細粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶的應用的制作方法

本發明涉及生物技術領域，更具體的說是涉及細粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶的應用。

背景技術：

細粒棘球蚴病又稱囊性包蟲病，是由細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus)的中絳期幼蟲引起的一種人獸共患病，主要寄生在人和家畜等多種哺乳動物體內。90％以上的細粒棘球蚴包囊生長于宿主的肝臟、肺臟或者同時生長于肝肺。細粒棘球蚴病呈世界性分布，引起一系列的經濟和公共衛生問題。在一些流行地區，其感染率可高達5-10％，死亡率高達2-4％。據估計，全球人囊性棘球蚴病每年至少損失1-3.6百萬傷殘調整生命年(DALYs)，而動物囊性棘球蚴病每年造成的經濟損失至少為20億美元。因此，世界衛生組織已經把棘球蚴病列為《被忽視的熱帶疾病》，作為其2008-2015年重點防治計劃。

缺乏標準有效的特異性重組抗原是細粒棘球蚴病免疫診斷中的一個尚未解決的難題。目前，細粒棘球蚴病免疫診斷的研究主要集中在粗囊液抗原上，但是其成分復雜，具有難以大量提純、抗原來源不穩定、成本高、診斷特異性低等缺陷。與囊液抗原相比，重組抗原具有特異性好以及來源穩定等優點。目前，動物細粒棘球蚴病的重組診斷抗原的報道還很少，劉紅霞等用細粒棘球蚴CE18重組蛋白檢測綿羊細粒棘球蚴病，發現其他帶科絳蟲病陽性血清如羊腦多頭蚴病血清和羊細頸囊尾蚴病血清均存在交叉反應，特別是和羊細頸囊尾蚴病血清的交叉反應概率較高，不能準確診斷綿羊細粒棘球蚴病。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的目的在于提供細粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶的應用，使其能夠能被自然感染細粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，具有良好的免疫原性，并具有較高的特異性和靈敏度，減少與其他帶科絳蟲病陽性血清的交叉反應。

二氫葉酸還原酶(DHFR)能催化二氫葉酸生成四氫葉酸，進而合成四氫葉酸類輔酶，參與體內核酸和氨基酸的合成，在生物體中發揮重要作用。二氫葉酸還原酶抑制劑能選擇性的與二氫葉酸還原酶結合，抑制其催化還原活性，使二氫葉酸不能順利轉變為四氫葉酸，阻礙葉酸代謝，干擾DNA和蛋白質的合成，最終導致細胞死亡，所以二氫葉酸還原酶抑制劑具有抗癌以及抗寄生蟲的作用。

DHFR在原蟲上研究的比較廣泛，如瘧原蟲、利什曼原蟲、錐蟲、弓形蟲等，但在蠕蟲上并未見相關研究，因此，本發明對細粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶(Eg-DHFR)進行了生物信息學分析，并通過反轉錄表達出rEg-DHFR蛋白，制備出抗rEg-DHFR的多克隆抗體，對該蛋白進行免疫印跡分析表明其可被自然感染細粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，具有良好的免疫原性，利用rEg-DHFR蛋白建立細粒棘球蚴病間接ELISA診斷方法，為細粒棘球蚴病的防控提供監測手段。

因此，本發明提出了細粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶在制備檢測細粒棘球蚴病的免疫抗原和/或試劑盒中的應用。

其中，作為優選，所述試劑盒為ELISA檢測試劑盒或免疫印跡檢測試劑盒。

同時，本發明還提供了一種檢測細粒棘球蚴病的ELISA檢測試劑盒，包括細粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶(作為抗原進行包被)和ELISA檢測試劑盒常規組分。所述試劑盒依據間接ELISA檢測原理。

作為優選，所述ELISA檢測試劑盒常規組分包括抗原包被液、酶標板、封閉液、HRP標記的二抗和TMB底物。

進一步優選地，所述封閉液為5％脫脂奶粉；所述HRP標記的二抗為HRP標記的山羊或綿羊抗兔二抗。

在具體的ELISA檢測過程中，抗原包被的最佳條件是4℃過夜，抗原最佳濃度為0.6μg/每孔，血清最佳稀釋濃度為1:320，最佳封閉液和封閉條件是5％脫脂奶粉37℃封閉1h，血清孵育最佳時間是37℃ 1.5h，二抗孵育最佳時間是37℃ 1h，二抗最佳稀釋濃度為1:3000時，底物顯色的最佳條件是37℃15min。在以上條件下，測得陰陽性血清的P/N值為3.86。

