一種多重信號放大的免標記電化學傳感器及對核酸的檢測的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種多重信號放大的免標記電化學傳感器的制備方法，連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定，即S1-CP-AuNPs聚合物；在基底電極表面修飾CS-GR復合物，浸在連接探針2中，得S2/CS-GR/基底電極；將S2/CS-GR/基底電極浸在S1-CP-AuNPs聚合物中，通過S1和S2間堿基互補配對將S1-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底電極上，即傳感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。本發明還提供了一種依據上述方法制備的電化學傳感器。所述的傳感器可用于核酸的檢測，該傳感器具有很高的靈敏性，而且免標記，對p53基因檢測范圍10-15～10-9mol/L，檢測限0.3×10-15mol/L。
【專利說明】-種多重信號放大的免標巧電化學傳感器及對核酸的檢測
【技術領域】
[0001] 本發明設及核酸的檢測方法，特別是一種多重信號放大的免標記電化學傳感器及 對核酸的檢測。
【背景技術】
[0002] 現知人類的疾病都與基因有著直接或間接的關系，P53基因是人體重要的抑癌基 因，使癌細胞自殺，防止癌變，還具有幫助細胞基因修復缺陷的功能。一旦p53基因發生突 變，將會加快腫瘤的生長和癌癥的發展。因此，對核酸的高靈敏、高選擇性的快速檢測方法 存在著越來越迫切的需求，該對于基因研究、藥物篩選W及臨床診斷都有現實意義。
[000引 目前，用來檢測核酸的方法主要有；DNA印跡、RNA印跡和PCR技術，該些方法操作 中的一個共同點是必須把未雜交的探針和引物與雜交體分離后才能借助其他信號對祀核 酸進行準確定量檢測。
【發明內容】
[0004] 針對上述現有技術，本發明提供了一種多重信號放大的免標記電化學傳感器及對 核酸的檢測，所述的電化學傳感器具有很高的靈敏性，而且免標記。
[0005] 本發明的另一目的還在于提供一種快速、高靈敏度的核酸檢測方法。
[0006] 本發明是通過W下技術方案實現的：
[0007] 一種多重信號放大的免標記電化學傳感器的制備方法，技術方案如下：
[000引 （1)連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定，形成連接探針1-捕獲探針-金 納米粒子聚合物，即Sl-CP-AuNPs聚合物，其中，連接探針1的核巧酸序列為5'-SH-C6-TTT TTC GTG AGC AGC GTC AG-3'，如序列表中SEQ ID NO. 1所示，捕獲探針的核巧酸序列為 5'-SH-C6-AAA GGG TTG GGC GGG ATG GGT TGA GTC TTC C i AG TGT GAT GAA ACC CAT C-3'，如序列表中SEQ ID NO. 2所示；
[0009] (2)石墨締分散在殼聚糖溶液中，形成殼聚糖-石墨締聚合物，即CS-GR復合物；
[0010] (3)在基底電極表面修飾CS-GR復合物，得殼聚糖-石墨締/基底電極，即CS-GR/ 基底電極；
[0011] (4)將殼聚糖-石墨締/基底電極處理后，浸在連接探針2中，得連接探針2/ 殼聚糖-石墨締/基底電極，即S2/CS-GR/基底電極，其中，連接探針2的核巧酸序列為 5, -NH2-C6-TTT TTTTCT GAC GCT GCT CAC G-3，，如序列表中 SEQ ID NO. 3 所示；
[0012] (5)將S2/CS-GR/基底電極浸在Sl-CP-AuNPs聚合物中，通過S1和S2間堿基互補 配對將Sl-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底電極上，制得連接探針1-捕獲探針-金納米粒 子/連接探針2/殼聚糖-石墨締/基底電極，即傳感器Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。
