凝固時間測定用方法、裝置、試劑和試劑盒及其制造用途與流程

本發明涉及凝固時間的測定方法及其裝置、凝固時間測定用試劑、試劑盒、以及用于制造試劑盒的用途。

背景技術：

作為臨床檢查，為了研究血液凝血因子的異常的有無，進行血液凝固檢查。在血液凝固檢查中，例如，活化部分促凝血酶原激酶時間的延長等作為血液凝血因子的異常的指標使用。活化部分促凝血酶原激酶時間的延長的原因被認為是，例如，狼瘡抗凝物等。

在狼瘡抗凝物的篩選檢查中進行使用以低濃度含磷脂的試劑的方法。在使用以低濃度含磷脂的試劑時，易呈現由狼瘡抗凝物的對磷脂的抑制反應。從而，由此方法易檢測狼瘡抗凝物導致的凝固時間的延長。作為狼瘡抗凝物的檢測用試劑，例如，有非專利文獻1(活化部分促凝血酶原激酶時間試劑盒PTT LA試劑“RD”附帶文書2012年12月改訂(第3版)、[在線]、[2015年7月28日檢索]、互聯網<URL:http://www.info.pmda.go.jp/downfiles/ivd/PDF/700025_21700A MY00198000_A_01_02.pdf>)中記載的試劑。

在非專利文獻1中記載的試劑中，作為樣品測定正常血漿時的凝固時間在29～43秒鐘的范圍內，成為比使用非狼瘡抗凝物的檢測用的通常的活化部分促凝血酶原激酶時間測定試劑測定時的凝固時間長的時間。因此，期望抑制凝固時間變得過長。

技術實現要素：

本發明的范圍僅由隨附的權利要求確定，而不受此發明概述部分的任何影響。

本發明提供以下技術方案。

(1)凝固時間的測定方法，其包括：

將血液待測樣品、活化劑、磷脂和錳離子形成化合物混合的混合工序、及

將上述混合工序中得到的樣品和鈣鹽混合而調制測定樣品，測定測定樣品的凝固時間的測定工序，

在上述混合工序中，與上述活化劑及上述磷脂不同地，將上述血液待測樣品和上述錳離子形成化合物混合。

(2)(1)所述的凝固時間的測定方法，其中上述混合工序包括：

(A)將血液待測樣品、活化劑和磷脂混合而得到混合物的工序，

(B)將上述混合物和錳離子形成化合物混合的工序。

(3)(2)所述的方法，其中在上述工序(A)中的上述血液待測樣品、上述活化劑和上述磷脂的混合結束時起150秒鐘以內，在上述工序(B)中，向上述混合物混合上述錳離子形成化合物。