作為優選，所述ELISA檢測試劑盒常規組分還包括顯色反應終止液H₂SO₄、洗滌液PBST和稀釋液PBS。

本發明先提取細粒棘球絳蟲總RNA，而后進行反轉錄獲得cDNA，根據GeneDB(http://www.genedb.org/Homepage/Egranulosus)中公布的Eg-DHFR(EgrG_000572400)的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物擴增目的片段，然后進行測序驗證，其與GeneDB中Eg-DHFR(EgrG_000572400)的序列同源性達到100％。最后連接至表達載體中，轉入大腸桿菌中表達，獲得細粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶的反轉錄重組蛋白rEg-DHFR。

免疫印跡顯示rEg-DHFR能被自然感染細粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，具有良好的免疫原性。間接ELISA結果顯示，該方法的cut-off值為0.4014，特異性和靈敏度分別為85.7％(12/14)和1:6400，并且與綿羊腦包蟲血清無交叉反應。

由以上技術方案可知，本發明提供了細粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶在制備檢測細粒棘球蚴病的免疫抗原和/或試劑盒中的應用，其作為免疫抗原能夠被自然感染細粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別，應用于間接ELISA檢測時，具備較高的特異性和靈敏度，臨床檢測符合率高達97.9％。以細粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶為免疫抗原建立的檢測方法具有良好的診斷效果，可以用于疫區綿羊細粒棘球蚴病的初步篩選。

附圖說明

圖1所示為Eg-DHFR PCR擴增凝膠圖；其中，M為DNA分子質量標準DL2000；1為空白對照；2為Eg-DHFR cDNA PCR產物；

圖2所示為rEg-DHFR的western blot凝膠圖；其中，M為蛋白質標準品；1為重組菌中rEg-DHFR的表達；2為純化后的rEg-DHFR；3為兔抗rEg-DHFR-IgG識別rEg-DHFR；4為健康兔血清識別rEg-DHFR；5為自然感染細粒棘球蚴病的綿羊陽性血清識別rEg-DHFR；6為健康綿羊血清識別rEg-DHFR；7為兔抗rEg-DHFR-IgG識別原頭蚴粗提蛋白；8為健康兔血清識別原頭蚴粗提蛋白；

圖3所示為間接ELISA對rEg-DHFR的特異性分析圖；其中，橫坐標從左至右依次為山羊抗細頸囊尾蚴陽性血清、綿羊抗腦多頭蚴陽性血清、綿羊抗細粒棘球蚴陽性血清；Cuto-off value表示臨界值；

圖4所示為間接ELISA的臨床試驗結果圖；其中，橫坐標從左至右依次為陽性血清和陰性血清；Cuto-off value表示臨界值。

具體實施方式

本發明公開了細粒棘球絳蟲二氫葉酸還原酶的應用，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明所述應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發明內容、精神和范圍內對本文所述的應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。

在本發明具體實施方式中，各試驗所涉及的材料和試劑如下：

1、主要試劑

動物組織總RNA抽提試劑盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)和反轉錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，購自GIBCOBRL公司；DNA Marker、Protein Marker、限制性內切酶(BamH I、Hind III、EcoRI、Xho I)、T4DNA連接酶，購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Ni-NTA Agarose，購自Qiagen公司；TaqPCR MasterMix、質粒小量抽提試劑盒、HRP-DAB底物顯色試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；HRP標記的羊抗兔IgG抗體，HRP標記的兔抗山羊IgG抗體，HRP標記的兔抗綿羊IgG抗體，FITC標記的羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德生物有限公司；IPTG，弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購自Sigma公司；HiTrap Protein A HP，購自Bio-Rad公司，PCR引物合成和測序由上海英俊生物工程有限公司完成；其它試劑均為國產分析純。

2、菌株和質粒載體

宿主菌大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21(DE3)、pMD19-T Vector購自TaKaRa公司；pET32a(+)載體由四川農業大學動物寄生蟲病實驗室提供。

3、常用緩沖溶液和培養基的配制

PBS Buffer①：分別稱取下列試劑于燒杯中：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄1.42g，KH₂PO₄ 0.27g。加入約500mL滅菌雙蒸水混勻溶解，加入濃HCl使pH達到7.4，定容到1L。高壓滅菌后室溫保存。

