一種特異性蛋白檢測β-葡聚糖的比濁法

一種特異性蛋白檢測β-葡聚糖的比濁法
【專利摘要】一種特異性蛋白檢測β-葡聚糖的比濁法，屬于生物檢測【技術領域】，方法是：利用基因重組的方法，克隆了來自鱟血中基因的大小為1251bp的特定氨基酸序列,將此序列連接到PET-15b的表達質粒上，轉到BL21的表達菌中大量表達，純化了對βG具有特異結合性的蛋白質。有益效果是：具有成本低、快速、靈敏度高等特點。將來可廣泛應用在食品檢測、醫藥開發、化妝品檢測和疾病檢測等領域。本發明利用比濁法對β-葡聚糖進行測定，具有較高的實用價值和廣闊的市場前景。
【專利說明】一種特異性蛋白檢測β-葡聚糖的比濁法

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物檢測【技術領域】。

【背景技術】
[0002]β -葡聚糖其來源于新鮮的食品啤酒酵母、燕麥、食用菌類等。根據糖鍵結構差異可分β - (I — 3)-葡聚糖和β - (I — 6)-葡聚糖，β-葡聚糖的活性結構是有葡萄糖單位組成的多聚糖，她能夠活化巨噬細胞、嗜中性白血球等，從而提高白細胞素、細胞分裂素和特殊抗體的含量，全面刺激機體的免疫系統。此外，葡聚糖還有清楚游離基、抗輻射、溶解膽固醇，預防高脂血癥及抵抗濾過性病毒、真菌、細菌等感染等作用，固廣泛用于醫藥、食品、化妝品等行業。葡聚糖還具有治療腫瘤、肝炎、心血管、糖尿病和降血脂、抗衰老等方面有獨特的生物活性。因此檢測葡聚糖在食品領域和化妝品領域都有很廣闊的空間。
[0003]真菌的細胞壁主要成分為(1，3)-0-0葡聚糖(06)。當真菌進入人體血液或深部組織后，經吞噬細胞的吞噬、消化等處理，β G可從胞壁中釋放出來，從而使血液及其它體液中葡聚糖含量增高。對β G進行測定，實現真菌感染早期診斷及早期治療，是改善患者愈后，提尚患者生存質量的關鍵。
[0004]國內外用于檢測β -葡聚糖的方法如下:
1.粘度法:原理是大麥抽提液粘度主要由葡聚糖產生，但葡聚糖粘度同時與含量和分子量有關，分子量越大，粘度越大，因此該法測定結果誤差很大。
[0005]2.沉淀法:原理是利用特定鹽或有機溶劑沉淀抽提液中價葡聚糖；該方法局限性在于抽提不能完全排除其它物質干擾。
[0006]3.酶法:此方法采用特定葡聚糖內切酶得到寡糖，經酸解后采用葡萄糖氧化酶/過氧化酶試劑測定葡萄糖含量，雙酶法有較高的專一性和準確性，是目前國際上較通用的測定方法，缺點是測定時間長，試劑盒單價高，試劑保存時間短。
[0007]4.剛果紅:用于測定啤酒中f3G含量，能和多種聚合糖發生作用，形成顏色濃郁的多聚糖-剛果紅絡合物。但測定的結果過低，可能是供試品中0G分子被其他分子包裹未能充分溶解，使顯色不足，故不適于測定固態供試品中βG含量。
[0008]5.熒光法:主要是利用熒光物質可與葡聚糖特異性結合，而與其它多糖和纖維素、戊聚糖親和力很弱這一特性進行測定，此法在一些啤酒企業中使用。
[0009]6.苯酚-硫酸法:測定結果與供試品的已知含量有相當大的差別，可能因為多糖和寡糖被濃硫酸水解成單糖，并通過苯酸顯色，對0G無專一"性。
[0010]7.鱟試劑法:測定微量β -葡聚糖的方法就是利用鱟試劑(鱟的血細胞提取物)，原理:G因子是絲氨酸蛋白酶前體，通過結合β G而被活化，從而啟動G因子系統的蛋白酶級聯。并且被活化的G因子使凝固酶前體被活化，最終生成凝膠。將含鱟血細胞提取物的試劑與含β G的血液樣品混合，測定該混合液在光照射開始之后達到規定值所需的時間，將所得的該時間代入使用濃度已知的βG溶液預先制成的表示凝膠化時間與βG濃度的關系的標準曲線中，求出樣品中的β G濃度，對患者做出真菌感染的檢測。雖然這種檢測方法靈敏度很高，但是鱟血源于天然材料，必將會擔心資源的枯竭，鱟現已經列入某些地區的二級保護動物，因此鱟試劑的成本比較高，還需要對樣品進行前處理，測定時間長。
[0011]因此，現今國內外對β G濃度的測定方法都不是很理想，有些方法存在穩定性差、特異性差、價格昂貴、靈敏性差、檢測時間長等缺點，本專利發明了對β G的新型測定方法，為將來的食品檢測、醫藥開發、化妝品檢測和疾病檢測等領域提供技術基礎，滿足現代生物檢測各領域日益增長的需求。


【發明內容】

[0012]本發明的目的是:提供一種特異性蛋白檢測葡聚糖的比濁法，它能夠低成本高敏度特異性地測定β Ge
[0013]本發明的方法是:利用基因重組的方法，克隆了來自鱟血中基因的大小為1251bp的特定氨基酸序列，將此序列連接到PET-15b的表達質粒上，轉到BL21的表達菌中大量表達，純化了對βG具有特異結合性的蛋白質。