(4)(1)～(3)之任一項所述的方法，其中上述測定樣品中的上述錳離子形成化合物的終濃度是0.1μM以上、不足10mM。

(5)(1)～(4)之任一項所述的方法，其中上述測定樣品中的上述錳離子形成化合物的終濃度是0.1mM以上、不足5mM。

(6)(1)～(5)之任一項所述的方法，其中在上述測定工序中，將上述樣品以30℃以上45℃以下的溫度溫育后，向上述樣品混合鈣鹽。

(7)(1)～(6)之任一項所述的方法，其中在上述測定工序中，將上述樣品以36℃以上38℃以下的溫度溫育后，向上述樣品混合鈣鹽。

(8)(1)～(7)之任一項所述的方法，其中在上述測定工序中，將上述樣品溫育1分鐘以上6分鐘以下后，向上述樣品混合鈣鹽。

(9)(1)～(8)之任一項所述的方法，其中在上述測定工序中，將上述樣品溫育2分鐘以上5分鐘以下后，向上述樣品混合鈣鹽。

(10)(1)～(9)之任一項所述的方法，其中在上述測定工序中，將上述樣品以36℃以上38℃以下的溫度溫育2分鐘以上5分鐘以下后，向上述樣品混合鈣鹽。

(11)(1)～(10)之任一項所述的方法，其中上述錳離子形成化合物是形成2價離子的化合物。

(12)(1)～(11)之任一項所述的方法，其中上述錳離子形成化合物是選自氯化錳、過錳酸鉀、硫酸錳、硝酸錳及醋酸錳的化合物。

(13)凝固時間的測定裝置，其具備：

將血液待測樣品、活化劑、磷脂和錳離子形成化合物混合而調制樣品，將得到的樣品和鈣鹽混合而得到測定樣品的樣品調制部，

從上述樣品調制部中得到的測定樣品取得顯示伴隨凝固反應的變化的凝固信息的檢測部，

基于由上述檢測部取得的凝固信息，算出上述測定樣品的凝固時間的算出部，

收容活化劑、磷脂、錳離子和鈣鹽的試劑收容部，

其中上述樣品調制部

從上述試劑收容部取得上述活化劑、上述磷脂及上述錳離子形成化合物，與上述活化劑及上述磷脂不同地，將上述血液待測樣品和上述錳離子形成化合物混合而調制樣品，

從上述試劑收容部取得上述鈣鹽，將上述鈣鹽和上述樣品混合而得到測定樣品。

(14)(13)所述的凝固時間的測定裝置，其中上述樣品調制部將上述樣品以36℃以上38℃以下的溫度溫育2分鐘以上5分鐘以下后，向上述樣品混合鈣鹽。

(15)用于在(1)～(12)之任一項所述的凝固時間的測定方法中使用的凝固時間測定用試劑，其含有錳離子形成化合物。

(16)(15)所述的凝固時間測定用試劑，其中上述錳離子形成化合物是形成2價離子的化合物。

(17)(15)或(16)所述的凝固時間測定用試劑，其中上述錳離子形成化合物是選自氯化錳、過錳酸鉀、硫酸錳、硝酸錳及醋酸錳的化合物。

(18)試劑盒，其含：

第1試劑容器中收容的含活化劑和磷脂的第1試劑，

第2試劑容器中收容的含錳離子形成化合物的第2試劑，及

第3試劑容器中收容的含鈣鹽的第3試劑。

(19)(18)所述的試劑盒，其中上述試劑盒是用于在(1)～(12)之任一項所述的凝固時間的測定方法中使用的試劑盒。

(20)第1試劑容器中收容的含活化劑和磷脂的第1試劑、第2試劑容器中收容的含錳離子形成化合物的第2試劑、及第3試劑容器中收容的含鈣鹽的第3試劑用于制造試劑盒的用途。

【發明效果】

由本發明可提供能抑制凝固時間變得過長的凝固時間的測定方法及其裝置、凝固時間測定用試劑、試劑盒、以及用于試劑盒制造的用途。

【附圖說明】

圖1是凝固時間的測定裝置的構成圖。

圖2是顯示由測定裝置的凝固時間的測定的處理順序的流程圖。

圖3是顯示樣品的調制工序的處理順序的流程圖。

圖4是顯示樣品的調制工序的處理順序的流程圖。

圖5是顯示向樣品的鈣鹽的添加工序及光學信息的取得工序的處理順序的流程圖。

圖6是試劑盒的構成圖。

圖7是顯示在實施例1及比較例1中研究ICA的結果的坐標圖。

圖8是顯示在實施例2及比較例2中研究凝固時間的結果的坐標圖。

【實施方式】

【1.凝固時間的測定方法】

本實施方式涉及的凝固時間的測定方法(以下，也簡稱為“測定方法”)的特征在于包括：將血液待測樣品、活化劑、磷脂和錳離子形成化合物混合的混合工序、及

將混合工序中得到的樣品和鈣鹽混合而調制測定樣品，測定測定樣品的凝固時間的測定工序，

在混合工序中，與活化劑及磷脂不同地，將血液待測樣品和錳離子形成化合物混合。在本實施方式涉及的測定方法在混合工序中，與活化劑及磷脂不同地，將血液待測樣品和錳離子形成化合物混合。從而，由本實施方式涉及的測定方法使抑制在凝固時間的測定時凝固時間變得過長變得可能。

再者，在本說明書中，“樣品”是指血液待測樣品、活化劑、磷脂和錳離子形成化合物的混合物。另外，“測定樣品”是指血液待測樣品、活化劑、磷脂、錳離子形成化合物和鈣鹽的混合物。

作為血液待測樣品，例如，可舉出血漿等，但不特別限定。在本說明書中，“被檢血漿”是指從被檢者得到的血漿。另外，“正常血漿”是指從健康者的血液得到的血漿。正常血漿也可為市售的正常血漿。

活化劑是有使與內源性凝固途徑相關的接觸因子活化的作用的物質即可。作為接觸因子，例如，可舉出前激肽釋放酶、高分子激肽原、第XII因子、第XI因子等，但不特別限定。作為活化劑，例如，可舉出鞣花酸化合物、氧化硅、高嶺土、硅藻土(例如，硅藻土公司制、商品名：硅藻土(注冊商標)等)等，但不特別限定。這些活化劑可單獨使用，也可將2種以上混合使用。鞣花酸化合物是指含鞣花酸、鞣花酸的鹽及鞣花酸的金屬絡合物的概念。

磷脂促進血液的凝固反應。磷脂是在分子結構中有磷酸酯部位的脂質。磷脂可為天然來源磷脂，也可為合成磷脂。作為天然來源磷脂，例如，可舉出兔、牛、豬、雞、人等的動物、大豆等的植物來源的磷脂等，但不特別限定。作為動物來源的磷脂，例如，可舉出兔腦、牛腦、卵黃、人胎盤等來源的磷脂等，但不特別限定。作為磷脂，具體而言，例如，可舉出磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸等的甘油磷脂等，但不特別限定。這些磷脂之中，為使血液的凝固反應有效率地進行，優選為磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿及磷脂酰絲氨酸。這些磷脂可單獨使用，也可將2種以上混合使用。作為磷脂所具有的脂肪酸側鏈，例如，可舉出棕櫚酰基、油酰基、硬脂酰基等，但不特別限定。這些脂肪酸側鏈可在不妨礙血液的凝固反應的范圍內適宜選擇。