[001引所述步驟似中殼聚糖溶液的質量分數為0. Iwt%?0. 5wt%。
[0014] 優選地，所述步驟（3)中，基底電極為玻碳電極。
[0015] 所述步驟（1)中連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定，連接探針1和捕 獲探針中分別加入=(2-氯己基）磯酸醋TCEP，室溫避光處理1小時；將上述兩溶液混 合加入到金納米粒子中，室溫避光攬拌；攬拌的過程中逐滴加入=哲甲基氨基甲燒-鹽酸 緩沖液Tris-HCl，再逐滴加入化C1溶液，室溫避光攬拌；將上述溶液離屯、，將沉淀重新分 散在Tris-HCl和化C1的混合溶液中，即得連接探針-捕獲探針-金納米粒子聚合物，即 Sl-CP-AuNPs 聚合物。
[0016] 所述步驟（3)中，玻碳電極用S氧化二侶粉打磨成鏡面后清洗，驚干后，將CS-GR 復合物滴涂在玻碳電極上，室溫驚干，制得殼聚糖-石墨締/玻碳電極，即CS-GR/GCE。
[0017] 所述步驟（4)中，殼聚糖-石墨締/玻碳電極浸在戊二醒溶液中，然后清洗；將清 洗后的殼聚糖-石墨締/玻碳電極浸在連接探針S2中，制得連接探針/殼聚糖-石墨締/ 玻碳電極，即S2/CS-GR/GCE ;其中，戊二醒溶液的質量分數為1. 5%?5%。
[0018] 步驟（3)中所述清洗，是在二次水中清洗3?5分鐘，然后依次在己醇和二次水中 超聲3?5分鐘。
[0019] 步驟（4)中所述清洗，是分別在化OH溶液和lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1緩沖 液中。
[0020] 本發明還提供了一種根據上述方案制備的免標記電化學傳感器。
[0021] 本發明的另一目的是提供上述電化學傳感器在檢測核酸含量的應用，包括W下步 驟：
[002引 （1)標準溶液配制：配制一組含有不同濃度P53基因的抑為7. 4的Tris-肥1緩 沖溶液為標準液；
[0023] (2)建立工作曲線；將所述傳感器分別浸入標準溶液中40°C解育80分鐘，解育后 用Tris-HCl緩沖液沖洗，再將傳感器分別浸入肥Buffer 3、氯高血紅素、亞甲基藍溶液中， 每次浸入后均用Tris-HCl緩沖液沖洗，在lOmL Tris-HCl、KC1和&〇2的混合溶液中進行 差分脈沖伏安法值PV)掃描，記錄響應電流I (uA)，所述I值與標準溶液中p53基因濃度 c(mol/L)的對數log C成正比，繪制I-log C標準曲線，或采用線性回歸法得到I-log C線 性回歸方程；
[0024] (3)p53基因含量測定；將待測樣品配制為含有步驟（1)相同濃度P53基因的 Tris-HCl緩沖溶液，按照與步驟（2)相同的方法對所述傳感器進行解育和進一步反應后進 行差分脈沖伏安掃描，記錄響應電流I ;根據響應電流I和I-log C線性回歸方程，得到p53 基因含量。
[002引步驟（1)中所述Tris-HCl緩沖溶液的濃度為lOOmmol/L，步驟似中所用 Tris-HCl的濃度均為lOmmol/L，所述步驟（2)中肥Buffer 3含有0.加nit/ y L N. BstNB lo
[0026] 本發明的有益效果為；
[0027] 1.本發明建立了一種基于多重信號放大、免標記的電化學適體傳感器用于超靈敏 檢測p53基因，其中多重信號放大策略包括；（1)殼聚糖-石墨締復合物基底有利于電子在 電極表面的轉移；(2)具有高比表面積的金納米粒子AuNPs可W固定更多的捕獲探針CP ; (3)在切刻內切酶N.BstNB I的作用下，p53基因能重復利用，從而在酶切后產生更多的富 鳥嚷嶺G結構，并在氯高血紅素hemin和K+的存在下形成DNA酶DNAzyme ; (4)DNAzyme催 化&化還原，同時促進了亞甲基藍MB的氧化還原；W上方案能夠使信號增強，因此信號放大 策略具備可行性；
[002引 2.與現有的電化學傳感器相比，本發明的電化學傳感器具有免標記的特點，信號 的產生依靠DNAzyme的催化作用，免除了傳統的標記過程；
