一種熒光成像裝置制造方法

一種熒光成像裝置制造方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種熒光成像裝置。所述裝置包括連續進樣裝置、樣品管道、切片激光器和高速熒光采集端；連續進樣裝置與樣品管道連接，樣品管道依次包括掃描管道和偏轉管道，掃描管道和偏轉管道夾角在60°至120°之間，掃描管道管壁為光學平整面；切片激光器產生的光切片投射在掃描管道上；連續熒光成像裝置垂直于切片光設置。本實用新型提供的裝置可實現高通量樣品熒光三維成像。
【專利說明】一種熒光成像裝置

【技術領域】
[0001]本實用新型屬于熒光成像領域，更具體地，涉及一種熒光成像裝置。

【背景技術】
[0002]切片光顯微成像系統(LSM)是一種新型的熒光顯微成像技術。與共聚焦與普通倒置熒光顯微鏡相比它具有低光毒性，高Z軸分辨率，大成像動態范圍等多項優勢，非常適用于多細胞結構的三維觀察。
[0003]現有的切片光顯微成像技術，比如選擇性平面照明顯微成像系統(SelectivePlane Illuminat1n Microscopy, SPIM)在做成像時需要進行一系列的樣品準備，固定和機械掃描。步驟通常是將一個樣品封裝在瓊脂糖中，再整體固定在一個精密的位移臺上，成像時控制位移臺或者掃描振鏡對樣品進行Z軸掃描。由于將多個樣品對齊并固定難度不小，加上振鏡的掃描范圍或位移臺的移動行程有限，這樣的常規方法很難進行高通量的多樣品成像。
實用新型內容
[0004]針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本實用新型提供了一種熒光成像裝置，其目的在于使高通量樣品依次通過掃描裝置成像，并在成像后迅速離開成像區域，避免影響下一樣品成像，由此解決目前三維熒光成像技術無法實現高通量成像的技術問題。
[0005]為實現上述目的，按照本實用新型的一個方面，提供了一種熒光成像裝置，包括連續進樣裝置、樣品管道、切片激光器和高速熒光采集端；所述連續進樣裝置與樣品管道連接，所述樣品管道，由基板的孔道形成，按照進樣方向依次包括掃描管道和偏轉管道，所述掃描管道和偏轉管道夾角在60°至120°之間，所述掃描管道管壁為光學平整面；所述切片激光器產生的光切片投射在掃描管道上；所述連續熒光成像裝置垂直于切片光設置。
[0006]優選地，所述熒光成像裝置，其掃描管道和偏轉管道夾角為90°。
[0007]優選地，所述熒光成像裝置，其光切片和偏轉管道夾角在0°至15°之間，優選0° 0
[0008]優選地，所述熒光成像裝置，其樣品管道還包括周期性彎管道，設置在掃描管道進樣方向上游，用于樣品混合。
[0009]優選地，所述熒光成像裝置，其樣品管道的周期性彎管道處設置有降溫裝置。
[0010]優選地，所述熒光成像裝置，其樣品管道為微流控芯片。
[0011]優選地，所述熒光成像裝置，其所述微流控芯片的材料為聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
[0012]優選地，所述熒光成像裝置，其連續進樣裝置為多相進樣裝置，優選Y型、T型十字型多相進樣裝置。
[0013]總體而言，通過本實用新型所構思的以上技術方案與現有技術相比，能夠取得下列有益效果:
[0014](I)本實用新型提供的熒光成像裝置，樣品管道的掃描管道和偏轉管道呈一定角度，使得樣品在掃描后迅速離開成像區域，不會影響到下一樣品成像。
[0015](2)本實用新型提供的熒光成像裝置高度集成，可將樣品的環境調節，順序的裝載，流動控制，三維成像，導出等一系列功能集中在一塊芯片上實現；通過掃描管道管壁的光學平整面，可取得良好的熒光激發效果和熒光成像質量，從而將切片光顯微成像技術與微流控技術有機結合，實現基于芯片的光流控切片光顯微成像。