錳離子形成化合物是在血液待測樣品中形成錳離子的化合物即可。錳離子形成化合物優選是形成2價離子的化合物。作為錳離子形成化合物，例如，可舉出氯化錳、過錳酸鉀、硫酸錳、硝酸錳、醋酸錳等，但不特別限定。這些錳離子形成化合物之中，優選為氯化錳。這些錳離子形成化合物可單獨使用，也可將2種以上混合使用。

鈣鹽是在測定樣品中形成鈣離子的鹽即可。作為鈣鹽，可舉出氯化鈣、硫酸鈣、亞硝酸鈣、碳酸鈣、乳酸鈣、酒石酸鈣等，但不特別限定。這些鈣鹽可單獨使用，也可將2種以上混合使用。

在本實施方式涉及的測定方法中，包括以下方法。

(實施方式1)將血液待測樣品、活化劑和磷脂混合后，添加錳離子形成化合物的方法

(實施方式2)將血液待測樣品和錳離子形成化合物混合后，添加活化劑及磷脂的方法

以下，舉實施方式1的方法為例進行說明，但不特別限定。在實施方式1的方法中，混合工序包括：

(A)將血液待測樣品、活化劑和磷脂混合而得到混合物的工序，

(B)將混合物和錳離子形成化合物混合的工序。

在工序(A)之前，也可將血液待測樣品加溫到對于進行凝固反應適宜的溫度。血液待測樣品的加溫溫度通常優選為30～45℃、更優選為36～38℃。

在工序(A)中，將血液待測樣品、活化劑和磷脂混合而得到混合物。血液待測樣品、活化劑和磷脂的混合的順序不特別限定。可將活化劑及磷脂同時與血液待測樣品混合。另外，也可將活化劑及磷脂在不同的時機與血液待測樣品混合。此時，可在向血液待測樣品的活化劑的添加后添加磷脂，也可在向血液待測樣品的磷脂的添加后添加活化劑。

在工序(A)中，與血液待測樣品混合的活化劑的量是測定樣品中的活化劑的濃度成為指定濃度的量即可。測定樣品中的活化劑的濃度可根據活化劑的種類適宜設定。活化劑是鞣花酸化合物時，測定樣品中的活化劑的濃度通常優選為3.5～150μM、更優選是10～50μM。活化劑是氧化硅時，測定樣品中的活化劑的濃度通常優選為0.04～0.4mg/mL、更優選是0.07～0.2mg/mL。

在工序(A)中，與血液待測樣品混合的磷脂的量是測定樣品中的磷脂的濃度成為指定濃度的量即可。測定樣品中的磷脂的濃度可根據磷脂的種類適宜設定。磷脂是磷脂酰乙醇胺時，測定樣品中的磷脂的濃度通常優選為1～150μg/mL、更優選是5～50μg/mL。磷脂是磷脂酰膽堿時，測定樣品中的磷脂的濃度通常優選為1～100μg/mL、更優選是5～80μg/mL。磷脂是磷脂酰絲氨酸時，測定樣品中的磷脂的濃度通常優選為0.1～50μg/mL、更優選是1～10μg/mL。磷脂是2種以上的磷脂的混合物時，測定樣品中的各磷脂的濃度的合計通常優選為5～400μg/mL、更優選是20～100μg/mL。

血液待測樣品和活化劑及/或磷脂的混合時的加溫溫度是對于進行血液的凝固反應適宜的溫度即可。加溫溫度通常優選為30～45℃、更優選為36～38℃。另外，加溫時間通常優選為10～150秒鐘、更優選是30～90秒鐘。

在工序(B)中，將工序(A)中得到的混合物與錳離子形成化合物混合而得到樣品。

在工序(B)中，與工序(A)中得到的混合物混合的錳離子形成化合物的量是測定樣品中的錳離子形成化合物的終濃度成為指定濃度的量即可。測定樣品中的錳離子形成化合物的終濃度優選為0.1μM以上、更優選是0.1mM以上，優選不足10mM、更優選是5mM以下。

工序(A)中得到的混合物和錳離子形成化合物的混合時的加溫溫度是對于進行血液的凝固反應適宜的溫度即可。溫度通常優選為30～45℃、更優選為36～38℃。另外，加溫時間通常優選為30～420秒鐘、更優選是100～350秒鐘。

從有效抑制在凝固時間的測定時凝固時間變得過長的觀點來看，優選在工序(A)中的血液待測樣品、活化劑和磷脂的混合結束時起150秒鐘以內、優選為60秒鐘以內，在工序(B)中，向混合物混合錳離子形成化合物。