[0029] 3.本發明的電化學傳感器具有高度的靈敏性和專一性，對核酸的檢測簡單高效， 檢測限可達0. 3Xl(Ti5mol/l，檢測范圍為1045?l(T9mol/L。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發明的電化學傳感器檢測原理示意圖；
[0031] 圖2為本發明的信號放大結果比較圖，其中，（a)為電極Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/ GCE 在與 p53 作用前，（b)為電極 Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE 與 Inmol/L p53 作用后，（C) 為化）與酶反應后，（d)為（C)與氯高血紅素作用后；
[0032] 圖3為本發明的DPV曲線圖，其中a-g為標準溶液的濃度分別為l(Ti5m〇i/L， l〇-"mol/L，l〇-"mol/L，l〇-i2mol/L，l〇-iimol/L，l〇-i°mol/L 和 l〇-9mol/L);
[0033] 圖4為響應電流的變化A I與核酸濃度的標準曲線圖；
[0034] 圖5為本發明實施例4的DPV曲線圖；
[003引圖6為本發明實施例5的DPV峰電流強度柱狀圖，其中，TD為p53基因（5' -TCA TCA CAC TGG AAG ACT C-3')(如序列表中SEQ ID NO. 4所示）的檢測液，sTD為堿基錯配 (5' -TCA TCA CAC TGG AAG AAT C-3'）的檢測液，nTD 為全部堿基錯配巧' -GAC GTC AGA CTT CCT GCG A-3'）的檢測液，CK為抑為7. 4的lOOmmol/L Tris-肥1緩沖溶液。
【具體實施方式】
[0036] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明，并非構成對本發明的限制。本發明的 保護范圍不W【具體實施方式】為限。
[0037] 實施例1 ;電化學傳感器的制備
[0038] 一種多重信號放大的免標記電化學傳感器，制備方法如下：
[0039] (1)連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定：
[0040] 2uL 100ymol/L S1 和 8uL 100ymol/L CP 中分別加入 0. luL 3mmol/L和 0. 4 y L 3mmol/L S (2-氯己基）磯酸醋（TCE巧，室溫避光處理1小時；將上述兩溶液混合 加入到0. 3mL攬拌速率為Ir/s的AuNPs中，室溫避光攬拌10小時；攬拌的過程中逐滴加入 3 y L 500 y mol/L pH 7. 4 的 Tris-HCl 緩沖液，再逐滴加入 50 y L Imol/L NaCl 溶液，室溫 避光攬拌10小時；上述溶液在l〇〇(K)r/min的轉速下離屯、lOmin，將沉淀重新分散在50 y L lOOmmol/L Tris-肥1和lOOmmol/L化Cl的混合液中；再次離屯、速度為lOOOOr/min，時間 lOmin，將沉淀重新分散在 200 y L pH 7. 4 的 lOOmmol/L Tris-HCl 和 300mmol/L 化C1 的混 合液中，制得連接探針1-捕獲探針-金納米粒子聚合物，即Sl-CP-AuNPs聚合物；
[0041] (2)玻碳電極分別用0. 05 ym和0. 3 ym的S氧化二侶粉打磨成鏡面后，用二次水 清洗2min，再依次在己醇和二次水中超聲清洗2min，室溫驚干；Img石墨締分散在0. 5mL質 量分數為0. Iwt %的殼聚糖溶液中，其中殼聚糖溶解在質量分數為0. 5%的醋酸溶液中，超 聲共混，形成CS-GR復合物；將3 y L CS-GR復合物滴涂在玻碳電極GCE上，室溫驚干，制得 殼聚糖-石墨締/玻碳電極，即電極CS-GR/GCE ;
[00創 做電極CS-GR/GCE在質量分數為1. 5%的戊二醒溶液中浸泡1小時，用0. Imol/ L化OH溶液和lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1依次清洗2min ;將清洗后的電極浸在30 y L 0. 5 y mol/L連接探針2中1小時，用lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1緩沖液清洗2min后，審U 得連接探針2/殼聚糖-石墨締/玻碳電極，即S2/CS-GR/GCE ;