[0014]表達蛋白可以與葡聚糖特異性結合，形成一定結構的復合物，在促聚劑聚乙二醇作用下，成為懸浮于反應溶劑中的微粒，使樣品濁度發生變化；當一定波長光線通過濁度發生變化的反應混合物時，由于復合物的吸收其吸光值增大，故在一定范圍內吸收度與復合物量呈正相關；當蛋白質濃度固定時，樣品的濁度與其中所含0G量成正比，繪制標準曲線，從而達到未知0G的測定。
[0015]采用粒徑為180nm的大顆粒聚乙二醇微乳顆粒，具有較大的粒徑，增加血液中β G和蛋白反應時的濁度，從而增加測試反應的靈敏度、縮短了反應時間，可以在570nm的波長下進行檢測；用固定的蛋白質濃度測定不同0G量，測出吸光值，繪制曲線，得到一定范圍內的標準曲線，可以求出未知0G的量。
[0016]序列表
序列I 1251bp DNA美洲鱟屬
aat aca cct tct cct gtt gac gtt act cat tta tct ggt tac tat ttt 48
Asn Thr Pro Ser Pro Val Asp Val Thr His Leu Ser Gly Tyr Tyr Phe
151015
ctt caa aat agg cac agt gaa ctg tat ctt gat gtc agt ggt tcc agt 96
Leu Gln Asn Arg His Ser Glu Leu Tyr Leu Asp Val Ser Gly Ser Ser
202530
aac gaa gat gga gca ttt cta caa caa tgg cct tat age ggt aat get 144
Asn Glu Asp Gly Ala Phe Leu Gln Gln Trp Pro Tyr Ser Gly Asn Ala
354045
aac caa cag ttt gat ttt gta cat ctc gga aat aag gtt tat aaa att 192
Asn Gln Gln Phe Asp Phe Val His Leu Gly Asn Lys Val Tyr Lys lie
505560
ate aat aaa aat agt gga aaa tct ctg gat gtt tac gag tta ggg act 240
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gat aat ggt gtc aga ate caa cag tgg tcg tat gga gggggctacaat 288
Asp Asn Gly Val Arg lie Gln Gln Trp Ser Tyr Gly GlyGlyTyrAsn
859095
cag cag ttt att gta caa gat gtt gga gat ggt tat tataagatattt 336
Gln Gln Phe lie Val Gln Asp Val Gly Asp Gly Tyr TyrLysliePhe
100 105110
gca cgc age act gga aag tta gtg gaa gta gca gat ttgaataaagac 384
Ala Arg Ser Thr Gly Lys Leu Val Glu Val Ala Asp LeuAsnLysAsp
115 120 125
cca gga gga aag ata caa caa tgg tct gat gat ggc caattatccgga 432
Pro Gly Gly Lys lie Gln Gln Trp Ser Asp Asp Gly GlnLeuSerGly
130 135 140
cag tgg aaa ctt att cga aat aaa get aat tct aaa ttgattcaggca 480
Gln Trp Lys Leu lie Arg Asn Lys Ala Asn Ser Lys LeulieGlnAla
145150155160
gaa agt tat ttt get agt tea aaa gta caa ttg gaa gatacctcggat 528
Glu Ser Tyr Phe Ala Ser Ser Lys Val Gln Leu Glu AspThrSerAsp
165170175
gta gga ggc ggg aag aat gtc aag tgt gat aat gaa ggagcctggatg 576
Val Gly Gly Gly Lys Asn Val Lys Cys Asp Asn Glu GlyAlaTrpMet
180 185190
get tac aag gat ate aat ttc cca agt tea ggt act tatcaagtagag 624
Ala Tyr Lys Asp lie Asn Phe Pro Ser Ser Gly Thr TyrGlnValGlu
