一種分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的方法
【專利摘要】一種分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的方法，除鐵后的土壤加入NaHCO3緩沖溶液形成土壤懸浮液，采用希瓦氏菌微生物對土壤懸浮液進行接種，加入乳酸鈉與無機鹽溶液分別作為微生物的碳源與無機營養源，通入氮氣保持厭氧狀態，密封后置于室溫下振蕩進行培養；在厭氧條件下采用氮川三乙酸根合鐵來分別氧化土壤懸浮液中總腐殖質和水溶性腐殖質，通過分析生成Fe2+的濃度分別測定土壤懸浮液中總腐殖質和水溶性腐殖質的微生物還原量；根據二者的差異來計算土壤原位腐殖質電子轉移能力。本發明提供的分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的方法不僅可以真實表征土壤原位腐殖質的電子轉移能力，誤差小，而且成本較低，容易操作，可批量式進行，效率高。
【專利說明】 一種分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物地球化學領域，具體涉及一種分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的方法。
【背景技術】
[0002]腐殖質是一類具有氧化還原性質的天然有機化合物，它在土壤中具有廣泛的分布。研宄表明，在還原條件下，溶解性的腐殖質即可作為電子受體，接受從微生物傳遞出的電子，同時還原后的腐殖質又可作為電子供體，將電子傳遞給鐵氧化物等礦物，而且其在接受電子或供給電子的過程中具有一定的可逆性，從而使其在許多生物地球化學的氧化還原過程中可以充當胞外電子穿梭體的角色，這在很大程度上對具備有氧化還原活性的有機和無機污染物的氧化還原動力學與降解途徑會產生深刻影響。
[0003]然而，目前用堿性溶液提取土壤腐殖質并非完全是一種非破壞性方法，導致提取純化后的腐殖質與土壤原位的腐殖質在化學結構上會存在一定差異，因此，提取純化后的、溶解性的腐殖質在許多理化性質上并不能真實的代表土壤原位的腐殖質。另外，土壤原位的腐殖質大部分是與粘土礦物相結合，粘土礦物可以穩定土壤腐殖質，而土壤腐殖質則可以通過架橋等作用將土壤礦物顆粒連接起來形成穩定的團聚體，尤其是在腐殖質含量較高的土壤中，幾乎所有的粘土礦物都是與腐殖質相互包裹在一起。正是土壤中粘土礦物的存在，使得腐殖質的許多官能團的活性降低，而且不同的官能團與粘土礦物之間的相互作用也存在較大差異，這些特征在提取純化后的、溶解性的腐殖質中都沒有得到體現。因此，為了更加深入認識土壤腐殖質氧化還原性質的環境效應，尋找一種可行的方法用于分析土壤原位腐殖質的電子轉移能力顯得十分必要。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的方法，以期為研宄土壤腐殖質氧化還原性質的環境效應提供技術支撐。
[0005]為了實現本發明的目的，本發明提供的分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的方法，包括如下步驟:
[0006]I) 土壤鮮樣中加入連二亞硫酸鈉-檸檬酸鈉-重碳酸鈉溶劑以提取土壤本底鐵，混合均勻后靜置，離心去除提取液；
[0007]2)在離心后的固體樣品加入NaHCO3緩沖溶液，使之形成土壤懸浮液；
[0008]3)采用富集培養后的異化鐵還原菌微生物對土壤懸浮液進行接種，并加入乳酸鈉試劑作為微生物的碳源，加入無機鹽作為微生物的無機營養液；
[0009]4)通入氮氣以保持厭氧狀態，密封置于振蕩培養箱中，室溫下振蕩培養；