電泳緩沖液(50×TAE Buffer)：稱取242g Tris和37.2g Na₂EDTA·2H₂O于燒杯中，加入500mL滅菌雙蒸水并混勻溶解，加58mL的CH₃COOH再次充分攪拌，定容到1L并室溫保存。

EB：將0.1gEB加入100mL的滅菌雙蒸水中，分裝后常溫保存。

LB培養基：液態培養基：分別稱取Triptone 10g，5g Yeast Extract,10g NaCl加入燒杯中溶于500mL滅菌H₂O中并用燒堿調節pH至7.0，定容到1L后高壓滅菌，4℃保存。LB平板：每1L溶液中加15g瓊脂粉，高壓滅菌，4℃保存。

IPTG溶液：電子天平稱取2g的異丙基硫代半乳糖苷溶于8mL超純水中，充分攪拌溶解后加水到10mL，用0.45μm濾膜過濾后用EP管分裝貯存于-20℃。

30％聚丙烯酰胺溶液：稱取0.8g的Bis-acrylamide和29.2g的Acrylamide，加入50mL去離子水混勻溶解，加水到100mL，用0.22μm濾膜過濾。

1M Tris-HCl(pH 6.8)：稱取12.11g的Tris于燒杯中，加80mL雙蒸水充分攪拌溶解，加濃鹽酸并使用酸度計調整pH到6.8后加水到100mL，用0.22μm濾膜過濾。

1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：取19g的Tris于燒杯中，加50mL雙蒸水充分攪拌溶解，加濃鹽酸并使用酸度計調整pH到8.8后加水到100mL，4℃保存。

10％十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液：稱取10g的SDS于燒杯中，加入80mL雙蒸水充分攪拌溶解后定容至100mL，用0.45μm濾膜過濾后常溫保存。

10％過硫酸銨溶液：稱取0.1g的APS，加水定容到1mL，常溫保存。

考馬斯亮藍染色液：用電子天平稱取0.1g考馬斯亮藍粉末于20mL酒精中，取100mL濃磷酸到200mL，用0.45μm濾膜過濾后常溫保存。

氨芐西林鈉溶液(AMP)：使用電子天平稱取1gAmpicilin粉末，吸取9mL超純水充分攪拌溶解后定容至10mL，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝EP管-20℃保存。

4、試驗動物

2只健康新西蘭兔，1.4～2.2kg，購自四川農業大學試驗動物中心。

下面結合實施例，進一步闡述本發明。

實施例1：細粒棘球蚴總RNA的提取

細粒棘球蚴包囊來自于自然感染的綿羊肝臟，樣本采自青海西寧或四川甘孜，保存于液氮中。

取出液氮保存的細粒棘球蚴，用研缽將其磨碎，隨后參照天根的動物組織RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。

(1)每10-20mg原頭蚴加300μL裂解液，使用研磨棒研磨；

(2)向勻漿液中加入Proteinase K(10μL)和RNase-Free ddH2O(590μL)，混勻后反應15min(56℃)。

(3)離心5min(12,000rpm)，將上清轉移到干凈的管子中；在管子中加入0.5倍上清體積的無水乙醇，混勻后轉入吸附柱中，離心1min(12,000rpm)后棄廢液。

(4)在吸附柱中加去蛋白質液RW1(350μL)，離心1min(12,000rpm)后，棄廢液。

(5)將DNase I工作液(80μL)加入吸附柱，室溫放置反應15min；隨后加去蛋白質液RW1(350μL)，離心1min(12,000rpm)后棄廢液。

(6)500μL漂洗液RW加入吸附柱中，放置2min(室溫)，離心1min(12,000rpm)后棄廢液。

(7)重復(6)。

(8)空離，棄廢液，晾干殘余漂洗液。

(9)把吸附柱放入一個新的離心管中，用RNase-Free ddH2O(30-100μL)洗脫，靜置2min(室溫)，離心2min(12,000rpm)后得到細粒棘球蚴總RNA提取液。