195 200 205
tac aga gtg gca agt gaa cgt gca gga gga atg ttg tctctggatttg 672
Tyr Arg Val Ala Ser Glu Arg Ala Gly Gly Met Leu SerLeuAspLeu
210 215 220
aat gca ggt tct ata gtg ctt ggc atg ctg aat gtt cctteaactgga 720
Asn Ala Gly Ser lie Val Leu Gly Met Leu Asn Val ProSerThrGly
225230235240
gga ttg cag aag tgg acc acc att tcc cac aca gtg aatgtaagttea 768
Gly Leu Gln Lys Trp Thr Thr lie Ser His Thr Val AsnValSerSer
245250255
ggt acg tac aac ttg ggg ate agt gtt caa cga ccc gggtggaatate 816
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260 265270
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Asn Trp lie Asn lie Thr Lys Val Ser Ser Gln Leu LysSerliePro 275280285
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290295300
aaa gta caa ttg gaa gac acc tcg gat gtt gga ggc ggg aag aat gtt 960
Lys Val Gln Leu Glu Asp Thr Ser Asp Val Gly Gly Gly Lys Asn Val
305310315320
aag tgt gat act aaa gga gcc tgg atg gcc tac aag gat ate aat ttt 1008
Lys Cys Asp Thr Lys Gly Ala Trp Met Ala Tyr Lys Asp lie Asn Phe
325330335
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Pro Ser Ser Gly Ser Tyr Gln lie Glu Tyr Arg Val Ala Ser Glu Arg
340345350
gca gga gga aag ttg tct ctc gat ttg aat gca ggt tct ata gtg ctt 1104
Ala Gly Gly Lys Leu Ser Leu Asp Leu Asn Ala Gly Ser lie Val Leu
355360365
gga atg ctg gat gtt cct tea act ggg gga tgg cag aag tgg acc acc 1152
Gly Met Leu Asp Val Pro Ser Thr Gly Gly Trp Gln Lys Trp Thr Thr
370375380
att tcc cat aca gta aag gtg gat tea ggt act tat aac ttg ggg ate 1200
lie Ser His Thr Val Lys Val Asp Ser Gly Thr Tyr Asn Leu Gly lie
385390395
tac gtt caa caa ccc ggg tgg aat ate aac tgg att aag att aca aag 1248
Tyr Val Gln Gln Pro Gly Trp Asn lie Asn Trp lie Lys lie Thr Lys
405410415
gtt1251
Val
本發明的有益效果是:具有成本低、快速、靈敏度高等特點。將來可廣泛應用在食品檢測、醫藥開發、化妝品檢測和疾病檢測等領域。本專利利用比濁法對β-葡聚糖進行測定，具有較高的實用價值和廣闊的市場前景。
[0017]成本低:本專利利用自己表達的蛋白，彌補了酶法試劑盒單價高，試劑保存時間短的特點，無需利用天然材料鱟試劑，現已列入二級保護動物，而擔心資源枯竭，成本高的不足。
[0018]快速:實驗簡便，結果回報時間短只需10分鐘，便于及時反饋信息，可節約大量人力物力，有利于大批量樣品的處理。可以利用測光儀進行快速檢測，待測物用量少，具有明顯的應用優勢。改進了其它方法在測定時復雜過程，反應比較慢的缺點。
