一種用于測定抗生素的電化學生物傳感器的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于測定抗生素的電化學生物傳感器，而提供一種靈敏度高、特異性強的傳感器的制備方法。將淀粉與低濃度戊二醛溶液混合并充分交聯反應得到醛基化淀粉膠溶液；將醛基化淀粉膠溶液與低濃度海藻酸鈉溶液混合；取所得海藻酸鈉-淀粉膠凝膠均勻地涂到2張聚碳酸酯微孔膜上，將乳酸菌干粉放置于微孔膜的圓心上，制成三明治結構的核微孔膜；然后浸入CaCl2溶液中10s后取出，固定在預處理后的玻碳電極頭的表面，使得乳酸菌與表征完的電極芯重合，得到傳感電極；將傳感電極浸入MRS培養基中，使乳酸菌與培養基完全接觸，于37℃恒溫培養24h，使乳酸菌活化，得到生物傳感器，適用于食品，特別是乳制品中抗生素殘留的定量化快速檢測。
【專利說明】一種用于測定抗生素的電化學生物傳感器的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物傳感器【技術領域】，更具體的說，是涉及一種用于測定抗生素的電化學生物傳感器的制備方法。
【背景技術】
[0002]長期食(飲)用含有抗生素的食物或飲料會造成以下不良影響:
[0003]1、會增加體內細菌的耐藥性，使抗生素的藥效下降甚至消失；
[0004]2、可能引起過敏性反應，嚴重時會引起過敏性休克；
[0005]3、第三會破壞腸道菌群的微生態平衡；
[0006]4、影響身體的疾病抵抗力。
[0007]現在對牛奶等食品中抗生素的檢測方法有TTC法、高效液相色譜法、酶聯免疫法等，但這些檢測方法耗時長、花費高，影響了檢測方法的推廣和普及。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是針對現有技術中存在的技術缺陷，而提供一種靈敏度高、特異性強、快速定量的用于測定抗生素的電化學生物傳感器的制備方法。
[0009]為實現本發明的目的所采用的技術方案是:
[0010]一種用于測定抗生素的電化學生物傳感器的制備方法，包括下述步驟:
[0011](I)將淀粉與低濃度戊二醛溶液混合并充分交聯反應得到醛基化淀粉膠溶液；將所得醛基化淀粉膠溶液與低濃度海藻酸鈉溶液混合，得到海藻酸鈉-淀粉膠凝膠；
[0012](2)取所得海藻酸鈉-淀粉膠凝膠均勻地涂到2張聚碳酸酯微孔膜上，然后將乳酸菌干粉放置于其中一張所述聚碳酸酯微孔膜的圓心上，制成三明治結構的核微孔膜；
[0013](3)將上述核微孔膜浸入CaCl2溶液中1s后取出，使海藻酸鈉與CaCl 2反應形成穩定的螯合物，從而使海藻酸鈉溶液凝膠化成良好的固定劑，得到測定膜，最后，將測定膜固定在預處理后的玻碳電極頭的表面，使得乳酸菌與表征完的電極芯重合，得到生物傳感電極；
[0014](4)將上述生物傳感電極浸入MRS培養基中，使乳酸菌與培養基完全接觸，然后于37°C恒溫培養24h，使乳酸菌活化，得到用于測定抗生素的電化學生物傳感器。
[0015]所述醛基化淀粉膠溶液通過下述方法得到:將可溶性淀粉溶解于體積百分比濃度為I %的戊二醛溶液中，80°C水浴加熱并攪拌30min，配成質量濃度為I %的淀粉溶液，室溫放置12小時以上，使淀粉與戊二醛充分交聯得到醛基化淀粉膠溶液。
[0016]與所述醛基化淀粉膠溶液混合的海藻酸鈉溶液的質量濃度為2%，所述醛基化淀粉膠溶液與質量濃度為2%的海藻酸鈉溶液按體積比為1:1混合。
[0017]每張所述聚碳酸酯微孔膜上海藻酸鈉-淀粉膠凝膠的用量為20ul，每張所述聚碳酸酯微孔膜的直徑為5cm、孔徑為0.22um，每張所述測定膜上乳酸菌干粉的量為0.1?0.0lg0
[0018]所述CaCl2溶液的質量分數為5%。
[0019]所述玻碳電極的預處理方法為:將玻碳電極依次分別用1.0μπι、0.3μπι、0.05μπι
粒徑的a -Al2O3楽在麂皮上拋光二次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用I: I的HNO3、無水乙醇、超純水清洗；在lmol/L H2SO4溶液中用掃描范圍為1.0?一1.0V,掃描速度為100mV/S的循環伏安法活化電極，重復掃描直至出現穩定的循環伏安曲線；上述的穩定的循環伏安曲線滿足下述要求:在實驗室條件下預處理后的電極的循環伏安曲線的峰電位差應在SOmV以下，并盡可能的接近64mV，電極方能使用，最后置于氮氣環境中干燥待用。