實施例2：第一鏈cDNA的合成

以抽提的細粒棘球蚴總RNA為模板，以Oligo dT(18)為反轉錄引物，參照Thermo公司反轉錄試劑盒說明書進行操作：

(1)冰上制備反應混合物

Oligo dT₁₈ 1μL

模板RNA 1μL

DEPC ddH₂O 1μL

(2)在70℃(5min)孵育后轉到冰上冷卻

(3)在冰上按照順序加入以下反應物：

5reaction buffer 4μL

核糖核酸酶抑制劑 1μL

10dNTP混合物 2μL

(4)37℃(5min)孵育后加RevertAid^TM反轉錄酶1μL。

(5)PCR程序：42℃，1h；70℃，10min。

(6)得到的cDNA于-80℃保存。

實施例3：Eg-DHFR基因的擴增

根據GeneDB(http://www.genedb.org/Homepage/Egranulosus)中公布的Eg-DHFR(EgrG_000572400)的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計引物：

上游：5’-CGCGGATCCATGGGGCTGAAGCGTCT-3’下劃線為BamH I

下游：5’-CCGCTCGAGATGATCATTAAGGGGATGCG-3’下劃線Xho I

擴增體系(25μL)：DNA模板各1μL，上下游引物各1μL，PCR Mixture12.5μL，滅菌雙蒸水9.5μL。

擴增條件：預變性：95℃5min；38個循環(變性：95℃，40s；退火：54℃，45s；延伸：72℃，45s)；最后延伸：72℃，10min。

以細粒棘球絳蟲原頭蚴的cDNA為模板擴增出一條576bp左右的條帶(圖1)。

實施例4：PCR產物的回收

將含有目的條帶的凝膠切下，放入EP管中，稱重。采用凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。每100mg凝膠加入400μLPC Buffer后，55℃水浴溶膠。待凝膠完全溶解后，移入吸附柱中，離心60 sec(12000rpm)，隨后加入Washing Buffer洗滌離心2次后，空離心2min(12000rpm)。晾干吸附柱內乙醇氣味，向吸附柱中加入30μL Elution Buffer，離心2min(12000rpm)，得到目的DNA片段。

實施例5：Eg-DHFR基因克隆測序和比對

(1)將下列試劑混合：4μL的Solution 1，3.5μL的模板DNA，0.5μL的pMD19-T vector，放入離心機瞬離后放于16℃恒溫水連接過夜。

(2)從-70℃出感受態細胞，室溫融化后取30μL放入空EP管中，將連接過夜的8μL產物加入EP管并用微量加樣槍輕輕吹打混勻，立刻放入冰水混合物冰浴30min。42℃水浴90s立即冰浴5min。每個EP管中加入600μL的LB溶液，37℃中180r/min培養1.5h。將混勻的溶液倒在到LB平板上，37℃冷卻1h使表面干燥，反倒平板過夜。

(3)挑取菌落到空EP管中，加入1mL LB溶液和1μLAMP溶液，160r/min震蕩培養6h至其渾濁。吸取1μL菌液擴增并將產物跑電泳后觀察。選取電泳觀察陽性的菌液送至英濰捷基公司進行測序。

把測序得到的目的片段序列放入GeneDB數據庫中比對，經測序得到的序列與GeneDB中Eg-DHFR(EgrG_000572400)的序列同源性達到100％。

實施例6：Eg-DHFR基因克隆、鑒定及轉化

1、質粒提取

測序結果比對正確后，將菌株擴大培養，參照天根生化有限公司的質粒小提試劑盒操作說明進行：

(1)取3-5mL菌液，離心收集沉淀；

(2)加入懸浮液P1懸浮菌體，并加入裂解液P2對菌液進行裂解；

(3)加入P3產生沉淀，翻轉混合，靜置10min后離心15min(12,000rpm)；

(4)取上清至收集管中，加600μL漂洗溶液PW，靜置2min，離心1min(12,000rpm)，棄廢液；

(5)重復(4)；

(6)晾干漂洗液后用90μL洗脫液回收質粒。

2、質粒酶切回收

將提取的pMD19-T-Eg-DHFR用Takara BamH I和Xho I快切酶雙酶切，37℃酶切12min，體系總體積為10μL：T克隆質粒8μL，10X QuickCut Green Buffer 1μL，QuickBamH I和Xho I 0.5μL。用微量加樣槍混勻后瞬離，37℃恒溫水浴15min后迅速取出點樣進行1％的瓊脂糖凝膠電泳并膠回收。

3、目的片段連接表達載體

將雙酶切的Eg-DHFR目的片段和pET28a(+)載體22℃連接1.5h，隨后連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，并涂于氨芐青霉素抗性的LB培養基平板上，37℃培養12h。挑取單個菌落，進行PCR鑒定。