[0016](3)本實用新型提供的裝置利用樣品在微流管道中的穩定流動執行三維掃描成像，無需使用精密的機械掃描裝置。
[0017](4)本實用新型提供的熒光成像裝置，樣品序列24中的多個樣品，可連續掃描成像，實現樣品高通量成像，可用于生物學上的高通量篩選，如聯合藥物篩選、胚胎篩選等，具有重大的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是實施例1的熒光成像裝置結構示意圖；
[0019]圖2是實施例2的熒光成像裝置結構示意圖；
[0020]圖3是實施例3的熒光成像裝置結構示意圖；
[0021]圖4是實施例4的熒光成像裝置的成像示意圖；
[0022]圖5是實施例4熒光成像裝置的成像結果；其中:圖5a為樣品開始掃描時的位置，圖5a’為樣品開始掃描時的掃描照片，圖5b為樣品結束掃描時的位置，圖5b’為樣品結束掃描時的掃描照片，圖5C為三維重構后的樣品圖像。
[0023]在所有附圖中，相同的附圖標記用來表示相同的元件或結構，其中:1為連續進樣裝置，2為樣品管道，3為切片激光器，4為高速熒光采集端，5為注射器泵，6為蠕動泵，7為降溫裝置，21周期性彎管道，22為掃描管道，23為偏轉管道，24為樣品序列。

【具體實施方式】
[0024]為了使本實用新型的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本實用新型進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本實用新型，并不用于限定本實用新型。此外，下面所描述的本實用新型各個實施方式中所涉及到的技術特征只要彼此之間未構成沖突就可以相互組合。
[0025]本實用新型提供的熒光成像裝置，包括連續進樣裝置1、樣品管道2、切片激光器3和高速熒光采集端4。
[0026]所述連續進樣裝置I與樣品管道2連接。所述連續進樣裝置I為多相進樣裝置，優選Y型、T型或十字型多相進樣裝置。所述連續進樣裝置1，可通過注射器泵5、蠕動泵6等控制所述連續相和離散相的流動速率。
[0027]所述樣品管道2，為在基板上形成的孔道，可采用微流控芯片，按照進樣方向依次包括周期性彎管道21、掃描管道22和偏轉管道23。所述掃描管道22和偏轉管道23夾角在60°至120°之間，優選為90°。所述掃描管道22管壁為光學平整面。所述周期性彎管道21，設置在掃描管道22進樣方向上游，用于樣品混合。所述樣品管道2的周期性彎管道21處設置有降溫裝置7，所述降溫裝置7可為冷凝片，優選熱電冷凝片。所述微流控芯片的材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚甲基丙烯酸甲酯。
[0028]當使用PDMS制備所述微流控芯片時，光學平整面的具體制備方法如下:準備一塊光潔的硅片，在硅片上旋涂上一層PDMS薄層；然后將芯片的刀切口面放置在未固化的PDMS薄層中，輕壓去除界面的氣泡；將放置在硅片上的芯片整體放進烘箱中，烘烤待PDMS固化后取出；小心地從硅片上揭下芯片，因為硅片表面的高平整度，經過處理后的側面散射顯著減少，呈現完全透明的狀態，符合顯微級熒光圖像采集的要求。PDMS厚度優選為500微米左右。離散相為水相，連續相為油相時，優選對微流芯片管道進行疏水處理，所述疏水處理進一步優選為硅烷化處理。
[0029]所述切片激光器3產生的光切片投射在掃描管道22上。所述光切片和偏轉管道23夾角在-30°至30°之間，優選0°。