[0010]5)取步驟4培養后的土壤懸浮液加入氮川三乙酸根合鐵溶液，通入氮氣以保持厭氧狀態，密封置于振蕩培養箱中，室溫下振蕩反應；取反應后的土壤懸浮液過纖維素濾膜后，加入鄰菲羅啉溶液，采用紫外-可見分光光度計測定波長510nm處的吸光度值，并基于標準曲線將吸光度值換算成Fe2+濃度A ;
[0011]6)取步驟4培養后的土壤懸浮液過纖維素濾膜后加入氮川三乙酸根合鐵溶液，通入氮氣以保持厭氧狀態，密封于室溫下靜置反應；取反應后的溶液加入鄰菲羅啉溶液，采用紫外-可見分光光度計測定波長510nm處的吸光度值，并基于標準曲線將吸光度值換算成Fe2+濃度B ；
[0012]7)基于以下公式計算出單位質量土壤所轉移的電子數量，并將其作為土壤原位腐殖質電子轉移能力ESCsh:
[0013]ESCsh (e7g 土壤)=[(A-B) X 25/1000] / [5 X (5/120) X (5/10)]
[0014]式中:
[0015]A是步驟5測得的吸光度值換算成的Fe2+濃度，單位是mmol/L ;
[0016]B是步驟6測得的吸光度值換算成的Fe2+濃度，單位是mmol/L。
[0017]所述的方法，其中，步驟I中的土壤鮮樣是指經過挑除植物殘體后的土壤樣品。
[0018]所述的方法，其中，步驟3中的異化鐵還原菌微生物菌種為希瓦氏菌微生物MR-1，其富集培養采用LB培養基，培養時間為12h ;LB培養基具體成分與濃度如下:蛋白胨10g，NaCl 5g，酵母膏10g，蒸飽水1000ml，pH7.2 ;pH采用lmol/L的NaOH溶液進行調節;LB培養基配置后先在121°C條件下滅菌30min。
[0019]所述的方法，其中，步驟3中，乳酸鈉最終濃度為lmmol/L，無機營養液的成分與最終濃度如下:
[0020]NH4Cl 1500mg/L、NaH2P04600mg/L、CaCl2.2Η20 100mg/L、KCl lOOmg/L,MgCl2.6Η202mg/L、MnCl2.4H20 5mg/L、NaMoO4.2H20 lmg/L。
[0021]所述的方法，其中，步驟5與6中的纖維素濾膜為0.22 μπι纖維素濾膜。
[0022]所述的方法，其中，步驟5與6中標準曲線的溶液采用FeSO4.7Η20。
[0023]本發明提供的分析土壤原位腐殖質的電子轉移能力的方法，不僅可以真實表征土壤原位腐殖質的電子轉移能力，誤差小，而且成本較低，容易操作，可批量式進行，效率高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的流程示意圖。
[0025]圖2為水稻田土壤、果園土壤與草甸土壤原位腐殖質的電子轉移能力示意圖。
具體實施方案
[0026]以下結合附圖和實施例進一步說明本發明。
[0027]請參閱圖1。本發明提供的分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的方法，具體步驟包括:
[0028]I) 土壤鮮樣采集:選取三種土壤類型:水稻田土壤、果園土壤與草甸土壤，三種土壤類型均是采集0-20cm的表層樣品。
[0029]2) 土壤鮮樣預處理:將土壤樣品進行機械壓碎，并挑除肉眼可見的植物殘體等雜質，備用。
[0030]3) 土壤本底鐵的去除
[0031]稱取經過預處理的5g 土壤鮮樣于離心管中，加入50ml的連二亞硫酸鈉-檸檬酸鈉-重碳酸鈉溶劑(lmol/L)，混合均勾后靜置lh，在4000r/min轉速下離心lOmin，去除提取液。
[0032]2) 土壤懸浮液的配置
[0033]將離心后的固體樣品轉入150ml的棕色厭氧瓶中，并加入100mlNaHC031沖溶液(30mmol/L, pH = 7)，使之形成土壤懸浮液。
[0034]3)希瓦氏菌微生物MR-1的富集培養