4、pET28a-Eg-DHFR重組質粒雙酶切鑒定

對重組質粒進行雙酶切鑒定，方法參照“2、質粒酶切回收”。

實施例7：重組Eg-DHFR在大腸桿菌中的表達

1、重組蛋白的表達

(1)將測序正確的重組質粒pET28a(+)-DHFR轉入BL21(DE3)表達菌。

(2)將表達菌接種于兩瓶含100mL的新鮮的LB(含AMP 100μg/mL)培養液中，37℃搖床培養3h(160r/min)，至菌液OD590為0.6后加入誘導劑IPTG(1mmol/L)，37℃誘導5h(160r/min)，另一瓶不加IPTG做對照培養。

(3)分別取有到過后的菌液1.5mL于兩個新EP管中，4℃離心1min(12,000r/min)收集菌體，分別加入10μL 5×SDS上樣Buffer和40μL PBS溶液，充分混勻。

(4)沸水煮10min，以使菌體充分破裂，4℃離心10min(12,000r/min)，取上清進行SDS-PAGE。

(5)用考馬斯亮藍染色1h，脫色后觀察表達情況。

2、重組蛋白的可溶性分析

將含有重組質粒Pet28a-Eg-DHFR的表達菌接種于500mL含氨芐的液體培養基中，37℃培養(170rpm)至OD600＝0.6左右，加入最佳IPTG濃度，誘導6h。把菌液離心10min(8000rpm)，棄上清，沉淀用裂解液(20mM Tris-Cl,pH8.0)懸浮，超聲破碎菌體。將破碎后的菌體裂解液在4℃條件下離心10min(12,000rpm)，分離沉淀與上清；沉淀加入適量的8M尿素溶解。上清和沉淀各取40μL，分別加10μL 5×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸10min，離心10min(12,000rpm)，進行SDS-PAGE電泳，分析rEg-DHFR是否為可溶性表達。

3、SDS-PAGE電泳檢測

按蛋白質電泳儀(Bio-Rad)說明書，組裝電泳槽。配制12％的分離膠和5％的濃縮膠；把凝膠垂直置于電泳緩沖液中，將樣本和蛋白質Marker加入樣品孔中；調節恒壓為80V，20min；隨后調整電壓為200V。電泳完畢后取出凝膠，用考馬斯亮藍染色1h，沸水浴脫色15min，最后在凝膠成像系統中照相觀察。

4、重組蛋白的純化

根據上述步驟對重組菌誘導表達，獲得大量重組蛋白菌液。

(1)取1,000mL菌液，離心10min(8,000rpm)，棄上清，收集菌體。

(2)在菌體中加入裂解液。

(3)超聲波破碎，直到菌液澄清。

(4)離心10min(12,000rpm)，留上清。

(5)取鎳離子親和層析柱，用Banding Buffer平衡5-10個床體積；

(6)將樣品于0.22μm濾膜過濾后上樣；

(7)用Banding Buffer洗5-10個床體積；

(8)用含不同梯度的咪唑洗脫液進行洗脫，并收集各洗脫峰；

(9)用400mM咪唑洗脫液清洗后，用20％的乙醇洗滌至離子濃度為0，將柱子于4℃保存。

(10)將蛋白用超濾管進行超濾和濃縮，多次加入PBS進行溶液的置換，以除去原有的咪唑；

(11)蛋白濃縮后，進行SDS-PAGE檢查，并以BCA蛋白質定量試劑盒測定蛋白質濃度。

5、結果

Eg-DHFR片段成功連接在pET-28a載體上，轉化進入BL21大腸桿菌中誘導表達。在37℃條件下，用1mM IPTG誘導5h時表達量最大。表達的重組蛋白大小為27kDa左右，符合預期大小。可溶性分析結果顯示，rEg-DHFR表達為可溶性蛋白。純化后的重組蛋白為單一條帶(圖2)。

實施例8：免疫原性分析

1、兔抗rEg-DHFR-IgG的制備

將純化后的rEg-DHFR蛋白分別與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑按照1:1比例混合制備乳劑苗。對兩只新西蘭兔進行皮下四次注射免疫，每次間隔兩個周免疫一次，第一次用弗氏完全佐劑和200μg重組蛋白皮下注射免疫，后三次均用弗氏不完全佐劑和200μg重組蛋白皮下注射免疫。