在測定工序中，將混合工序中得到的樣品和鈣鹽混合而調制測定樣品，測定測定樣品的凝固時間。

與樣品混合的鈣鹽的量是測定樣品中的鈣鹽的濃度成為指定濃度的量即可。測定樣品中的鈣鹽的濃度優選為2～20mM、更優選是4～10mM。

在測定工序中，在將樣品和鈣鹽混合之前，也可將樣品加溫到對于進行凝固反應適宜的溫度。樣品的加溫溫度，從凝固反應的反應性的觀點來看，優選為30℃以上、更優選是36℃以上，從蛋白質的穩定性觀點來看，優選為45℃以下，更優選是38℃以下。此時，加溫時間，從凝固反應的反應性的觀點來看，優選為1分鐘以上、更優選是2分鐘以上，從蛋白質的穩定性觀點來看，優選為6分鐘以下，更優選是5分鐘以下。

測定樣品的凝固時間可基于凝固信息研究。作為凝固信息，例如，可舉出向測定樣品照射光時的透射光或散射光的變化、測定樣品的粘度的變化等，但不特別限定。此時，測定樣品的凝固時間可通過向測定樣品照射光，監測透過測定樣品的透射光或來自測定樣品散射光的變化、監測測定樣品的粘度的變化等來探明。其中，在本說明書中，“凝固時間”是指活化部分促凝血酶原激酶時間。凝固時間是從樣品和鈣鹽的混合開始時至血漿凝固的時間。

血漿的凝固，例如，可以來自照射光的測定樣品的光的變化消失，測定樣品的粘度的變化消失等作為指標判斷。

【2.凝固時間的測定裝置】

[測定裝置的整體構成]

基于附圖說明在前述的測定方法中使用的凝固時間的測定裝置(以下，也簡稱為“測定裝置”)的一例。如圖1所示，測定裝置10含測定單元20和處理裝置30。測定單元20和處理裝置30能通信地連接。

[測定單元的構成]

如圖1所示，測定單元20含樣品調制部100、檢測部200、試劑收容部300、收容血液待測樣品的待測樣品收容部400和控制部500。

樣品調制部100在從試劑收容部300取得試劑的同時，從待測樣品收容部400取得血液待測樣品。另外，樣品調制部100通過將取得的試劑和血液待測樣品以指定的處理順序混合來調制測定樣品。樣品調制部100含待測樣品搬送部111、第1試劑搬送部112、第2試劑搬送部113、第3試劑搬送部114、第4試劑搬送部115和比色杯搬送部131。待測樣品搬送部111有第1噴嘴101。待測樣品搬送部111取得待測樣品收容部400內收容的血液待測樣品。另外，待測樣品搬送部111將取得的血液待測樣品吐出到比色杯90內。第1試劑搬送部112有第2噴嘴102。第1試劑搬送部112由第2噴嘴102，取得試劑收容部300的第1容器301內收容的試劑。另外，第1試劑搬送部112將取得的試劑吐出到比色杯90內。第2試劑搬送部113有第3噴嘴103。第2試劑搬送部113由第3噴嘴103，取得試劑收容部300的第2容器302內收容的試劑。另外，第2試劑搬送部113將取得的試劑吐出到比色杯90內。第3試劑搬送部114由第4噴嘴104，取得試劑收容部300的第3容器303內收容的試劑。另外，第3試劑搬送部114將取得的試劑吐出到比色杯90內。第4試劑搬送部115由第5噴嘴105，取得試劑收容部300的第4容器304內收容的試劑。另外，第4試劑搬送部115將取得的試劑吐出到比色杯90內。比色杯搬送部131將收容了調制的測定樣品的比色杯90搬送到檢測部200。

檢測部200含光照射部201、光接收部202和第2比色杯裝載部203。光照射部201有對測定樣品的照射光的光源。照射光的波長是對于監測伴隨血液的凝固反應的進行的變化適宜的波長即可。光接收部202接收來自測定樣品的光。另外，來自測定樣品光可為透射光，也可為散射光。光接收部202將對應于接收的光的量的電信號輸出到處理裝置的算出部31。第2比色杯裝載部203設在光照射部201和光接收部202之間。在第2比色杯裝載部203上裝載從樣品調制部100搬送的比色杯90。

試劑收容部300收容凝固時間的測定中使用的試劑。在本實施方式中，試劑收容部300含收容活化劑的第1容器301、收容磷脂的第2容器302、收容錳離子形成化合物的第3容器303及收容鈣鹽的第4容器304。在第1～第4容器上各自設有用于識別各容器中收容的試劑的種類的識別子。作為識別子，例如，可舉出條碼等，但不特別限定。再者，在本實施方式中，第1容器301和第2容器302作為不同的容器設在試劑收容部300。但是，由于活化劑和磷脂可同時與血液待測樣品混合，因此也可代替第1容器及第2容器而在同一容器中收容活化劑及磷脂。此時，第1試劑搬送部112和第2試劑搬送部113是共同的搬送部。