[0043] (4)將 S2/CS-GR/GCE 浸在 30 y L Sl-CP-AuNPs 中 40 °C 0. 5 小時，通過 S1 和 S2 間堿基互補配對，將Sl-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/GCE上，清洗液清洗后制得傳感器 Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。
[0044] 如圖1所示，石墨締與殼聚糖非共價結合，石墨締-殼聚糖共同修飾的玻碳電極能 提供大的比表面積供更多的連接探針2固定；發夾結構的捕獲探針和連接探針1通過Au-S 鍵固定在金納米粒子上；由于金納米粒子大的比表面積，更多的捕獲探針和連接探針1可 W被固定；連接探針1和連接探針2之間堿基互補配對，從而將固定有捕獲探針和連接探針 1的金納米粒子固定在電極上。切刻內切酶N.BstNB I識別雙鏈DNA中特定堿基序列并切 刻其中一條鏈。在沒有p53存在的情況下，N.BstNB I不能切割發夾捕獲探針（酶識別位 點處在環處，不是雙鏈結構），因此發夾捕獲探針莖中的富鳥嚷嶺序列不能在氯高血紅素和 鐘離子存在下形成DNA酶值NAzyme)。當p53存在時，p53與發夾捕獲探針互補配對形成 雙鏈結構，發夾的莖部打開，酶識別位點處是雙鏈結構，被N. BstNB I識別并切割捕獲探針。 捕獲探針被切割后富G結構的鏈留在金納米粒子上即留在電極上，p53基因釋放與其他發 夾捕獲探針結合形成雙鏈結構供酶識別切割，從而形成更多留在納米金上的富G結構，并 且在氯高血紅素和鐘離子的存在下形成DNAzyme。因此，一個p53可W循環利用引發多個 DNAzyme的形成。在靜電作用下，荷正電的亞甲基藍嵌入到DNA結構中，作為電子媒介體產 生電化學信號，同時，DNAzyme能催化雙氧水還原并促進亞甲基藍的氧化還原反應，使信號 進一步增強。
[0045] 實施例2 ;電化學傳感器的制備
[0046] 一種多重信號放大的免標記電化學傳感器，制備方法如下：
[0047] (1)連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定：
[0048] 6uL 100ymol/L S1 和 24uL 100ymol/L CP 中分別加入0. 3uL 3mmol/L 和 1. 2 y L 3mmol/L S (2-氯己基）磯酸酉旨（TCE巧，室溫避光處理1小時；將上述兩溶液混 合加入到ImL攬拌速率為Ir/s的AuNPs中，室溫避光攬拌12小時；攬拌的過程中逐滴加 入 10 y L 500 y mol/L pH 7. 4 的 Tris-HCl 緩沖液，再逐滴加入 115 y L Imol/L 化C1 溶 液，室溫避光攬拌12小時；上述溶液在160(K)r/min的轉速下離屯、20min，將沉淀重新分散 在200 y L lOOmmol/L Tris-HCl和lOOmmol/L化C1的混合液中；再次離屯、速度為leOOOr/ min,時間 20min，將沉淀重新分散在 500 y L pH 7. 4 的 lOOmmol/L Tris-HCl 和 300mmol/L 化Cl的混合液中，制得連接探針1-捕獲探針-金納米粒子聚合物，即Sl-CP-AuNPs聚合物；
[0049] (2)玻碳電極分別用0. 05 y m和0. 3 y m的S氧化二侶粉打磨成鏡面后，用二次水 清洗3min，再依次在己醇和二次水中超聲清洗3min，室溫驚干；3mg石墨締分散在1. 5mL質 量分數為0. 2wt %的殼聚糖溶液中，其中殼聚糖溶解在質量分數為1 %的醋酸溶液中，超聲 共混，形成CS-GR復合物；將6 y L CS-GR復合物滴涂在玻碳電極GCE上，室溫驚干，制得殼 聚糖-石墨締/玻碳電極，即電極CS-GR/GCE ;