[0035]采用LB培養基，富集培養時間為12h ；LB培養基其具體成分與濃度如下:蛋白胨10g, NaCl 5g，酵母膏10g，蒸飽水1000ml，ρΗ7.2 ;ρΗ采用lmol/L的NaOH溶液進行調節；LB培養基配置后需要預先在121°C條件下滅菌30min。
[0036]4)微生物接種與營養物質的配置
[0037]采用富集培養后的MR-1對土壤懸浮液進行接種，并加入乳酸鈉試劑作為微生物的碳源，加入各種無機鹽作為微生物的無機營養源，最終定容體積為120ml，MR-1菌體最終濃度為108cells/mL，乳酸鈉最終濃度為lmmol/L，無機營養液的成分與最終濃度如下:NH4Cl 1500mg/L、NaH2PO4 600mg/L、CaCl2.2H20 100mg/L、KCl 100mg/L、MgCl2.6H20 2mg/UMnCl2.4H20 5mg/L、NaMoO4.2H20 lmg/L。
[0038]5) 土壤懸浮液中腐殖質的微生物還原
[0039]往添加有微生物菌體和營養物質的土壤懸浮液中持續通入高純氮氣40min以保持厭氧狀態，密封，然后置于振蕩培養箱中，在25°C和振蕩速度150r/min的條件下進行培養48h，以充分還原土壤腐殖質。
[0040]6) 土壤懸浮液中總腐殖質微生物還原量的測定
[0041]采用Fe3+還原法測定土壤懸浮液中總腐殖質微生物還原量，具體步驟如下:取培養后的土壤懸浮液5ml于50ml的棕色厭氧瓶中，加入5ml氮川三乙酸根合鐵(Fe3+-NTA)溶液(5mmol/L)，持續通入高純氮氣30min以保持厭氧狀態，密封，置于振蕩培養箱中，在溫度25°C和振蕩速度150r/min的條件下反應18h，取5ml反應后的土壤懸浮液，過0.22 μ m纖維素濾膜后，加入5ml鄰菲羅啉溶液(lg/L)，定容至25ml，搖勻，靜置反應30min后，立即采用紫外-可見分光光度計測定波長510nm處的吸光度值，并基于標準曲線將吸光度值換算成Fe3+濃度 A (mmol /I,)。
[0042]7) 土壤懸浮液中水溶性腐殖質微生物還原量的測定
[0043]采用Fe3+還原法測定土壤懸浮液中水溶性腐殖質微生物還原量，具體步驟如下:取培養后的土壤懸浮液5ml，過0.22 μπι纖維素濾膜后，加入5ml氮川三乙酸根合鐵(Fe3+-NTA)溶液(5mmol/L)，持續通入高純氮氣30min以保持厭氧狀態，密封，在溫度25°C條件下靜置反應18h，取5ml反應后的溶液，加入5ml鄰菲羅啉溶液(lg/L)，定容至25ml，搖勻，靜置反應30min后，立即采用紫外-可見分光光度計測定波長510nm處的吸光度值，并基于標準曲線將吸光度值換算成Fe (II)濃度B (mmol/L)。
[0044]8) 土壤原位腐殖質電子轉移能力的計算
[0045]基于以下公式計算出單位質量土壤所轉移的電子數量，并將其作為土壤原位腐殖質電子轉移能力ESCsh:
[0046]ESCsh (e7g 土壤)=[(A-B) X 25/1000] / [5 X (5/120) X (5/10)]
[0047]式中:
[0048]A是步驟6測得的吸光度值換算成的Fe2+濃度，單位是mmol/L ;
[0049]B是步驟7測得的吸光度值換算成的Fe2+濃度，單位是mmol/L。
[0050]土壤原位腐殖質電子轉移能力的分析:
[0051]基于圖1的分析流程，分析得出三種類型土壤樣品的原位腐殖質電子轉移能力ESCsh，結果如圖2所示。
[0052]結果分析:從圖2中可以看出，水稻田土壤、果園土壤與草甸土壤在原位腐殖質電子轉移能力上存在顯著差異，這主要是由不同類型土壤之間土壤結構性質的差異、腐殖質化學結構的不同以及腐殖質與礦物相互作用方式的不同所導致的，表明本發明提供的分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的方法在區分不同類型土壤之間原位腐殖質電子轉移能力的差異方面是可行的。對于同一類型土壤樣品，采用本發明提供的分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的方法重復測定三次，結果發現三次之間平行性較好(如圖2所示)，說明本發明提供的分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的方法誤差較小，具有很好的重現性。