待測樣品收容部400收容血液待測樣品。在本實施方式中，待測樣品收容部400具備多個待測樣品容器401。另外，待測樣品收容部400將收容期望的血液待測樣品的待測樣品容器401搬送到指定的待測樣品吸引位置。在多個待測樣品容器401各自設有用于識別各容器中收容的血液待測樣品的種類的識別子。作為識別子，例如，可舉出條碼等，但不特別限定。

控制部500含CPU(中央處理器)501和存儲部502。控制部500由計算機構成。CPU501實行存儲部502中存儲的計算機程序。由此，CPU501進行樣品調制部100中的樣品調制的處理以及檢測部200中的關于測定樣品的光學信息的取得的處理。作為計算機程序，例如，可舉出測定樣品的調制用的計算機程序、關于測定樣品的光學信息的取得用的計算機程序等，但不特別限定。另外，存儲部502還存儲用于識別試劑收容部300中收容的試劑的試劑識別信息、關于調制測定樣品時的處理順序的樣品調制信息、及用于識別待測樣品收容部400中收容的血液待測樣品的待測樣品識別信息。作為樣品識別信息，例如，可舉出試劑的種類和收容容器的位置和識別子的關聯的信息等，但不特別限定。另外，作為待測樣品識別信息，例如，可舉出血液待測樣品的種類和收容容器的位置和識別子的關聯的信息等，但不特別限定。CPU501使用存儲部502中存儲的試劑識別信息及樣品調制信息，實行用于測定樣品的調制的計算機程序。由此，CPU501使測定單元20的樣品調制部10進行測定樣品的調制。

[處理裝置的構成]

處理裝置30，如圖1所示，含算出部31、顯示部32和輸入部33。在本實施方式中，處理裝置30由計算機系統構成。算出部31含CPU601和存儲部602。CPU601實行存儲部602中存儲的計算機程序。由此，CPU601進行凝固時間的算出的處理。作為顯示部32，例如，可舉出顯示屏等，但不特別限定。顯示部32，例如，顯示算出的凝固時間的信息等。作為輸入部33，例如，可舉出鍵盤、鼠標等，但不特別限定。

存儲部602安裝有用于使CPU601實行的操作系統、應用程序等的計算機程序及在計算機程序的實行中使用的數據。作為應用程序，例如，可舉出凝固時間的測定用的計算機程序等，但不特別限定。CPU601實行存儲部602中存儲的用于凝固時間的測定的計算機程序。由此，CPU601使測定裝置10進行凝固時間的測定。

[測定裝置的變形例]

待測樣品搬送部111、第1試劑搬送部112、第2試劑搬送部113、第3試劑搬送部114及第4試劑搬送部115也可為用于使待測樣品或試劑流動的流路。作為流路，可舉出管等，但不特別限定。

另外，凝固時間也可基于隨血液的凝固的粘度的增加及其他的凝固信息測定。在基于隨血液的凝固的粘度的增加而測定凝固時間時，檢測部200具備高頻率發送線圈、高頻率接收線圈、在高頻率發送線圈和高頻率接收線圈之間的裝載收容鋼球的比色杯的比色杯裝載部、在比色杯裝載部的兩端設的電磁鐵。比色杯內的鋼球由電磁鐵發生的磁力左右簡諧振動。此簡諧振動隨粘度增加而減少。如果測定樣品的凝固開始，則測定樣品的粘度增加，從而鋼球的振幅減少。從而，檢測部200通過高頻率接收線圈接收高頻率發送線圈發送的高頻率，檢測振幅的變化。另外，處理裝置30的算出部31基于檢測的振幅的變化，算出凝固時間。

[凝固時間的測定裝置的處理順序]

接下來，基于圖2，說明由測定裝置10的凝固時間的測定的處理順序的概要。在以下的處理順序中，測定單元20的控制部500使用從存儲部502取得的試劑識別信息及樣品調制信息，實行存儲部502中存儲的用于測定樣品的調制的計算機程序。另外，控制部500實行存儲部502中存儲的關于測定樣品的光學信息的取得用的計算機程序。處理裝置30的算出部31使用取得的光學信息，實行存儲部602中存儲的凝固時間的測定用的計算機程序。

首先，在步驟S1中，測定單元20的控制部500使樣品調制部100實行樣品的調制。步驟S1的樣品的調制根據后述的圖3及圖4所示的處理順序實行。

其后，在步驟S2中，控制部500使樣品調制部100實行向樣品的鈣鹽的添加。另外，在步驟S3中，控制部500使檢測部200實行關于測定樣品的光學信息的取得。步驟S2的向樣品的鈣鹽的添加和步驟S3的光學信息的取得根據圖5所示的處理順序實行。

其后，在步驟S4中，處理裝置30的算出部31通過實行用于凝固時間的算出的計算機程序，算出凝固時間。

[樣品的調制的處理順序]

