利用靜電場誘發蛋白質構象變形和去折疊的方法
【專利摘要】本發明提供利用靜電場拉伸蛋白質去折疊的方法，將胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、葡萄糖氧化酶和牛血清白蛋白常用的蛋白質用聚2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸、亞甲基雙丙烯酰胺和過硫酸銨的磷酸鹽緩沖液進行包埋。這種電活性聚合物結構中含有大量的磺酸基團，在堿性條件下磺酸基團帶負電荷，造成了蛋白質分子周圍的電致響應環境。蛋白質被置于熒光檢測系統中。在波長為280nm的紫外光的激發下發射出波長為332nm的熒光。一旦蛋白質發生去折疊，埋藏在蛋白質結構內部的Trp就會逐漸暴露在溶劑中，這致使發射的熒光強度發生變化。此方法所應用的儀器簡單，操作便捷。可望在蛋白質去折疊、再折疊和錯折疊的研究中得到進一步的應用。
【專利說明】利用靜電場誘發蛋白質構象變形和去折疊的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種蛋白質折疊和去折疊的電化學方法；特別是利用靜電場拉伸蛋白質去折疊的方法；具體涉及采用靜電場來誘發胰蛋白酶和牛血清白蛋白的構象從天然態到去折疊態轉變的一種工藝方法。
【背景技術】
[0002]蛋白質是生命基礎。這種生物大分子是由多肽鏈通過有效的折疊形成活性結構，從而能夠執行各種生物功能。而蛋白質折疊是一種極其復雜的物理化學過程，錯誤的折疊可導致阿爾茨海默病、帕金森病、海綿狀腦病、瘋牛病、囊性纖維病變、脊髓側索硬化癥、家族性高膽固醇癥、家族性淀粉樣蛋白癥、某些腫瘤、白內障等(Taubes G.Science 1996，271，1493-1495 ;周筠梅.生物化學與生物物理進展.2000，27，579-584)。而研宄蛋白質體外的去折疊和再折疊逐成為探索其機制的重要手段。
[0003]以往研宄蛋白質體外去折疊的方法均是在蛋白質溶液中加入脲或鹽酸胍等變性劑(Fersht AR，Daggett V.Cell 2002，108，573-582 ;Guo LH, Qu N.Anal Chem 2006，78，6275-6278 ；Biggar KK，et al.B1techniques 2012，53，231-238)。這些變性劑可以與蛋白質結構中的氨基酸形成氫鍵，從而破壞蛋白質結構內部的氫鍵網絡，使全部或部分的蛋白質結構轉變成無規多肽鏈，由此實現蛋白質的去折疊和蛋白質穩定性的研宄。還可以進一步采取透析的方法除去變性劑，或者使用停流法快速沖淡變性劑的濃度，使蛋白質重新進行折疊，由此完成蛋白質體外再折疊、錯折疊和分子伴侶的研宄。
[0004]然而，變性劑方法具有蛋白質變性響應時間慢的缺點。變性劑分子加入蛋白質溶液并與蛋白質分子充分混合需要一定的時間。而通過透析使變性劑分子脫離蛋白質則需要更長的時間。停流法可以瞬間降低變性劑的濃度，這有利于研宄蛋白質折疊的瞬態(前穩態)動力學，但需要昂貴的儀器設備。即使這樣仍需要微秒級的弛豫時間。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是解決現有技術的問題，提供了一種適用于實時監測靜電場作用下蛋白質構象變化的熒光檢測系統，利用該系統能夠構建一種電場拉伸胰蛋白酶和牛血清白蛋去折疊的研宄方法。
[0006]以一種電致響應水凝膠聚2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸將蛋白質分子進行包埋，然后施加不同強度的靜電場，通過電場拉伸帶有偶極矩的蛋白質構象來迫使蛋白質分子發生變形和去折疊，并以熒光光譜來跟蹤監測蛋白質去折疊的過程。
[0007]本發明的技術方案如下:
[0008]一種利用靜電場拉伸蛋白質去折疊的方法，步驟如下:
[0009]I)用NaOH調節濃度范圍0.1?0.3g/mL的2_丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸、
0.03?0.lg/mL的亞甲基雙丙烯酰胺和0.004?0.012g/mL的過硫酸銨的磷酸鹽緩沖液，使溶液的酸堿度呈中性；
[0010]2)向體系中加入濃度0.004?0.012g/mL的蛋白質，溶解后再加入2Χ1(Γ4?4X10_4g/mL的四甲基乙二銨；
[0011]3)將混合液置于石英比色皿中，插入一對鉑電極；15min后溶液固化形成水凝膠，凝膠中埋藏著蛋白質分子；將比色皿置于熒光光譜儀中，設定激發波長為280nm，發射波長為 332nm ；
[0012]4)用函數信號發生器對電極施加電場，測量電場作用下發射光譜強度隨時間的變化，表征蛋白質分子的形變和構象的去折疊。
[0013]所述蛋白質包括胰蛋白酶或牛血清白蛋白。