[0050] 做電極CS-GR/GCE在質量分數為2. 5%的戊二醒溶液中浸泡2小時，用0. Imol/ L化OH溶液和lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1依次清洗2min ;將清洗后的電極浸在50 y L 0. 5 y mol/L連接探針2中1小時，用lOmmol/L抑7. 4的Tris-肥1緩沖液清洗2min后，審U 得連接探針2/殼聚糖-石墨締/玻碳電極，即S2/CS-GR/GCE ;
[0051] (4)將 S2/CS-GR/GCE 浸在 30 y L Sl-CP-AuNPs 中 40 °C 1 小時，通過 S1 和 S2 間堿基互補配對，將Sl-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/GCE上，清洗液清洗后制得傳感器 Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。
[005引實施例3 ;電化學傳感器的制備
[0化引一種多重信號放大的免標記電化學傳感器，制備方法如下：
[0化4] (1)連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定：
[0化引 lOyL 100ymol/L S1 和 40yL 100ymol/L CP 中分別加入0. 5uL 3mmol/L 和 2. 0 y L3mmol/L S (2-氯己基）磯酸醋（TCE巧，室溫避光處理2小時；將上述兩溶液混合 加入到1. 6mL攬拌速率為Ir/s的AuNPs中，室溫避光攬拌16小時；攬拌的過程中逐滴加 入16 y L 500 y mol/L pH 7. 4的Tris-肥1緩沖液，再逐滴加入200 y L Imol/L化C1溶液， 室溫避光攬拌16小時；上述溶液在200(K)r/min的轉速下離屯、30min，將沉淀重新分散在 300 y L lOOmmol/LTris-肥1和lOOmmol/L化C1的混合液中；再次離屯、速度為20000r/min， 時間 30min，將沉淀重新分散在 800 yL pH 7. 4 的 lOOmmol/L Tris-HCl 和 300mmol/L 化Cl 的混合液中，制得連接探針1-捕獲探針-金納米粒子聚合物，即Sl-CP-AuNPs聚合物； [0化6] (2)玻碳電極分別用0. 05 y m和0. 3 y m的S氧化二侶粉打磨成鏡面后，用二次水 清洗5min，再依次在己醇和二次水中超聲清洗5min，室溫驚干；6mg石墨締分散在3. OmL質 量分數為0. 5wt%的殼聚糖溶液中，其中殼聚糖溶解在質量分數為2%的醋酸溶液中，超聲 共混，形成CS-GR復合物；將8 y L CS-GR復合物滴涂在玻碳電極GCE上，室溫驚干，制得殼 聚糖-石墨締/玻碳電極，即電極CS-GR/GCE ;
[0化7] (3)電極CS-GR/GCE在質量分數為5%的戊二醒溶液中浸泡3小時，用0. Imol/ L化OH溶液和lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1依次清洗5min ;將清洗后的電極浸在80 y L 0. 5 y mol/L連接探針2中1小時，用lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1緩沖液清洗5min后，審U 得連接探針2/殼聚糖-石墨締/玻碳電極，即S2/CS-GR/GCE ;
[0058] (4)將 S2/CS-GR/GCE 浸在 80 y L Sl-CP-AuNPs 中 40 °C 3 小時，通過 S1 和 S2 間堿基互補配對，將Sl-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/GCE上，清洗液清洗后制得傳感器 Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。
[0化9] 實施例4 ;可行性分析