[0030]所述連續熒光成像裝置垂直于切片光設置。
[0031]本實用新型提供的熒光成像裝置，成像步驟如下:
[0032](I)將熒光標記的待成像樣品分散于連續相中，所述進樣裝置驅動連續相，帶動樣品形成樣品序列24 ；
[0033]所述待成像樣品為離散相包裹的熒光標記生物樣本，所述離散相與連續相為互不相容的兩相，可以為液相和氣相、液相和固相或液相和液相，優選為兩液相。當連續相為氣相時，優選空氣柱，當連續相為液相時，優選油相。更優選地，所述離散相為瓊脂相，所述連續相為油相。瓊脂相為質量濃度在0.2%至1%之間的瓊脂糖溶液，溫度為35至50攝氏度。
[0034](2)步驟⑴中形成的樣品序列24進入樣品管道2，當樣品經過所述周期性彎管道21時，所述連續相和離散均勻混合，形成均勻的樣品序列24 ;進而當所述樣品序列24經過掃描管道22時，其中的每個樣品經過所述激光切片器產生的光切片時，被激發產生熒光，所述熒光被所述連續熒光成像裝置采集，形成多張切面熒光圖，樣品隨后進入偏轉管道23。優選地，當所述連續相和離散相經過所述周期性彎管道21時，對其進行降溫處理。
[0035]所述光切片的掃描率S，按照以下式子確定:
[0036]S = V/F
[0037]其中，V為離散相的流動速率，F為高速熒光采集端4的采集幀率。
[0038]每個樣品流過拐角掃描管道22，拐進偏轉管道23，不影響下一個樣品的成像。
[0039]當離散相為水相，連續相為油相，由于流體剪切力以及水相-油相界面的不浸潤，樣品管道2內生成一系列分散于油相中的水相液滴，液滴的大小由管道尺寸、水相-油相速率的比值決定，產生頻率與水相總注射速率與油相注射速率的比值成正比，液滴在樣品管道2里的流動速度由所有入口流體的總速度決定，液滴中熒光的強度或者細胞的濃度由樣品的原始濃度、樣品通路的注射速率與水相通路的注射速率的比值決定。
[0040]根據不同的應用要求來設計不同芯片，對樣品執行不同方式的操作。對于體積較大或不易團聚的樣品，可通過控制樣品序列24的密度和樣品序列24在微流管道中的流速來獲得以一定間隔分散在樣品管道2中的樣品，管道的尺寸只稍大于樣品，以便樣品的穩定流動，樣品在管道中的流速通過注射器泵5、蠕動泵6等控制。對于微小，且易團聚的樣品，比如多細胞溶液，可通過設置互不相溶的兩相，使樣品被包裹于離散相的液滴中來獲得以一定間隔分散在微流管道中的樣品。
[0041]在微流控芯片的設置周期性彎管道21，作為混合、冷卻區域，以增加流程，提高液滴內部樣品的混合，同時增加冷卻時間。流經周期性彎管道21結的樣品經過局部的大程度降溫，在流經L型拐角傳感區域進行成像的過程中樣品基本不發生位移變化，從而提高了成像質量。當樣品分散在瓊脂液滴中時，瓊脂液滴因降溫發生凝固，從而減少了樣品相對于瓊脂液滴的位移變化。
[0042](3)堆積步驟(2)中形成的多張切面熒光圖，從而重構出所述樣品的三維圖像，可采用三維像素超分辨算法。
[0043]以下為實施例:
[0044]實施例1
[0045]一種熒光成像裝置，如圖1所示，包括連續進樣裝置1、樣品管道2、切片激光器3和高速熒光采集端4。
[0046]所述連續進樣裝置I與樣品管道2連接。所述連續進樣裝置I為Y型多相進樣裝置。所述連續進樣裝置1，通過注射器泵5控制所述連續相和離散相的流動速率。
[0047]所述樣品管道2，采用微流控芯片，按照進樣方向依次包括周期性彎管道21、掃描管道22和偏轉管道23。所述掃描管道22和偏轉管道23夾角為90°。所述掃描管道22管壁為光學平整面。所述周期性彎管道21，設置在掃描管道22進樣方向上游，用于樣品混合。所述樣品管道2的周期性彎管道21處設置有熱電冷凝片。所述微流控芯片的材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