[0014]蛋白質被置于熒光檢測系統中，蛋白質結構中的色氨酸在波長為280nm的紫外光的激發下發射出波長為332nm的熒光；通過對332nm處熒光強度的測量對蛋白質去折疊的過程進行跟蹤監測。
[0015]所施加靜電場的強度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0V/cm。
[0016]利用電場作用于蛋白質，蛋白質對電場刺激的響應幾乎沒有弛豫時間，適用于研宄蛋白質去折疊的前穩態過程。
[0017]本發明技術方案基于以下的原理:
[0018]將胰蛋白酶和牛血清白蛋白這些常用的蛋白質用一種電致響應水凝膠聚2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸進行包埋。這種電活性聚合物的結構中含有大量的磺酸基團，在堿性條件下磺酸基團帶負電荷，造成了蛋白質分子周圍的電致響應環境。
[0019]蛋白質結構中同時含有堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)和酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)，遺傳大分子結構中存在著不同的偶極矩。在電場存在下，堿性基團在酸性條件下可形成正離子并受到負極的吸引；酸性基團在堿性條件下形成負離子并受到正極的吸弓I。這些靜電引力可拉長偶極矩，同時導致對整個蛋白質構象的拉伸。
[0020]此外，電活性聚合物中的磺酸基在條件下帶有負電荷，這些電荷也會受到正極的吸引從而導致聚合物對外界電場產生響應。電活性聚合物的電響應也迫使包含在其中的蛋白質產生變形。
[0021]在我們的方法中，蛋白質被置于熒光檢測系統中。蛋白質結構中的色氨酸(Trp)會在波長為280nm的紫外光的激發下發射出波長為332nm的熒光。一旦蛋白質發生去折疊，埋藏在蛋白質結構內部的Trp就會逐漸暴露在溶劑中，這致使發射的熒光強度發生變化。通過對332nm處熒光強度的測量就可對蛋白質去折疊的過程進行跟蹤監測。
[0022]在施加電場期間，焚光強度的下降速率隨著施加電極電壓的升高而增大，這意味著電場強度的增強會加大對蛋白質拉伸的程度。如圖1所示:在測試的前50s熒光強度基本在水平上波動；在50?250s期間對體系施加電場，熒光強度呈下降趨勢；在250s后撤銷電場，熒光強度恢復到水平波動的狀態。從附圖上看，在下一次施加電場時起始熒光強度較前一次有所下降，這說明電場對蛋白質的拉伸在電場消失后并不會立即回復。其殘留的變形隨電場強度的增大而上升。電場強度越高，熒光強度下降得就越快，說明胰蛋白酶去折疊的程度和速率就越大。
[0023]本發明公開了一種采用靜電場誘發蛋白質構象的變形和去折疊，用于研宄蛋白質折疊的工藝方法。所述的工藝方法是以不同強度的靜電場拉伸蛋白質的構象，使埋藏在蛋白質結構中色氨酸等殘基的熒光性質發生改變。通過對熒光光譜跟蹤監測不同電場強度下包埋在電致響應水凝膠中胰蛋白酶和牛血清白蛋白熒光強度的變化可以對蛋白質去折疊的進程和速率進行測量。此方法所應用的儀器簡單，操作便捷。與利用變性劑的方式研宄蛋白質去折疊相比，具有響應速度快，體系無污染的特點，可望在蛋白質去折疊、再折疊和錯折疊的研宄中得到進一步的應用。
[0024]本發明的優點在于:
[0025]1.通過靜電場誘發蛋白質構象的過程可以對胰蛋白酶和牛血清白蛋白構象的變形和去折疊進行定量檢測。
[0026]2.本發明所述的方法在蛋白質去折疊研宄中與傳統的變性劑方法相比具有響應速度快。在利用鹽酸胍或尿素變性劑對蛋白質進行去折疊時，加入變性劑并與體系混溶至少需要數秒的時間，但測量和分析蛋白質在去折疊和再折疊過程的最初幾微秒(10_3秒)的行為在蛋白質折疊研宄中是至關重要的。使用停流法雖然可以滿足這一需要，但需要昂貴的設備。本發明利用電場作用于蛋白質，蛋白質對電場刺激的響應幾乎沒有弛豫時間，所以特別適用于研宄蛋白質去折疊的前穩態過程。
[0027]3.本發明所述的方法只需要熒光檢測設備和簡單的直流電發生儀，成本低廉。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1:胰蛋白酶在波長在332nm處熒光強度隨時間的變化。
【具體實施方式】
[0029]本發明公開和提出的利用靜電場拉伸蛋白質去折疊的方法，通過較佳實施例子進行描述，相關技術人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現本發明技術。特別需要指出的是，所有相類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，他們都被視為包括在本發明精神、范圍和內容中。
[0030]技術方案如下:
[0031]I)用NaOH調節濃度范圍0.1?0.3g/mL的聚2_丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸、0.03?0.lg/mL的亞甲基雙丙烯酰胺和0.004?0.012g/mL的過硫酸銨的磷酸鹽緩沖液，使溶液的酸堿度呈中性；
[0032]2)向體系中加入濃度0.004?0.012g/mL的蛋白質，溶解后再加入2Χ1(Γ4?4X10_4g/mL的四甲基乙二銨；
[0033]3)將混合液置于石英比色皿中，插入一對鉑電極；15min后溶液固化形成水凝膠，凝膠中埋藏著胰蛋白酶蛋白質分子；將比色皿置于熒光光譜儀中，設定激發波長為280nm，發射波長為332nm ；
[0034]4)用函數信號發生器對電極施加電場，測量電場作用下發射光譜強度隨時間的變化，以此表征蛋白質分子的形變和構象的去折疊。
[0035]以下實施例只是說明性的:
[0036]實施例1:
[0037]將6g的2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸和2g亞甲基雙丙烯酰胺溶于200mL磷酸鹽緩沖液中，加入0.3g過硫酸銨。用NaOH調節溶液的pH值至7。加入0.2g胰蛋白酶，待溶解后再加入1mg四甲基乙二銨。將混合液置于石英比色皿中，插入一對鉑電極。15min后溶液固化形成水凝膠，凝膠中包埋著胰蛋白酶分子。
[0038]實施例2:
[0039]將15g的2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸和5g亞甲基雙丙烯酰胺溶于200mL磷酸鹽緩沖液中，加入0.6g過硫酸銨。用NaOH調節溶液的pH值至7。加入0.6g牛血清白蛋白，待溶解后再加入20mg四甲基乙二銨。將混合液置于石英比色皿中，插入一對鉑電極。15min后溶液固化形成水凝膠，凝膠中包埋著牛血清白蛋白分子。
[0040]實施例3:
[0041]將比色皿置于U3900熒光光譜儀中，設定激發波長為280nm，發射波長為332nm，每
0.2s采樣一次。用函數信號發生器對電極施加電場，兩級所施加的電場強度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5*3.0V/cm。由于蛋白結構(胰蛋白酶或牛血清白蛋白)中存在著偶極矩，在電場作用下發生變形和去折疊。這樣，蛋白質結構中的Trp殘基就會逐漸暴露在水介質中，致使熒光激發相對強度逐漸下降。記錄相對強度下降的數據，將熒光強度的數據對測量時間作圖得到蛋白質去折疊曲線。胰蛋白酶的去折疊曲線如附圖1所示。在0.5、1.0、
1.5,2.0,2.5和3.0V/cm強度電場作用下胰蛋白酶蛋白質相對熒光強度隨時間的變化。a區域表示施加電場前的熒光強度隨時間的變化山區域表示在電場作用下熒光強度隨時間的變化；c區表示電場中斷后熒光強度隨時間的變化。曲線的下降說明蛋白質逐漸去折疊，Trp隨之逐漸暴露在水環境中。
【權利要求】
1.利用靜電場誘發蛋白質構象變形和去折疊的方法；其特征在于如下步驟: 1)用版10?調節濃度范圍0.1?0.3^/1111的2-丙烯酰胺-2-甲基-1-丙烷磺酸、0.03?0.1^/1111的亞甲基雙丙烯酰胺和0.004?0.012^1^的過硫酸銨的磷酸鹽緩沖液，使溶液的酸堿度呈中性； 2)向體系中加入濃度0.004?0.0128/此的蛋白質，溶解后再加入2父10—4?4父10—4^1111的四甲基乙二錢； 3)將混合液置于石英比色皿中，插入一對鉑電極；15-=后溶液固化形成水凝膠，凝膠中埋藏著蛋白質分子；將比色皿置于熒光光譜儀中，設定激發波長為280=%發射波長為332歷； 4)用函數信號發生器對電極施加電場，測量電場作用下發射光譜強度隨時間的變化，表征蛋白質分子的形變和構象的去折疊。
2.如權利要求1所述的方法，其特征是蛋白質包括胰蛋白酶或牛血清白蛋白。
3.如權利要求1所述的方法，其特征是蛋白質被置于熒光檢測系統中，蛋白質結構中的色氨酸在波長為28011111的紫外光的激發下發射出波長為33211111的焚光；通過對332=111處熒光強度的測量對蛋白質去折疊的過程進行跟蹤監測。
4.如權利要求1所述的方法，其特征是所施加靜電場的強度為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和 3.07/01110
5.如權利要求1所述的方法，其特征是利用電場作用于蛋白質，蛋白質對電場刺激的響應幾乎沒有弛豫時間，適用于研宄蛋白質去折疊的前穩態過程。
【文檔編號】G01N21/64GK104502318SQ201410814619
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月25日 優先權日:2014年12月25日
【發明者】黃積濤, 王媞媞, 黃薇, 黃善然 申請人:南開大學