接下來，基于圖3及圖4，說明由測定裝置10的樣品的調制的處理順序的概要。

首先，在步驟S101中，控制部500使樣品調制部100實行向圖1中的樣品調制位置62的比色杯90的配置。具體而言，控制部500使樣品調制部100將比色杯90裝載至位于圖1中的第1比色杯裝載部61。由此進行向樣品調制位置62的比色杯90的配置。

接下來，在步驟S102中，控制部500使待測樣品收容部400實行向圖1中的待測樣品吸引位置81的待測樣品容器401的搬送。此時，控制部500基于存儲部502中存儲的待測樣品識別信息，在待測樣品收容部400選擇收容期望的血液待測樣品的待測樣品容器401。進而，控制部使待測樣品收容部400將選擇的待測樣品容器401搬送至位于待測樣品吸引位置81。

接下來，在步驟S103中，控制部500使樣品調制部100實行向待測樣品吸引位置81的第1噴嘴101的移動。其后，在步驟S104中，控制部500使樣品調制部100實行自待測樣品容器401吸引血液待測樣品。具體而言，控制部500使樣品調制部100經第1噴嘴101吸引待測樣品容器401中收容的血液待測樣品。

接下來，在步驟S105中，控制部500使樣品調制部100實行向樣品調制位置62的第1噴嘴101的移動。其后，在步驟S106中，控制部500使樣品調制部100實行向比色杯90的血液待測樣品的吐出。具體而言，控制部500使樣品調制部100將用第1噴嘴101吸引的血液待測樣品吐出到比色杯90。

接下來，在步驟S107中，控制部500使樣品調制部100實行向活化劑吸引位置71的第2噴嘴102的移動。其后，在步驟S108中，控制部500使樣品調制部100實行自第1容器301吸引活化劑。具體而言，控制部500使樣品調制部100經第2噴嘴102吸引第1容器301中收容的活化劑。

接下來，在步驟S109中，控制部500使樣品調制部100實行向樣品調制位置62的第2噴嘴102的移動。其后，在步驟S110中，控制部500使樣品調制部100實行向比色杯90的活化劑的吐出。具體而言，控制部500使樣品調制部100將用第2噴嘴102吸引的活化劑吐出到比色杯90。

接下來，在圖4的步驟S111～步驟S114的各步驟中，控制部500使樣品調制部100實行向磷脂吸引位置72的第3噴嘴103的移動、自第2容器302吸引磷脂、向樣品調制位置62的第3噴嘴103的移動及向比色杯90的磷脂的吐出。步驟S111～步驟S114的各步驟除由第3噴嘴103進行磷脂的吸引及吐出的一系列的處理之外，與圖3的步驟S107～步驟S110的各步驟相同。

接下來，在步驟S115至步驟S118的各步驟中，控制部500使樣品調制部100實行向錳離子形成化合物吸引位置73的第4噴嘴104的移動、自第3容器303吸引錳離子形成化合物、向樣品調制位置62的第4噴嘴104的移動及向比色杯90的錳離子形成化合物的吐出。從步驟S115步驟S118的各步驟除由第4噴嘴104進行錳離子形成化合物的吸引及吐出的一系列的動作之外，與圖3的步驟S107至步驟S110相同。由此得到樣品。

再者，在本實施方式中，以活化劑的添加及磷脂的添加的順序進行向血液待測樣品的活化劑及磷脂的添加。但是，活化劑及磷脂的添加也可同時進行。

[向樣品的鈣鹽的添加及光學信息的取得的處理順序]

接下來，基于圖5，說明由測定裝置10的向樣品的鈣鹽的添加及光學信息的取得的處理順序的概要。

在圖5的步驟S201～步驟S204的各步驟中，控制部500使樣品調制部100實行向鈣鹽吸引位置74的第5噴嘴105的移動、自第2容器302吸引鈣鹽、向樣品調制位置62的第5噴嘴105的移動及向比色杯90的鈣鹽的吐出。由此得到測定樣品。步驟S201～步驟S204的各步驟除由第5噴嘴105進行鈣鹽的吸引及吐出的一系列的處理之外，與圖3的步驟S107～步驟S110的各步驟相同。

與步驟S204同時，在步驟S301中，控制部500在樣品調制部100中，經比色杯搬送部131而將比色杯90搬送到檢測部200的第2比色杯裝載部203。另外，在步驟S301中，控制部500使檢測部200實行向測定樣品的光照射。具體而言，控制部500在檢測部200的光照射部201中，對于第2比色杯裝載部203中裝載的比色杯90，照射光。由此，向比色杯90內的測定樣品照射光。

接下來，在步驟302中，控制部500使檢測部200實行來自測定樣品的光的測定。具體而言，控制部500使檢測部200的光接收部202將接收的對應于透射光的量的電信號輸出到處理裝置的算出部31。

其后，處理進行到圖2的步驟S4中的凝固時間的算出。

[處理順序的變形例]

