：臨床樣本、封口的檢測卡、凍干品恢復至室溫；

2)制備加樣液：樣本用稀釋液300倍稀釋；凍干品加復溶劑200ul復溶；取出樣本50ul加到100ul凍干液中，混勻；

3)加樣：計時吸取加樣液100ul加至檢測卡的加樣孔，計時15min；

4)閱讀，分析：將檢測卡放入紅外掃描儀用熒光強度I＝L0.5讀取實驗結果。代入上述標準曲線計算濃度值。具體數據如下表2所示

表2