免疫結束后，使用HiTrap ProteinA 1mL預裝柱和HPLC純化系統(Bio-Rad)純化血清，將流速調為1.0mL/min，使用A2Buffer洗柱子10min。將0.45μm NC膜過濾過的血清放入柱子中，0.5mL/min。用10-20ml的B Buffer洗脫，收集洗脫下來的IgG，并用50mM的Tris調節洗脫下來的IgG溶液的PH。平衡后用20％的酒精洗滌柱子，直到離子濃度降為0。通過SDS-PAGE鑒定抗體純化情況。

2、免疫印跡

(1)按照上述方法制備蛋白質電泳凝膠，對純化后的蛋白進行SDS-PAGE電泳。

(2)蛋白質電泳結束后，取蛋白質所在的相應凝膠部位，放入轉膜緩沖液中進行平衡，共3次，每次4min。

(3)將硝酸纖維素濾膜(NC膜)和24層濾紙置于轉移緩沖液中浸泡5min。

(4)按順序將陰極電極板、24層濾紙、凝膠、NC膜、24層濾紙置于Bio-Rad半干式轉印槽內，蓋上陽極電極板。

(5)將電轉移裝置接到電轉儀上，并加入轉移緩沖液35mA轉移30min。

(6)轉移結束后，取出NC膜，浸泡在3％BSA的TBST中，4℃封閉過夜。

(7)封閉結束后，剪開NC膜，陰性和陽性分開放置，加入1：1000稀釋的一抗，室溫孵育2h后，倒掉一抗，用TBST快速洗膜3次，5min/次。

(8)將HRP標記的Goat-anti-sheep IgG按1:1000稀釋后，加入NC膜，室溫孵育2h后，倒掉二抗，用TBST快速洗膜3次，5min/次。

(9)將NC膜置于平皿中，以新鮮底物顯色液沖洗直至顯色。

(10)顯色后，用雙蒸水沖洗NC膜終止顯色，并對結果進行拍照記錄。

3、結果

免疫印跡顯示，rEg-DHFR能被細粒棘球蚴病陽性綿羊血清識別，且為單一條帶(圖2)，說明rEg-DHFR具有較好的免疫原性。以兔抗rEg-DHFR-IgG識別原頭蚴粗蛋白提取液，顯示只有單一條帶，大小與天然Eg-DHFR一致(21.9kDa)，說明表達的重組蛋白確實為rEg-DHFR。

實施例9：間接ELISA方法的建立

1、間接ELISA操作步驟

(1)以抗原包被液按比列稀釋rEg-DHFR蛋白，每孔100μL加入96酶標板中進行包被；

(2)倒掉包被液，拍干孔內液體，用PBST洗滌，重復四次；

(3)加入封閉液(5％的脫脂奶粉)封閉后，洗滌四次；

(4)用PBS按比例稀釋血清后，加入酶標孔孵育，倒掉液體，洗滌四次；

(5)加入稀釋好的HRP標記的山羊或綿羊抗兔二抗，孵育，洗滌四次；

(6)在避光條件下向孔中加入可溶性單組分底物TMB進行顯色反應；

(7)在孔中加入100μL 2M H₂SO₄終止反應，在紫外吸光度為450nm時測定其OD值。

(8)倒掉液體，拍干后，按(2)所示洗滌四次，每次3min；

(9)倒掉液體，拍干后，在避光條件下進行顏色反應，向孔中加入可溶性單組分底物TMB，每孔100μL，室溫孵育10～20min；

(10)再向孔中加入100μL 2M H₂SO₄終止反應，立即將96孔板置于酶標儀上，在紫外吸光度為450nm時測定其OD值。

2、確定最佳條件

(1)用棋盤滴定法確定最佳抗原和血清稀釋濃度^[100]，設置6個抗原濃度梯度，分別為：0.075μg,0.15μg,0.3μg,0.6μg,1.2μg和2.4μg/每孔，血清從1:20到1:2560作倍比稀釋，以陽性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的條件作為最佳。

(2)二抗作用的最佳濃度和時間，分別設1:1000，1:2000，1:3000，1:4000，1:5000五個稀釋濃度進行摸索。二抗作用時間設置為37℃0.5小時、1小時、1.5小時、2小時四個組，以陽性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的條件作為最佳。

(3)抗原包被時間確定，用包被液稀釋重組抗原，用最佳稀釋濃度進行包被，包被時間分別為37℃1h、37℃2h及4℃過夜3個組，以陽性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的條件作為最佳。