[0020]與現有技術相比，本發明的有益效果是:
[0021]本發明的制備方法根據抗生素可以抑制和殺滅乳酸菌從而產生電化學性質改變的原理，以海藻酸鈉-淀粉凝膠作固定劑，將乳酸菌固定到兩片核微孔膜中間制成“三明治”式核微孔膜，然后將其固定到玻碳電極上制成生物傳感電極，然后在MRS培養基溶液中37°C活化瑞士乳桿菌，最后按照常規方法與電化學工作站相連構建成固定化瑞士乳桿菌測定抗生素的電化學傳感器，為不同樣品中抗生素殘留的測定提供了新的途徑。所得傳感器檢測靈敏度高、成本低、簡單、快速，不僅適用于食品，特別是乳制品中抗生素殘留的定量化快速檢測，而且可以實現對多種類型的抗生素進行累計或單獨檢測。
【具體實施方式】
[0022]以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0023]實施例1
[0024]1、玻碳電極的預處理:
[0025]將玻碳電極依次分別用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μ m粒徑的a -Al2O3漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用1:1的HNO3、無水乙醇、超純水清洗。在lmol/L H2SO4溶液中用掃描范圍為1.0?一 1.0V，掃描速度為100mV/S的循環伏安法活化電極，重復掃描直至出現穩定的循環伏安曲線。上述的穩定的循環伏安曲線滿足下述要求:在實驗室條件下預處理后的電極的循環伏安曲線的峰電位差應在SOmV以下，并盡可能的接近64mV，電極方能使用，最后置于氮氣環境中干燥待用。
[0026]2、核微孔膜的制備:
[0027]將可溶性淀粉溶解于體積百分比濃度為I %的戊二醛溶液中，80°C水浴加熱并攪拌30min，配成質量濃度為1%的淀粉溶液，室溫放置12小時以上，使淀粉與戊二醛充分交聯得到醛基化淀粉膠溶液。將醛基化淀粉膠溶液再與質量濃度為2%的海藻酸鈉溶液按體積比為1:1混合，制得海藻酸鈉-淀粉膠凝膠。取上述海藻酸鈉-淀粉膠凝膠20ul均勻地涂到2張直徑為5cm、孔徑為0.22um的聚碳酸酯微孔膜上，然后稱取0.05g的瑞士乳酸菌干粉放置于一張微孔膜的圓心上，然后將另一張覆蓋上制成三明治結構的核微孔膜。
[0028]3、乳酸菌的活化:
[0029]將制備好的核微孔膜浸入到5% (質量分數)的CaCl2溶液中1s后取出，使海藻酸鈉與CaCl2反應形成穩定的螯合物，從而使海藻酸鈉溶液凝膠化成良好的固定劑，制得測定膜。最后，用皮套將測定膜固定在玻碳電極頭的表面使得乳酸菌與表征完的電極芯重合，則得到生物傳感電極，將制備好的生物傳感電極浸入到裝有MRS培養基的小燒杯中，使乳酸菌與培養基完全接觸，然后放置到37°C恒溫培養箱培養24h，使乳酸菌活化，最后按照常規方法與電化學工作站相連構建成用于測定抗生素的電化學型生物傳感器。
[0030]4、傳感器對3種抗生素的響應:
[0031]將得到的用于測定抗生素的電化學生物傳感器分別以10_3-10_1/!111的青霉素、鏈霉素、四環素溶液為測試底液，檢測其相應的電流變化率，然后以抗生素濃度的對數值為橫坐標、電流的變化率為縱坐標作圖。結果表明，隨著抗生素濃度的增加，其響應電流變化率也逐漸增大，而且該方法對青霉素、鏈霉素、四環素的最低檢測限分別為lXlO^g/mL、I X 10_9g/mL、l X 10_9g/mL，可知該生物傳感器的檢測性能可以達到歐盟對牛乳中這3種抗生素的最高殘留量檢測的要求。
[0032]將上述組裝好的用于測定抗生素的電化學生物傳感器在lX10_5g/mL的青霉素溶液中連續測定10次，結果相對標準偏差R.S.D為7.68%，證明該傳感器的誤差較小，定量效果較好。
[0033]將該用于測定抗生素的電化學生物傳感器于MRS培養基溶液中37°C保存，間歇性使用，第7天電流響應信號為初始電流的93.56%，表明該傳感器具有良好的穩定性。
[0034]取不同批次制備的用于測定抗生素的電化學生物傳感器5支，在相同條件下對同一濃度青霉素溶液進行測定，結果響應電流的相對標準偏差R.S.D.= 8.712%，說明該傳感器重現性良好。