[0060] 實施例1制備的傳感器Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE在浸入亞甲基藍后并利用 lOmL 抑7. 4 的 lOOmmol/L Tris-肥 1、0. Imol/L KC1 和 2mmol/L &〇2的混合液進行清洗，進 行DPV檢測，如圖2所示，研究了傳感器在信號放大過程的不同階段的電信號。發現傳感器 Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE在與p53作用前（a),與Inmol/L p53作用后化），再與酶反應 后（C)時都在-0.244V處出現氧化峰（亞甲基藍特征峰），并且峰高之間差別不大；而當電 極與氯高血紅素作用后（d)，亞甲基藍的氧化峰電流明顯增強，該是由于形成的DNAzyme催 化雙氧水還原并促進亞甲基藍的氧化還原，使信號增強，W上結果顯示本方法提出的信號 放大策略是可行的。
[0061] 實施例5 ;電化學傳感器在檢測核酸含量的應用，包括W下步驟：
[006引 （1)標準溶液配制：配制一組含有不同濃度p53基因的抑為7. 4的lOOmmol/L Tris-HCl緩沖溶液為標準液；
[0063] (2)建立工作曲線；將所述傳感器分別浸入標準溶液中40°C解育80分鐘，解育 后用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液沖洗，再將所述傳感器浸入含有0.加nit/uL N.BstNB I的50 L肥Buffer 3中55〇C反應1小時，將溶液加熱至。90〇C，保持10分鐘使酶失活， 冷卻到室溫后，用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液清洗傳感器，再將所述傳感器浸泡在50 y L 0. 2mmol/L氯高血紅素化emin)中，室溫反應30分鐘，用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液清洗 傳感器，再將所述傳感器浸泡在50 y L 0. 5mmol/L亞甲基藍（MB)溶液中，室溫反應50分 鐘，用 lOmmol/L Tris-肥 1 緩沖液清洗傳感器，在 lOmL pH 7. 4 的 lOOmmol/L Tris-HCl、 0. Imol/L KCl和2mmol/L &化混合液中進行差分脈沖伏安法值PV)掃描（-0. 5?OV)，記 錄響應電流I，如圖3所示，該傳感器利用W上步驟對（10-1S，1〇-"，1〇-"，1〇-12,1〇-11，1〇-1°， l(T9m〇l/L)不同濃度的標準溶液進行檢測的DPV圖，結果表明，隨著基因p53核酸濃度的增 力口，DPV峰電流增大；所述I值與標準溶液中p53基因濃度C的對數（log C)成正比，繪制 I-log C標準曲線，或采用線性回歸法得到I-log C線性回歸方程；如圖4所示，線性回歸 方程為；Y = 82. 71+4. 417X，R = 0. 9930。該傳感器對p53基因檢測范圍l(ri5?1Q可jol/ L 檢測限 0. 3Xl〇-i5mol/L。
[0064] (3)p53基因含量測定：按照與步驟（2)相同的方法對所述傳感器進行解育和進一 步反應后進行差分脈沖伏安掃描，記錄響應電流；根據響應電流I和I-log C線性回歸方 程，得到p53基因含量。
[0065] 實施例6機3基因濃度的檢測
[0066] 配制含有未知p53基因濃度的檢測液（抑為7. 4的lOOmmol/L Tris-肥1緩沖 溶液）；將實施例1制備的傳感器浸入上述溶液中40°C解育80分鐘，解育后用lOmmol/L Tris-HCl沖洗，再將傳感器分別浸入含有0.加nit/ y L N. BstNB I的50 y L肥Buffer 3 中55°C反應1小時，將溶液加熱到90°C，保持10分鐘使酶失活，冷卻到室溫后，用lOmmol/ L Tris-HCl緩沖液清洗傳感器，再將傳感器分別浸泡在50yL 0. 2mmol/L氯高血紅素 Oiemin)中室溫反應30分鐘，用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液清洗傳感器，再將傳感器分別浸 泡在50 y L 0. 5mmol/L亞甲基藍（MB)溶液中室溫50分鐘，用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液 清洗傳感器。在在 lOmL pH7. 4 的 lOOmmol/L Tris-HCl、0. Imol/L KC1 和 2mmol/L &〇2混 合液中進行差分脈沖伏安法值PV)掃描（-0.5?OV)，記錄響應電流I，結果如圖5所示，根 據實施例3得到的I-log C線性回歸方程Y = 82. 71+4. 417X，R = 0. 9930,計算得p53基 因濃度為l〇-"mol/L。