【權利要求】
1.一種分析土壤原位腐殖質電子轉移能力的方法，包括如下步驟: 1)土壤鮮樣中加入連二亞硫酸鈉-檸檬酸鈉-重碳酸鈉溶劑以提取土壤本底鐵，混合均勻后靜置，離心去除提取液； 2)在離心后的固體樣品加入NaHC031沖溶液，使之形成土壤懸浮液； 3)采用富集培養后的異化鐵還原菌微生物對土壤懸浮液進行接種，并加入乳酸鈉試劑作為微生物的碳源，加入無機鹽作為微生物的無機營養液； 4)通入氮氣以保持厭氧狀態，密封置于振蕩培養箱中，室溫下振蕩培養； 5)取步驟4培養后的土壤懸浮液加入氮川三乙酸根合鐵溶液，通入氮氣以保持厭氧狀態，密封置于振蕩培養箱中，室溫下振蕩反應；取反應后的土壤懸浮液過纖維素濾膜后，加入鄰菲羅啉溶液，采用紫外-可見分光光度計測定波長510nm處的吸光度值，并基于標準曲線將吸光度值換算成Fe2+濃度A ； 6)取步驟4培養后的土壤懸浮液過纖維素濾膜后加入氮川三乙酸根合鐵溶液，通入氮氣以保持厭氧狀態，密封于室溫下靜置反應；取反應后的溶液加入鄰菲羅啉溶液，采用紫外-可見分光光度計測定波長510nm處的吸光度值，并基于標準曲線將吸光度值換算成Fe2+濃度B ; 7)基于以下公式計算出單位質量土壤所轉移的電子數量，并將其作為土壤原位腐殖質電子轉移能力ESCsh:
ESCsh (e7g 土壤)=[(A-B) X 25/1000] / [5 X (5/120) X (5/10)] 式中: A是步驟5測得的吸光度值換算成的Fe (II)濃度，單位是mmol/L ; B是步驟6測得的吸光度值換算成的Fe (II)濃度，單位是mmol/L。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟I中的土壤鮮樣是指經過挑除植物殘體后的土壤樣品。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟3中的異化鐵還原菌微生物菌種為希瓦氏菌微生物MR-1，其富集培養采用LB培養基，培養時間為12h ;LB培養基具體成分與濃度如下:蛋白胨10g, NaCl 5g，酵母膏10g，蒸飽水1000ml，ρΗ7.2 ;ρΗ采用lmol/L的NaOH溶液進行調節；LB培養基配置后先在121°C條件下滅菌30min。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟3中，乳酸鈉最終濃度為lmmol/L，無機營養液的成分與最終濃度如下:
NH4Cl 1500mg/L、NaH2P04600mg/L、CaCl2.2Η20 100mg/L、KCl100mg/L、MgCl2.6Η20 2mg/UMnCl2.4H20 5mg/L、NaMoO4.2H20 lmg/L。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟5與6中的纖維素濾膜為0.22 μ m纖維素濾膜。
6.根據權利要求1所述的方法，其中，步驟5與6中標準曲線的溶液采用FeSO4.7Η20。
【文檔編號】G01N21/31GK104458624SQ201410804534
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月19日 優先權日:2014年12月19日
【發明者】檀文炳, 何小松, 席北斗, 高如泰, 袁英, 崔東宇 申請人:中國環境科學研究院