[0035]本發明以海藻酸鈉-淀粉凝膠作固定劑，將乳酸菌固定到兩片核微孔膜中間制成“三明治”式傳感膜，然后將其固定到玻碳電極上制成生物傳感電極，然后在MRS培養基溶液中37°C活化乳酸菌，最后與電化學工作站相連構建成固定化瑞士乳桿菌測定抗生素的電化學傳感器。利用循環伏安法、交流阻抗法表征電極組裝的各個階段，利用計時電流法對3種抗生素進行測定，該傳感器對青霉素、鏈霉素、四環素的最低檢測限分別為I X lO^g/mL、I X 10 9g/mL、I X 10 9g/mL，檢出時間為 4min。
[0036]本發明結合電化學分析固定化乳酸菌制備的生物傳感器提供了一種新的定量測定抗生素的方法，其檢測靈敏度高、成本低、簡單、快速，不僅適用于食品，特別是乳制品中抗生素殘留的定量化快速檢測，而且可以實現對多種類型的抗生素進行累計或單獨檢測。
[0037]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種用于測定抗生素的電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括下述步驟: (1)將淀粉與低濃度戊二醛溶液混合并充分交聯反應得到醛基化淀粉膠溶液；將所得醛基化淀粉膠溶液與低濃度海藻酸鈉溶液混合，得到海藻酸鈉-淀粉膠凝膠； (2)取所得海藻酸鈉-淀粉膠凝膠均勻地涂到2張聚碳酸酯微孔膜上，然后將乳酸菌干粉放置于其中一張所述聚碳酸酯微孔膜的圓心上，制成三明治結構的核微孔膜； (3)將上述核微孔膜浸入CaCl2溶液中1s后取出，使海藻酸鈉與CaCl2反應形成穩定的螯合物，從而使海藻酸鈉溶液凝膠化成良好的固定劑，得到測定膜，最后，將測定膜固定在預處理后的玻碳電極頭的表面，使得乳酸菌與表征完的電極芯重合，得到生物傳感電極； (4)將上述生物傳感電極浸入MRS培養基中，使乳酸菌與培養基完全接觸，然后于37°C恒溫培養24h，使乳酸菌活化，得到用于測定抗生素的電化學生物傳感器。
2.根據權利要求1所述的用于測定抗生素的電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述醛基化淀粉膠溶液通過下述方法得到:將可溶性淀粉溶解于體積百分比濃度為I %的戊二醛溶液中，80°C水浴加熱并攪拌30min，配成質量濃度為I %的淀粉溶液，室溫放置12小時以上，使淀粉與戊二醛充分交聯得到醛基化淀粉膠溶液。
3.根據權利要求1所述的用于測定抗生素的電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，與所述醛基化淀粉膠溶液混合的海藻酸鈉溶液的質量濃度為2%，所述醛基化淀粉膠溶液與質量濃度為2%的海藻酸鈉溶液按體積比為1:1混合。
4.根據權利要求1所述的用于測定抗生素的電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，每張所述聚碳酸酯微孔膜上海藻酸鈉-淀粉膠凝膠的用量為20ul，每張所述聚碳酸酯微孔膜的直徑為5cm、孔徑為0.22um，每張所述測定膜上乳酸菌干粉的量為0.1?0.0lgo
5.根據權利要求1所述的用于測定抗生素的電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述CaCl2溶液的質量分數為5 %。
6.根據權利要求1所述的用于測定抗生素的電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述玻碳電極的預處理方法為:將玻碳電極依次分別用1.0 μπι、0.3 μπι、0.05 μ m粒徑的Ct-Al2O3漿在麂皮上拋光三次，且每次拋光后在超聲水浴中清洗30s，最后依次用1:1的HNO3、無水乙醇、超純水清洗；在lmol/L H2SO4溶液中用掃描范圍為1.0?一1.0V，掃描速度為100mV/S的循環伏安法活化電極，重復掃描直至出現穩定的循環伏安曲線；上述的穩定的循環伏安曲線滿足下述要求:在實驗室條件下預處理后的電極的循環伏安曲線的峰電位差應在SOmV以下，并盡可能的接近64mV，電極方能使用，最后置于氮氣環境中干燥待用。
【文檔編號】G01N27/26GK104483363SQ201510001590
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2015年1月5日 優先權日:2015年1月5日
【發明者】龐廣昌, 喬立新 申請人:天津商業大學