[0019]高靈敏:穩定性好，此免疫比濁法可以檢測β G的下限為6Pg/ml，精確度高，干擾因素少，結果判斷更加客觀、準確。可以代替誤差較大的粘度法，抗干擾性不強的沉淀法，使用有局限的剛果紅法，檢測不靈敏的熒光法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是目的片段PCR體系表；
圖2是回收片段和pUCm-T載體連接反應體系；
圖3是pUCm-T-FVO和PET_15b載體的雙酶切反應體系表；
圖4是目的基因片段和PET-15b線性載體連接反應體系；
圖5是目的蛋白通過Ni柱逐步純化圖；
圖6是比濁法在一定范圍內測βG的標準曲線。
[0021]具體的實施方式
1.目的基因的PCR擴增
在GENBANK中找到目的片段美洲鱟屬G因子α亞基的片段a (FVO) (GenBank:AB547712.1)，如序列I所示，由上海生物工程公司人工合成其基因，大小是1251bp，合成為JM109-pMD19-T Simple-FVO的工程菌，以重組質粒為模板，采用PCR技術克隆此FVO片段。
[0022]引物序列
引物 F 5'-CATATGAATACACCTTCTCCTGTTGACG-3'
引物 R 5'-GGATCCTGTAACCTTTGT-3'
PCR的反應條件:在98°C加熱2分鐘之后，將95°C 15s、50°C 30s,68°C 2min重復30次，最后68 °C 5min。反應體系如圖3所示。
[0023]2.重組質粒的連接與鑒定
將所得的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切下1.2Kbp附近的凝膠，用DNA膠回收試劑盒(Sangon)進行目的基因片段的回收。從切下的凝膠中純化PCR產物。回收片段和pUCm-T載體連接，建重組質粒pUCm-T-FVO，如圖4所示在22°C連接16h。
[0024]大腸桿菌DH5a感受態的制備
I)將_80°C凍存的大腸桿菌DH5a在不含抗生素的LB瓊脂固體培養基劃線，37°C培養16小時。
[0025]2)從大腸桿菌DH5a平板上挑取一個單菌落接于1ml LB培養液的試管中，37°C振蕩培養過夜。
[0026]3)取ΙΟΟμΙ菌液轉接到一個含有1ml LB培養液錐形瓶中，37°C振蕩培養3小時左右，培養至OD6qq=0.4-0.6ο
[0027]4)用滅菌的槍頭取Iml的大腸桿菌培養物于1.5mL滅菌離心管中，冰上放置10分鐘后，4°C，4000rpm離心10分鐘，去上清，加入0.2mL預冷的0.lmol/L的CaCl2溶液。在旋渦震蕩器上震蕩I分鐘，使細胞充分混懸。冰浴30分鐘后，4°C，4000rpm離心10分鐘，去上清，加入0.1ml預冷的0.lmol/L的CaCl2溶液。
[0028]5)將1.5ml離心管放在冰上，每管含0.1ml感受態細胞，細胞可以立即使用。
[0029]6)將余下部分感受態細胞迅速轉移到_80°C低溫冰箱中，備用。
[0030]pUCm-T-FV0轉化到大腸桿菌DH5a
I)取新鮮制備的ΙΟΟμΙ感受態細胞，將細胞均勻懸浮后置于冰上。
[0031 ] 2)加入10μ1 pUCm-T-FV0的質粒，冰上放置30分鐘。
[0032]3) 42 °C水浴熱激90秒，迅速放置冰上2分鐘。
[0033]4)加600μ1 37°C預熱的LB培養液，37°C，80rpm振蕩培養15分鐘；在120rpm振蕩培養15分鐘；在150rpm振蕩培養30分鐘。
[0034]5)室溫下4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400μ1上清液，用剩余的培養液將細胞懸浮。
[0035]6)將懸浮菌液涂布預先涂布在含有40μ1 2% X-gal和4μ1 20% IPTG及10Pg/mL Amp的LB瓊脂平板上。
[0036]7)平皿在37°C下正向放置至菌液吸收進瓊脂后，將平皿倒置，過夜培養14_16h，進行藍白班篩選。單克隆子的鑒定，選擇泳動明顯較慢的單克隆子，送完上海生工有限公司進行序列測定。將測序結果為陽性的單克隆子含有的重組質粒命名為pUCm-T-FVO。
[0037]3.重組表達質粒的連接和鑒定
對實驗室保存的PET-15b質粒和構建好的重組質粒pUCm-T-FVO進行雙酶切，如圖5所示放置37°C，時間3h。
[0038]構建FVO基因與PET_15b質粒上的IacZ promoter順向連接的重組質粒PET-15b-FV0o保溫3h后，取5μ1雙酶切反應液進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，看基因片段是否酶切完全，目的基因條帶是否清楚，用DNA膠回收試劑盒(Sangon)進行目的基因片段的回收。