[0067] 實施例5 ;傳感器對p53基因特異性的檢測
[0068] 配制 p53 基因（5'-TCA TCA CAC TGG AAG ACT C-3'）及單堿基錯配巧'-TCA TCA CAC TGG AAG AAT C-3'）、全部堿基錯配（5'-GAC GTC AGA CTT CCT GCG A-3'）的檢測液， W上所述檢測液均為基因含量為l(T9mol/L，抑為7. 4的lOOmmol/L Tris-HCl緩沖溶液， 同時設有空白液，即抑為7. 4的lOOmmol/L Tris-HCl緩沖溶液，將實施例1制備的傳感器 分別浸入上述溶液中40°C解育80分鐘，解育后用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液沖洗，再將傳 感器分別浸入含有0.加nit/ y L N. BstNB I的50 y L肥Buffer 3中55°C反應1小時，將 溶液加熱到90°C 10分鐘使酶失活，冷卻到室溫后，用lOmmol/L Tris-HCl緩沖液清洗傳感 器，再將傳感器分別浸泡在50yL 0.2mmol/L氯高血紅素化emin)中室溫反應30分鐘，用 lOmmol/L Tris-HCl緩沖液清洗傳感器，再將傳感器分別浸泡在50 y L 0. 5mmol/L亞甲基 藍細）溶液中室溫50分鐘，用10111111〇1/1化13-肥1緩沖液清洗傳感器。10血抑7.4的 lOOmmol/L Tris-HCl、0. Imol/L KC1和2mmol/L &〇2混合液中進行差分脈沖伏安法值PV) 掃描（-0.5?0V)，記錄響應電流I。由圖6可見，該傳感器對單堿基錯配和全部堿基錯配 的p53基因的電化學響應遠低于傳感器對p53基因的電化學響應，因此，該傳感器對p53基 因的檢測有特異性，該是由于發夾捕獲探針CP對p53基因具有特異性，捕獲探針CP只能與 p53基因互補配對，打開發夾捕獲探針CP暴露N. BstNB I的識別位點，從而剪切CP釋放p53 基因參與下一個循環，而留在納米金上的部分捕獲探針CP在鐘離子存在下與hemin形成 DNA酶結構，一系列的反應變化實現信號有效放大，而單堿基錯配和全部堿基錯配的基因不 能與捕獲探針CP互補配對，從而不能發生接下來一系列的反應。
【權利要求】
1. 一種多重信號放大的免標記電化學傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定，形成連接探針1-捕獲探針-金納米 粒子聚合物，即Sl-CP-AuNPs聚合物，其中，連接探針1的核苷酸序列為5'-SH-C6-TTT TTC GTG AGC AGC GTC AG-3'，捕獲探針的核苷酸序列為 5'-SH-C6-AAA GGG ITG GGC GGG ATG GGT TGAGTC TTC C 丨 AG TGT GAT GAA ACC CAT 03' ； (2) 石墨烯分散在殼聚糖溶液中，形成殼聚糖-石墨烯聚合物，即CS-GR復合物； (3) 在基底電極表面修飾CS-GR復合物，得殼聚糖-石墨烯/基底電極，即CS-GR/基底 電極； (4) 將殼聚糖-石墨烯/基底電極處理后，浸在連接探針2中，得連接探針2/殼 聚糖-石墨烯/基底電極，即S2/CS-GR/基底電極，其中，連接探針2的核苷酸序列為 5' -NH2-C6-TTT TTT TCT GAC GCT GCT CAC G-3' ； (5) 將S2/CS-GR/基底電極浸在Sl-CP-AuNPs聚合物中，通過S1和S2間堿基互補配對 將Sl-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底電極上，制得連接探針1-捕獲探針-金納米粒子/ 連接探針2/殼聚糖-石墨烯/基底電極，即傳感器Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。