[0048]當使用PDMS制備所述微流控芯片時，光學平整面的具體制備方法如下:準備一塊光潔的硅片，在硅片上旋涂上一層PDMS薄層；然后將芯片的刀切口面放置在未固化的PDMS薄層中，輕壓去除界面的氣泡；將放置在硅片上的芯片整體放進烘箱中，烘烤待PDMS固化后取出；小心地從硅片上揭下芯片，因為硅片表面的高平整度，經過處理后的側面散射顯著減少，呈現完全透明的狀態，符合顯微級熒光圖像采集的要求。PDMS厚度優選為500微米左右。對微流芯片管道進行疏水處理，所述疏水處理為硅烷化處理。
[0049]所述切片激光器3產生的光切片投射在掃描管道22上。所述光切片和偏轉管道23夾角為0°。
[0050]所述連續熒光成像裝置垂直于切片光設置。
[0051]實施例2
[0052]一種熒光成像裝置，如圖2所示，包括連續進樣裝置1、樣品管道2、切片激光器3和高速熒光采集端4。
[0053]所述連續進樣裝置I與樣品管道2連接。所述連續進樣裝置I為T型多相進樣裝置。所述連續進樣裝置1，通過注射器泵5控制所述連續相和離散相的流動速率。
[0054]所述樣品管道2，采用微流控芯片，按照進樣方向依次包括周期性彎管道21、掃描管道22和偏轉管道23。所述掃描管道22和偏轉管道23夾角為60°。所述掃描管道22管壁為光學平整面。所述周期性彎管道21，設置在掃描管道22進樣方向上游，用于樣品混合。所述樣品管道2的周期性彎管道21處設置有水冷降溫裝置7。所述微流控芯片的材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
[0055]當使用PDMS制備所述微流控芯片時，光學平整面的具體制備方法如下:準備一塊光潔的硅片，在硅片上旋涂上一層PDMS薄層；然后將芯片的刀切口面放置在未固化的PDMS薄層中，輕壓去除界面的氣泡；將放置在硅片上的芯片整體放進烘箱中，烘烤待PDMS固化后取出；小心地從硅片上揭下芯片，因為硅片表面的高平整度，經過處理后的側面散射顯著減少，呈現完全透明的狀態，符合顯微級熒光圖像采集的要求。PDMS厚度優選為500微米左右。對微流芯片管道進行疏水處理，所述疏水處理為硅烷化處理。
[0056]所述切片激光器3產生的光切片投射在掃描管道22上。所述光切片和偏轉管道23夾角為-30°。
[0057]所述連續熒光成像裝置垂直于切片光設置。
[0058]實施例3
[0059]一種熒光成像裝置，如圖3所示，包括連續進樣裝置1、樣品管道2、切片激光器3和高速熒光采集端4。
[0060]所述連續進樣裝置I與樣品管道2連接。所述連續進樣裝置I為十字型多相進樣裝置。所述連續進樣裝置1，通過蠕動泵6控制所述連續相和離散相的流動速率。
[0061]所述樣品管道2，采用微流控芯片，按照進樣方向依次包括周期性彎管道21、掃描管道22和偏轉管道23。所述掃描管道22和偏轉管道23夾角為120°。所述掃描管道22管壁為光學平整面。所述周期性彎管道21，設置在掃描管道22進樣方向上游，用于樣品混合。所述樣品管道2的周期性彎管道21處設置有風冷降溫裝置7。所述微流控芯片的材料為聚甲基丙烯酸甲酯。
[0062]所述切片激光器3產生的光切片投射在掃描管道22上。所述光切片和偏轉管道23夾角為30°。
[0063]所述連續熒光成像裝置垂直于切片光設置。
[0064]實施例4
[0065]一種熒光成像方法，應用實施例1中的熒光成像裝置(三維視圖如圖4所示)，包括以下步驟:
[0066](I)將熒光標記的待成像樣品分散于離散相中，所述進樣裝置驅動連續相，帶動樣品形成樣品序列24 ；