步驟S107～步驟S110的一系列的步驟和步驟S111～步驟S114的一系列的步驟也可并行進行。另外，步驟S115～步驟S118的一系列的步驟也可先于步驟S107～步驟S110的一系列的步驟及步驟S111～步驟S114的一系列的步驟這兩者進行。

另外，在基于隨血液的凝固的粘度的增加而測定凝固時間時，作為檢測部200，可使用具備高頻率發送線圈、高頻率接收線圈、裝載收容鋼球的比色杯的比色杯裝載部和電磁鐵的檢測部。其中，控制部500通過由高頻率接收線圈接收檢測部200的高頻率發送線圈發送的高頻率檢測振幅的變化。接下來，控制部500使檢測部200將關于振幅的變化的信息輸出到處理裝置30。其后，處理裝置30的算出部31使用關于取得的振幅的變化的信息，通過實行存儲部602中存儲的用于凝固時間的測定的計算機程序，算出凝固時間。

【3.凝固時間測定用試劑】

本實施方式涉及的凝固時間測定用試劑是含有錳離子形成化合物的、用于在前述的凝固時間的測定方法中使用的凝固時間測定用試劑。錳離子形成化合物與前述的測定方法中的錳離子形成化合物相同。

本實施方式涉及的凝固時間測定用試劑可為基本上由錳離子形成化合物組成的試劑，也可除錳離子形成化合物外還含有適宜的溶劑、助劑等的試劑。再者，本實施方式涉及的凝固時間測定用試劑基本上不含有磷脂和活化劑。

凝固時間測定用試劑可以固體的狀態提供。此時，作為凝固時間測定用試劑的劑型，例如，可舉出粒劑、粉劑等，但不特別限定。

凝固時間測定用試劑可為使錳離子形成化合物溶解于適宜的溶劑的狀態。此時，作為溶劑，例如，可舉出脫鹽純化水、生理鹽水等，但不特別限定。

在凝固時間測定用試劑是使錳離子形成化合物溶解于適宜的溶劑的狀態的試劑時，凝固時間測定用試劑中的錳離子形成化合物的含量優選為1μM以上、更優選是0.1mM以上，優選為50mM以下，更優選是10mM以下。

在凝固時間測定用試劑還含有助劑時，作為助劑，例如，可舉出錳離子形成化合物的穩定化劑、保存劑等，但不特別限定。

【4.試劑盒】

本實施方式涉及的試劑盒是含第1試劑容器中收容的含活化劑和磷脂的第1試劑、第2試劑容器中收容的含錳離子形成化合物的第2試劑及第3試劑容器中收容的含鈣鹽的第3試劑的試劑盒。作為本實施方式涉及的試劑盒的一例，可舉出圖6所示的試劑盒800等，但不特別限定。圖6所示的試劑盒800含第1試劑容器801、第2試劑容器802和第3試劑容器803。第1試劑容器801收容含活化劑和磷脂的第1試劑。第2試劑容器802收容含錳離子形成化合物的第2試劑。第3試劑容器803收容含鈣鹽的第3試劑。試劑盒也可還含附帶文書。附帶文書也可含使用本實施方式涉及的試劑盒進行上述的凝固時間的測定方法的操作順序等的記載。

第1試劑中的活化劑的濃度是可將測定樣品中的濃度調整到上述的測定方法中的濃度的范圍的范圍即可。在活化劑是鞣花酸化合物時，第1試劑中的活化劑的濃度通常優選為10～400μM、更優選是50～150μM。活化劑是氧化硅時，第1試劑中的活化劑的濃度通常優選為0.1～1mg/mL、更優選是0.2～0.6mg/mL。

第1試劑中的磷脂的濃度是可將測定樣品中的濃度調整到上述的測定方法中的濃度的范圍的范圍即可。第1試劑中的磷脂的濃度通常優選為30～400μg/mL、更優選是10～100μg/mL。磷脂是磷脂酰乙醇胺時，第1試劑中的磷脂的濃度通常優選為10～100μg/mL、更優選是20～50μg/mL。磷脂是磷脂酰膽堿時，測定樣品中的磷脂的濃度通常優選為10～300μg/mL、更優選是10～100μg/mL。磷脂是磷脂酰絲氨酸時，測定樣品中的磷脂的濃度通常優選為1～75μg/mL、更優選是2～15μg/mL。

第2試劑可為固體的狀態的錳離子形成化合物，也可為使錳離子形成化合物溶解于適宜的溶劑的狀態。溶劑與上述的凝固時間測定用試劑中的溶劑相同。

在第2試劑是使錳離子形成化合物溶解于適宜的溶劑的狀態的試劑時，第2試劑中的錳離子形成化合物的濃度是可將測定樣品中的濃度調整到上述的測定方法中的濃度的范圍的范圍即可。此時，第2試劑中的錳離子形成化合物的濃度優選為1μM以上、更優選是0.1mM以上，優選為50mM以下，更優選是10mM以下。

