一種mes,nhs殘留的hplc檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種MES,NHS殘留的HPLC檢測方法，是采用反相C18硅膠鍵合色譜柱，流動相由pH6.5~6.8的磷酸鹽緩沖液和有機溶劑組成，檢測波長205~210nm；所述有機溶劑為甲醇或乙腈。該方法樣品無需特殊處理，操作方法簡單易行，準確度高，能夠滿足實際檢測中的需要，MES和NHS這兩種物質的檢測能夠達到微克級。
【專利說明】-種MES, NHS殘留的HPLC檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種MES，NHS殘留的HPLC檢測方法。
【背景技術】
[0002] 在現今較為穩定的化學交聯方法中，碳二亞胺的交聯體系越來越受到關注，碳二 亞胺的交聯體系能夠應用于生物多糖、多肽、蛋白質，核酸以及高分子改性等各個生物、有 機合成等領域，其本身毒性小，交聯效果迅速，結果穩定等優點都極好地彌補了傳統采用甲 醛，戊二醛交聯方式所帶來的安全性等問題。相比于熱交聯等物理交聯方法而言，碳二亞胺 的交聯體系更為穩定，交聯出的產品更加均一。2-嗎啉乙磺酸(MES)在交聯體系中提供較 為穩定的PH范圍，為EDC的交聯反應提供穩定的酸堿環境，N-羥基丁二酰亞胺（NHS)為交 聯反應中穩定交聯產生的中間體。這兩種物質在碳二亞胺的交聯體系中為交聯提供條件的 重要物質，在制藥工程中，NHS還是半合成卡那霉素及醫藥中間體的原料。在交聯工藝完成 以后，交聯劑本身的殘留定量檢測就成為一個亟待解決的問題，在ICH(The International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use人用藥物注冊技術要求國際協調會議)在《Q3AR2:新原料 藥中雜質》中規定，每日最大劑量的藥物中，其含有的雜質界定閾值為〇. 1%或者lmg，現今， 對于MES和NHS作這兩種交聯物質的微量殘留檢測方法還不完善。這為碳二亞胺交聯體系 在藥物或者醫療器械的廣泛應用帶來了限制，篩選一種MES和NHS有效的檢測方法對于碳 二亞胺交聯體系的廣泛應用有著重要意義。
[0003] 2-嗎啉乙磺酸（MES)和N-羥基丁二酰亞胺（NHS)這兩種物質極性較大，其在水中 的溶解度較大，這實際上為兩種物質實現單獨定量增加了困難。
【發明內容】
[0004] 針對現有技術中的上述問題，本發明提供了一種精確度較高，能夠滿足實際需求 的MES，NHS殘留的HPLC檢測方法。
[0005] 本發明的MES，NHS殘留的HPLC檢測方法，采用反相C18硅膠鍵合色譜柱，流動相由 pH值為6. 5飛.8的磷酸鹽緩沖液和有機溶劑組成，檢測波長205~210nm ;所述有機溶劑為甲 醇或乙腈。
[0006] 其中所述的磷酸鹽緩沖液為《中華人民共和國藥典》2010年版二部，附錄X V D緩 沖液部分記載的pH值在6. 5飛.8范圍內的磷酸鹽緩沖液。
[0007] HPLC檢測方法具有定量準確、檢測周期短等優點，是較為適于進行微量檢測的方 法之一。而要實現MES和NHS的HPLC單獨定量檢測就必須首先實現這兩種物質之間的分 離度R > 1. 5。經過研究發現，兩種物質的分離度和流動相的組分，流動相的pH值，流動相 配比等多種因素相關，綜合性考察各方面因素后得出上述檢測方法，能夠獲得良好的分析 結果。
[0008] 作為優選方案，所述磷酸鹽緩沖液與有機溶劑的體積比為95:5~98:2。由于MES和 NHS都極易溶于水而從色譜柱中洗脫出來，會導致保留時間不夠而分離度較低，所以有機溶 劑的體積含量不能太大，水相和有機相的體積比在95:5~98:2比較合適，滿足MES和NHS兩 種物質之間的分離度R > 1. 5的要求。其中以磷酸鹽緩沖液與有機溶劑體積比為97:3的 比例混合最佳，采用單通道分析，最大程度克服因為高效液相色譜儀的泵頭計量等因素，在 水相和有機相比例懸殊時可能會導致的計量不準確問題。
[0009] 作為優選方案，所述有機溶劑為甲醇。MES和NHS在甲醇中的保留時間差別較大， 更有利于兩種物質的單獨定量檢測，磷酸鹽緩沖液和甲醇體積比為97:3,選擇該比例的混 合液作為流動相，MES和NHS的分離度可以達到2. 3,可以保證檢測結果更加精確。
[0010] 作為優選方案，磷酸鹽緩沖液的pH值為6. 5,用該pH值的磷酸鹽緩沖液與有機相 組成的流動相，相較于其他PH值分離效果更優。
[0011] 作為優選方案，檢測波長為210nm。選擇該檢測波長值，能夠進一步降低邊緣吸收。
[0012] 作為優選方案，流動相流速為I. OmL/min。流速過快會導致分離物質太快出峰，分 離度不好，過慢會導致物質峰形變寬而影響峰形，本發明的檢測方法中I. OmL/min的流速 最為適合。
[0013] 作為優選方案，反相C18硅膠鍵合色譜柱可以選擇商品ZORBAX. SB-C18。這種類型 的色譜柱能夠較好適用于本發明方法且價格相對便宜，可以降低檢測成本。
[0014] 作為優選方案，所述色譜柱內徑4. 6mm，柱長250mm，填料粒徑5 iim。柱長過短容易 造成分離物質出峰太快，保留時間較短等缺陷，250mm柱長能夠很好地克服該缺陷，使檢測 方法更加穩定可控。