[0067]所述待成像樣品為離散相包裹的綠色熒光標記的瓊脂糖液滴，所述連續相為具有良好生物兼容性的FC-40氟油，所述離散相為含瓊脂糖水溶液。質量濃度在0.2%至1%，溫度在35至50度之間。
[0068](2)步驟(I)中形成的混合尚不均勻的樣品序列24進入樣品管道2，當樣品經過所述周期性彎管道21時，所述連續相和離散均勻混合，形成均勻的樣品序列24 ;進而當序列中某一樣品26流過掃描管道22時，即被所述激光切片器產生的光切片28掃描，同時被激發產生熒光，所述熒光被所述連續熒光成像裝置采集，形成多張切面熒光圖，樣品隨后進入偏轉管道23，被導出留作進一步培養用，如樣品所示當所述連續相和離散相經過所述周期性彎管道21時，均對其進行降溫處理。
[0069]離散相的流動速率V = lmm/s,高速熒光采集端4的采集幀率F = 400fps，所述光切片的掃描率S = 2.5微米。
[0070]每個樣品流過拐角掃描管道22，拐進偏轉管道23，不影響下一個樣品的成像。
[0071](3)堆積步驟(2)中形成的多張切面熒光圖，從而重構出所述樣品的三維圖像，如圖5所示，其中圖5a為樣品開始掃描時的位置，圖5a’為樣品開始掃描時的掃描照片，圖5b為樣品結束掃描時的位置，圖5b’為樣品結束掃描時的掃描照片，圖5C為三維重構后的樣品圖像。
[0072]本領域的技術人員容易理解，以上所述僅為本實用新型的較佳實施例而已，并不用以限制本實用新型，凡在本實用新型的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本實用新型的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種熒光成像裝置，其特征在于，包括連續進樣裝置(1)、樣品管道(2)、切片激光器(3)和高速熒光采集端(4);所述連續進樣裝置(1)與樣品管道(2)連接，所述樣品管道(2)，由基板的孔道形成，按照進樣方向依次包括掃描管道(22)和偏轉管道(23)，所述掃描管道(22)和偏轉管道(23)夾角在60°至120°之間，所述掃描管道(22)管壁為光學平整面；所述切片激光器(3)產生的光切片投射在掃描管道(22)上；所述連續熒光成像裝置垂直于切片光設置。
2.如權利要求1所述的熒光成像裝置，其特征在于，所述掃描管道(22)和偏轉管道(23)夾角為90°。
3.如權利要求1所述的熒光成像裝置，其特征在于，所述光切片和偏轉管道(23)夾角在0。至15。之間。
4.如權利要求1所述的熒光成像裝置，其特征在于，所述樣品管道(2)還包括周期性彎管道(21)，設置在掃描管道(22)進樣方向上游，用于樣品混合。
5.如權利要求4所述的熒光成像裝置，其特征在于，所述樣品管道(2)的周期性彎管道(21)處設置有降溫裝置(7)。
6.如權利要求1至5任意一項所述的熒光成像裝置，其特征在于，所述樣品管道(2)微流控芯片。
7.如權利要求6所述的熒光成像裝置，其特征在于，所述微流控芯片的材料為聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。
8.如權利要求1所述的熒光成像裝置，其特征在于，所述連續進樣裝置(1)為多相進樣>j-U ρ?α裝直。
【文檔編號】G01N21/64GK204128966SQ201420530078
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月15日 優先權日:2014年9月15日
【發明者】費鵬, 關澤一, 董思炎, 虞之龍 申請人:華中科技大學