[0039]將純化的pUCm-T-FV0基因片段立即與PET_15b線性載體進行連接，反應體系如圖6所示，在22 °C連接16h。
[0040]大腸桿菌DH5a感受態的制備和pET-15b_FV0轉化到大腸桿菌DH5a如方法(2)僅是6)將200μ1細菌涂布在lOOPg/ mL Amp的LB瓊脂平板上。
[0041]7)平皿在37°C下正向放置I小時，待涂布的液體吸收進瓊脂后，將平皿倒置，過夜培養16小時。
[0042]方法同上配置B121感受態，將構建的表達質粒pET-15b-FV0導入。
[0043]4.重組蛋白的表達和分離純化
將BL21-pET-15b-FV0菌按體積比1:50到LB(Ampl0(^g/ ml)液體培養液中活化37°C，180 rpm過夜，次日轉接培養的菌液按體積比1:20到LB (AmplOOPg/ ml)液體培養液中擴大，37°C，180 rpm培養至OD6tltl約為0.8(約在4小時)，加入IPTG至終濃度為ImM，繼續培養48小時，培養后，將培養液進行離心分離，回收所得的沉淀物(菌體)。將沉淀物用PBS洗滌，然后放一定量的溶菌酶，反復凍融，進行超聲破碎，工作參數:工作10s，間歇9s，功率200W，循環30次。10000rpm，4°C離心lOmin。過柱純化前將樣品溶液分別用0.22Mm孔徑濾膜過濾。過Ni柱，依據附帶的說明書記載的方法進行利用N1-瓊脂糖的親和純化，從上述所得的上清組分中純化目的蛋白，經過透析去除多余的咪唑，濃縮，收集每步樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，結果示于圖1，目的蛋白的分子量約為40kDa。
[0044]5.將蛋白與聚乙二醇偶聯將純化好的目的蛋白與羧基微球偶聯
O取一定量180nm的微球，用0.02M的MES溶液調整到15mg/ml，混勻；
2)逐滴加入10mg/mlEDC溶液，邊加入邊混勻，終濃度0.lmg/ml，37°C旋轉混勻(或室溫混勻)，反應25分鐘后，取下離心20分鐘；
3)沉淀懸浮在0.05M PBS溶液中，超聲確保微球均勻分散； 4)逐滴加入抗體邊加入邊混勻，通常抗體的包被比為1mg微球:1-1.5mg抗體；
5)37°C反應3小時后加入濃度為lOOmg/mlBSA溶液，終濃度3mg/ml ；
6)I小時候后加入IM甘氨酸溶液，終濃度0.05M,室溫反應過夜即可。
[0045] 6.免疫比濁法
做四組一樣的樣品進行測定，0G標準品20(^g/ml，將β G按體積梯度稀釋，向96孔板內加入(50μ1)，再加入lOOPg/ml (ΙΟΟμΙ)的特異性蛋白質，混勻，反應5分鐘，以蒸餾水代替β G的樣品進行測定，作為空白值，在570nm的波長下進行測定，每組數據的吸光值是實際吸光度值減去空白值，以β G濃度為X軸，以這4組數據的平均吸光值為y軸，繪制曲線，得到較好的線性關系，如圖2所示，此免疫比濁法可以檢測β G的下限為6Pg/ml。
【權利要求】
1.一種特異性蛋白檢測β -葡聚糖的比濁法，其方法是:利用基因重組的方法，克隆了來自鱟血中基因的大小為1251bp的特定氨基酸序列，將此序列連接到PET-15b的表達質粒上，轉到BL21的表達菌中大量表達并純化，該蛋白與葡聚糖具有特異結合性，建立一種檢測葡聚糖的比濁法。
2.如權利要求1所述的一種特異性蛋白檢測β-葡聚糖的比濁法，其方法是:表達蛋白與葡聚糖特異性結合，形成一定結構的復合物，在促聚劑聚乙二醇作用下，成為懸浮于反應溶劑中的微粒，使樣品濁度發生變化；當一定波長光線通過濁度發生變化的反應混合物時，由于復合物的吸光度增大，故在一定范圍內吸光度與復合物量呈正相關；當蛋白質濃度固定時，樣品的濁度與其中所含葡聚糖量成正比，繪制標準曲線，從而達到未知β-葡聚糖的測定。
3.如權利要求2所述的一種特異性蛋白檢測β-葡聚糖的比濁法，其方法是:采用粒徑為180nm的大顆粒聚乙二醇微乳顆粒，增加β -葡聚糖和此特異蛋白反應時的濁度，從而增加測試反應的靈敏度、縮短了反應時間，在570nm的波長下進行檢測；用固定的特異蛋白質濃度測定不同葡聚糖量，測出吸光值，繪制曲線，得到一定范圍內的標準曲線，可以求出未知葡聚糖的量。
【文檔編號】G01N33/68GK104502612SQ201510011372
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月9日 優先權日:2015年1月9日
【發明者】于源華, 田振華, 李忠和, 南航, 鐘曉騮, 張爽, 劉桂瑩, 劉凱 申請人:長春理工大學