2. 根據權利要求1所述的一種多重信號放大的免標記電化學傳感器的制備方法，其特 征在于，所述步驟（3)中，基底電極為玻碳電極。
3. 根據權利要求1或2所述的一種多重信號放大的免標記電化學傳感器的制備方法， 其特征在于，所述步驟（1)中連接探針1和捕獲探針在金納米粒子上固定，連接探針1和 捕獲探針中分別加入三（2-氯乙基）磷酸酯TCEP，室溫避光處理1小時；將上述兩溶液混 合加入到金納米粒子中，室溫避光攪拌；攪拌的過程中逐滴加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸 緩沖液Tris-HCl，再逐滴加入NaCl溶液，室溫避光攪拌；將上述溶液離心，將沉淀重新分 散在Tris-HCl和NaCl的混合溶液中，即得連接探針-捕獲探針-金納米粒子聚合物，即 Sl-CP-AuNPs 聚合物。
4. 根據權利要求2所述的一種多重信號放大的免標記電化學傳感器的制備方法，其特 征在于，所述步驟（3)中，玻碳電極用三氧化二鋁粉打磨成鏡面后清洗，晾干后，將CS-GR復 合物滴涂在玻碳電極上，室溫晾干，制得殼聚糖-石墨烯/玻碳電極，即CS-GR/GCE。
5. 根據權利要求2所述的一種多重信號放大的免標記電化學傳感器的制備方法，其特 征在于，所述步驟（4)中，殼聚糖-石墨烯/玻碳電極浸在戊二醛溶液中，然后清洗；將清洗 后的殼聚糖-石墨烯/玻碳電極浸在連接探針S2中，制得連接探針/殼聚糖-石墨烯/玻 碳電極，即 S2/CS-GR/GCE。
6. 根據權利要求2所述的一種多重信號放大的免標記電化學傳感器的制備方法，其特 征在于，步驟（3)中所述清洗，是在二次水中清洗3?5分鐘，然后依次在乙醇和二次水中 超聲3?5分鐘。
7. 根據權利要求2所述的一種多重信號放大的免標記電化學傳感器的制備方法，其特 征在于，步驟（4)中所述清洗，是分別在NaOH溶液和10mm〇l/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖液 中。
8. 權利要求1制備的一種多重信號放大的免標記電化學傳感器。
9. 權利要求8所述的標記電化學傳感器作為檢測器在檢測核酸中的應用，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 標準溶液配制：配制一組含有不同濃度P53基因的pH為7. 4的Tris-HCl緩沖溶 液為標準液； (2) 建立工作曲線：將所述傳感器分別浸入標準溶液中40°C孵育80分鐘，孵育后用 Tris-HCl緩沖液沖洗，再將傳感器分別浸入NEBuffer 3、氯高血紅素、亞甲基藍溶液中，每 次浸入后均用Tris-HCl緩沖液沖洗，在10ml Tris-HCl、KC1和H202的混合溶液中進行差 分脈沖伏安法（DPV)掃描，記錄響應電流I，所述I值與標準溶液中p53基因濃度c的對數 logc成正比，繪制I-log c標準曲線，或采用線性回歸法得到I-log c線性回歸方程； (3) p53基因含量測定：將待測樣品配制為含有步驟（1)相同濃度p53基因的Tris-HCl 緩沖溶液，按照與步驟（2)相同的方法對所述傳感器進行孵育和進一步反應后進行差分脈 沖伏安掃描，記錄響應電流I ;根據響應電流I和I-l〇g c線性回歸方程，得到p53基因含 量。
10.根據權利要求9所述的標記電化學傳感器作為檢測器在檢測核酸中的應用，其特 征在于，步驟（1)中所述Tris-HCl緩沖溶液的濃度為100mmol/L，步驟（2)中所用Tris-HCl 的濃度均為 10mm〇l/L，所述步驟（2)中 NEBuffer 3 含有 0. 5unit/yL N. BstNB I。
【文檔編號】G01N27/48GK104502437SQ201510009967
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月8日 優先權日:2015年1月8日
【發明者】夏建飛, 張菲菲, 楊敏, 王宗花, 宋岱珉, 畢賽, 桂日軍, 李延輝, 夏延致 申請人:青島大學