第3試劑中的鈣鹽的濃度是可將測定樣品中的濃度調整到上述的測定方法中的濃度的范圍的范圍即可。第3試劑中的鈣鹽的濃度優選為2.5～40mM、更優選是10～30mM。

在本實施方式涉及的試劑盒中，第2試劑基本上不含有磷脂和活化劑。另外，在本實施方式涉及的試劑盒中，第1試劑基本上不含有錳離子形成化合物。

在試劑盒中使用的活化劑、磷脂、錳離子形成化合物及鈣鹽與在前述的測定方法中使用的相同。另外，在各試劑容器中，也可適宜地收容有適宜的溶劑、助劑等。溶劑及助劑與凝固時間測定用試劑中使用的溶劑及試劑相同。再者，在本實施方式涉及的試劑盒中，活化劑及磷脂也可在不同的容器中收容。

【實施例】

在下文中，凝固時間的測定由全自動凝固時間測定裝置〔Sysmex(株)制、商品名：CS-2000i〕進行。

【實施例1】

在本實施例中，作為血液待測樣品，使用正常血漿、被檢血漿或混合血漿(被檢血漿/正常血漿(體積比)＝1/1)。作為正常血漿，使用表1所示的正常血漿。另外，作為被檢血漿，使用表1所示的LA陽性患者的血漿、表2所示的肝素添加血漿以及表3所示的第VIII凝血因子缺損患者的血漿及第IX凝血因子缺損患者的血漿。再者，表3中，“PNP”是Pooled Normal Plasma的略語。

【表1】

【表2】

【表3】

將血液待測樣品50μL于37℃加溫60秒鐘。向加溫后的血液待測樣品添加APTT試劑〔Roche·Diagnostics公司制、商品名：PTT-LA(注冊商標)〕50μL，混合。將得到的混合物于37℃加溫20秒鐘。向加溫后的混合物添加2.5mM氯化錳水溶液20μL，混合。將得到的混合物于37℃加溫170秒鐘。向加溫后的混合物添加作為凝固反應促進劑的25mM氯化鈣水溶液，測定得到的測定樣品的凝固時間。

使用得到的凝固時間算出循環抗凝物指數(ICA)。ICA根據下述式(I)算出：

ICA＝[(D-A)/G]×100 (I)

〔式中，A表示正常血漿的凝固時間、D表示混合血漿(被檢血漿/正常血漿(體積比)＝1/1)的凝固時間。〕。

由實施例1的測定方法得到的ICA示于圖7。圖中，白色圓點表示LA陽性患者的血漿的ICA、叉號表示LA陽性患者以外的血漿的ICA。再者，“LA陽性患者以外的血漿”是指肝素添加血漿、第VIII凝血因子缺損患者的血漿及第IX凝血因子缺損患者的血漿。

【比較例1】

在本比較例中，作為血液待測樣品，使用與實施例1同樣的血液待測樣品。將血液待測樣品50μL于37℃加溫60秒鐘。向加溫后的血液待測樣品添加APTT試劑〔Roche·Diagnostics公司制、商品名：PTT-LA(注冊商標)〕50μL，混合。將得到的混合物于37℃加溫170秒鐘。向加溫后的混合物添加25mM氯化鈣水溶液，測定得到的測定樣品的凝固時間。

使用得到的凝固時間，根據式(I)算出ICA。由比較例1的測定方法得到的ICA示于圖7。圖中，白色圓點表示LA陽性患者的血漿的ICA、叉號表示LA陽性患者以外的血漿的ICA。

【結果】

從圖7所示的結果，實施例1的測定方法的情況，LA陽性患者的血漿的ICA集中在28～39的范圍。另外，LA陽性患者以外的血漿的ICA集中在0～24的范圍。從而得知，由實施例1的測定方法可區別LA陽性患者的血漿和LA陽性患者以外的血漿。

另外，從圖7所示的結果看，由實施例1的測定方法得到的ICA是與可由比較例1的測定方法的ICA比整體高的值。從而得知，由實施例1的測定方法，可與比較例1的測定方法比，以更高靈敏度檢測LA陽性患者的血漿。

【實施例2】

除作為血液待測樣品使用正常血漿之外，進行與實施例1同樣的操作，測定凝固時間。由實施例2的測定方法得到的凝固時間示于圖8。

【比較例2】

除作為血液待測樣品使用正常血漿之外，進行與比較例1同樣的操作，測定凝固時間。由比較例2的測定方法得到的凝固時間示于圖8。

【結果】

從圖8所示的結果，由實施例2的測定方法得到的凝固時間與可由比較例2的測定方法測得的凝固時間比，整體性地短。從而得知，在使用APTT試劑的凝固時間的測定中，在凝固反應促進劑的添加前，通過將錳離子形成化合物添加到血液待測樣品，能抑制凝固時間的過度的延長。