(4)封閉液以及封閉時間的確定，分別用1％BSA，3％BSA，5％BSA，1％脫脂牛奶，3％脫脂牛奶，5％脫脂牛奶封閉。用最佳的封閉液分別封閉37℃1小時、2小時、3小時及4℃過夜4個，以陽性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的條件作為最佳。

(5)陰、陽性血清反應時間的確定，按照確定的條件來篩選陰、陽性血清的最佳孵育時間，設為37℃0.5小時、1小時、1.5小時、2小時4個組，以陽性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大的濃度作為最佳。

(6)底物顯色時間的確定，37℃條件下設5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘和30分鐘顯色時間，測定OD₄₅₀值，以陽性血清OD₄₅₀接近1，P/N最大時間作為最佳。

間接ELISA結果顯示，P/N值達到最高的抗原包被的最佳條件是4℃過夜，抗原最佳濃度為0.6μg/每孔，血清最佳稀釋濃度為1:320，最佳封閉液和封閉條件是5％脫脂奶粉37℃封閉1h，血清孵育最佳時間是37℃ 1.5h，二抗孵育最佳時間是37℃ 1h，二抗最佳稀釋濃度為1:3000時，底物顯色的最佳條件是37℃ 15min，在以上條件下，測得陰陽性血清的P/N值為3.86。

3、臨界值的確定

在最佳條件下，測定24份綿羊細粒棘球蚴病陰性血清的OD₄₅₀。設置三個重復。按照臨界值＝平均值+3倍標準差計算。

用24份綿羊陰性血清樣品的OD₄₅₀值確定臨界值，通過統計學分析，計算出24份綿羊陰性血清樣品OD₄₅₀值的平均值為0.255，標準差為0.0488。根據計算公式：臨界值＝陰性樣本OD₄₅₀平均值+3倍標準差，得出臨界值為0.4014，即OD₄₅₀>0.4014時，理論上可判定為陽性，OD₄₅₀<0.4014可判定為陰性。

4、批內重復性試驗

取同一批次包被的板子，檢測5份已知為細粒棘球蚴病陽性的綿羊血清，每份設置3個重復孔，按照已經建立的ELISA方法，進行批內重復試驗，計算變異系數，檢測該方法的批內重復性。

批內重復性試驗結果顯示，板內的變異系數在0.332％-0.944％之間，平均值為0.661％。

5、批間重復性試驗

取3個批次包被的板子，在最佳條件下，檢測3份細粒棘球蚴病陽性的綿羊血清，每份設置3個重復孔，按照已經建立的ELISA方法，進行批間重復試驗，計算變異系數，檢測該方法的批間重復性。

批間重復性試驗結果顯示，板間變異系數在0.584％-1.21％之間，平均值為0.830％。

6、特異性試驗

用建立的間接ELISA分別對山羊抗細頸囊尾蚴陽性血清、綿羊抗腦多頭蚴血清進行檢測，檢測其特異性。

用建立的間接ELISA分別對綿羊抗腦多頭蚴血清和山羊抗細頸囊尾蚴陽性血清進行檢測，結果顯示與綿羊腦包蟲血清無交叉反應，與細頸囊尾蚴有2個血清有交叉反應(圖3)，因此，其特異性為85.7％(12/14)。

7、靈敏度試驗

將3份陽性血清作倍比稀釋，從1:100到1:201800，根據判定標準，確定其靈敏度。

將3份陽性血清作倍比稀釋，結果顯示在稀釋6400倍時，OD₄₅₀平均值為0.527，仍屬于陽性，而在在稀釋12800倍時，OD₄₅₀平均值為0.334，小于臨界值，因此，確定其靈敏度為1:6400。

8、臨床試驗

用建立的間接ELISA方法分別對24份細粒棘球蚴病陰性綿羊血清和24分細粒棘球蚴病陽性綿羊血清進行檢測，根據臨界值判斷該方法的可靠性。

用24份綿羊細粒棘球蚴病陽性血清和24份陰性血清對建立的間接ELISA方法進行臨床檢測(見表1和圖4)，結果顯示23份綿羊細粒棘球蚴病陽性血清的OD₄₅₀均大于臨界值，24份陰性血清OD₄₅₀均小于臨界值，檢測的符合率高達97.9％。

表1臨床血清樣本OD₄₅₀

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。