[0015] 作為優選方案，進樣量為l〇y L，選擇該進樣量能夠使被檢測物質在檢測波長段內 出的響應高低適中，進一步增加檢測方法的準確性。
[0016] 作為優選方案，還包括配制MES的標準品溶液和NHS的標準品溶液，分別注入色譜 儀，記錄色譜圖，繪制MES的標準曲線和NHS的標準曲線；供試樣品按照與標準品溶液相同 的條件進行HPLC檢測，根據標準曲線確定供試樣中MES和NHS的含量。
[0017] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果： 本發明的MES，NHS殘留的HPLC檢測方法，樣品無需特殊處理，操作方法簡單易行，準確 度高，NHS和MES在20 ii g/mL飛O ii g/mL范圍內有較為良好的線性范圍，能夠滿足實際檢測 中的需要,這兩種物質的檢測能夠達到微克級。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018] 圖1 :流動相比例為97:3樣品色譜圖； 圖2 :NHS標準曲線； 圖3 :MES標準曲線； 圖4:標準曲線空白-純化水； 圖5:1#樣品色譜圖； 圖6:2#樣品色譜圖； 圖7:3#樣品色譜圖； 圖8 :4#樣品色譜圖； 圖9:5#樣品色譜圖。
【具體實施方式】
[0019] 1 ?設備信息 色譜儀：島津高效液相色譜儀LC-20AB ; 色譜柱：Z0RBAX. SB-C18 4. 6mm*250mm*5 ii m ; 進樣量：10iiL。
[0020] 2.高效液相色譜法對MES和NHS檢測方法考察 2. I MES和NHS試驗液的配制 MES試驗液（300ii g/mL):精密稱取樣品30. 09mg，用純化水溶解，定容至100mL。
[0021] NHS試驗液（300 ii g/mL):精密稱取樣品30. 07mg，用純化水溶解，定容至100mL。
[0022] 2. 2檢測波長的確定 分別取MES和NHS的試驗液在紫外可見分光光度計上進行全波長掃描。結果表明，NHS 從300nm開始出現吸收，至200nm處達到最大，MES自220nm處出現吸收，200nm處達到最 大，因為流動相的有機相在200nm處存在邊緣吸收，因此最終選擇210nm作為HPLC的檢測 波長。
[0023] 2. 3流動相的選擇 在流動相中，有機相和水相，緩沖物質以及PH對于樣品的分離都存在影響。
[0024] 2. 3. 1有機相選擇 水相為磷酸鹽緩沖液，分別采用甲醇和乙腈進行分離，結果見表1。
【權利要求】
1. 一種MES，NHS殘留的HPLC檢測方法，其特征在于，采用反相C18硅膠鍵合色譜柱，流 動相由pH值為6. 5飛.8的磷酸鹽緩沖液和有機溶劑組成，檢測波長205~210nm ;所述有機 溶劑為甲醇或乙腈。
2. 根據權利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖液 與有機溶劑的體積比為95:5~98:2。
3. 根據權利要求2所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖液 與有機溶劑的體積比為97:3。
4. 根據權利要求3所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測方法，其特征在于，所述有機溶劑 為甲醇。
5. 根據權利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖液 的pH值為6. 5。
6. 根據權利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測方法，其特征在于，檢測波長為 210nm〇
7. 根據權利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測方法，其特征在于，流動相流速為 1. OmT,/mi n 〇
8. 根據權利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測方法，其特征在于，所述色譜柱內 徑4. 6mm，柱長250mm，填料粒徑5 u m。
9. 根據權利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測方法，其特征在于，進樣量為 10 U L〇
10. 根據權利要求1所述的MES，NHS殘留的HPLC檢測方法，其特征在于，還包括配制 MES的標準品溶液和NHS的標準品溶液，分別注入色譜儀，記錄色譜圖，繪制MES的標準曲線 和NHS的標準曲線；供試樣品按照與標準品溶液相同的條件進行HPLC檢測，根據標準曲線 確定供試樣中MES和NHS的含量。
【文檔編號】G01N30/06GK104407077SQ201410839225
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月30日 優先權日:2014年12月30日
【發明者】楊中科, 龔彥銘, 陳衛英, 丁祥, 李娟 , 李好雨, 張兆利, 楊安順, 蔣小龍, 彭紅衛 申請人:蘇州達普生物技術有限公司