纖維結合蛋白檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種纖維結合蛋白檢測試劑盒，包括試劑R1和試劑R2，所述試劑R1為含有抗人類風濕因子抗體和促凝劑的緩沖液；所述試劑R2為含有標記抗人纖維結合蛋白抗體的膠乳顆粒的緩沖液；所述抗人類風濕因子抗體是含有功能部位的完整抗體或抗體片段，為兔抗人多克隆抗體或羊抗人多克隆抗體或單克隆抗體；本發明纖維結合蛋白檢測試劑盒可以同時滿足靈敏度高和自動化快速批量檢測的要求，抗干擾能力強，穩定性高，且抗體的用量小，降低了成本。
【專利說明】纖維結合蛋白檢測試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥【技術領域】，具體地說涉及一種纖維結合蛋白檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 纖維結合蛋白又稱纖維連接蛋白（簡稱纖連蛋白）、粘連蛋白、纖粘蛋白，英文名 fibronectin，英文縮寫Fn。纖維結合蛋白是一種高分子量糖蛋白，含糖4. 5% - 9. 5%，其 單體相對分子質量為22萬一 25萬。各亞單位在C端形成二硫鍵交聯。血漿纖連蛋白多是 二聚體，由兩條相似的A鏈及B鏈組成，整個分子呈V形。細胞中纖連蛋白以多聚體為主， 成纖維細胞中尤甚。纖維結合蛋白有可溶性與不溶性兩種形式。血漿中纖維結合蛋白為可 溶性的，電泳時移動于α2或快β區。主要由肝細胞、內皮細胞和巨噬細胞合成。不溶性 的纖維結合蛋白廣泛存在于結締組織、組織基質、血管基質和細胞表面，與可溶性纖維結合 蛋白的分子結構、抗原特性等基本相同。
[0003] 纖維結合蛋白的功能非常復雜，主要功能是介導細胞粘著。純化的纖連蛋白可增 強細胞間粘連及細胞與基質的粘連。通過粘著，纖連蛋白可以通過細胞信號轉導途徑調節 細胞的形狀和細胞骨架的組織，促進細胞鋪展。在胚胎發生過程中，纖連蛋白對于許多類型 細胞的迀移和分化是必需的；目前已知纖維結合蛋白與細胞之間的粘附、細胞的迀移和趨 化有關，因而在對抗炎癥、組織修復和創傷愈合方面發揮作用。纖維結合蛋白有很強的促進 單核巨噬細胞吞噬功能的作用，具有非特異性的調理素活性，在抗感染、清除免疫復合物、 促使腫瘤基因轉化等方面都有重要意義。纖維結合蛋白存在于血小板的α顆粒中，凝血酶 和膠原可使血小板釋放纖維結合蛋白，并分泌到血小板表面。在血凝塊形成過程中，纖連蛋 白促進血小板附著于血管受損部位。在血管內皮損傷、膠原暴露時，Fn可以調整纖維蛋白 與膠原之間的關系，加速清除纖維蛋白及其降解產物，維護凝血纖溶的動態平衡，具有抗血 栓作用。
[0004] 正常人血漿纖維結合蛋白PFn含量300?400mg/L (0. 3?0. 4g/L)，血清含量約為 血漿含量的67%，一般為180?280mg/L，是因為血凝過程中纖維結合蛋白與纖維蛋白結合 之故。纖維結合蛋白含量變化與臨床多種疾病的嚴重程度和轉歸密切相關。血清纖維結合 蛋白降低見于多種嚴重疾病，纖維結合蛋白持續低值者提示預后不良，纖維結合蛋白回升 者提示預后較好。傳染性肝炎患者纖維結合蛋白值的變化與疾病的病期有關，活動期纖維 結合蛋白含量下降，在急性肝炎、重癥肝炎，失代償性肝硬化、肝癌尤其是廣泛性肝轉移者， 纖維結合蛋白含量顯著降低。纖維結合蛋白值作為評價營養狀態的指標優于白蛋白、前白 蛋白、轉鐵蛋白等的測定。測定胸腹水中纖維結合蛋白含量對鑒別滲出液和漏出液較有意 義，結核、結締組織疾病患者胸水纖維結合蛋白含量明顯高于腫瘤患者。腫瘤性積液纖維結 合蛋白含量又高于其他傳染性和非特異性積液。類風濕性關節炎時，血漿纖維結合蛋白可 正常，但病變關節液中纖維結合蛋白含量常數倍于血漿濃度。
[0005] 目前臨床上廣泛使用的纖維結合蛋白檢測方法是ELISA法和普通免疫比濁法。 ELISA法靈敏度較高，但存在其操作復雜，檢測時間長等缺點。普通免疫比濁法檢測方法由 于采用多克隆抗體直接比濁，可配合自動生化儀檢測，檢測速度快，操作方便，但存在抗體 用量大，成本高，而且靈敏度較低的問題。而現有的纖維連接蛋白測定試劑盒，多為單一試 劑，存在靈敏度低，試劑不穩定，抗類風濕因子干擾能力差等問題。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的問題是針對現有技術的不足，提供一種具有高靈敏度，抗干擾 能力強、穩定性好的纖維結合蛋白檢測試劑盒。
[0007] 本發明所采用的技術方案為：一種纖維結合蛋白檢測試劑盒，包括試劑Rl和試劑 R2,其特征在于：所述試劑Rl為含有抗人類風濕因子抗體和促凝劑的緩沖液；所述試劑R2 為含有標記抗人纖維結合蛋白抗體的膠乳顆粒的緩沖液。
[0008] 所述抗人類風濕因子抗體是含有功能部位的完整抗體或抗體片段，為兔抗人多克 隆抗體或羊抗人多克隆抗體或單克隆抗體。
[0009] 作為優選，所述抗人纖維結合蛋白抗體是含有功能部位的完整抗體或抗體片段， 為兔抗人多克隆抗體、羊抗人多克隆抗體或單克隆抗體中的一種。
[0010] 所述促凝劑為聚乙二醇（PEG)，聚乙烯吡咯烷酮（PVP)中的一種或兩種。
[0011] 所述膠乳顆粒為60?400nm的聚苯乙烯顆粒，優選100?200nm。
[0012] 作為優選，標記抗人纖維結合蛋白抗體的膠乳顆粒在試劑R2中的含量為0. 5? 5g/L，優選 1 ?3g/L。
[0013] 作為優選，所述試劑Rl組成為：所述試劑Rl組成為：50?200mmol/LTris-HCl 緩沖液，〇?30g/L聚乙二醇（PEG)，5?30g/L氯化鈉，0. 5?lg/L疊氮化鈉，0. 1?lg/L 抗人類風濕因子抗體。
[0014] 本發明試劑盒的反應原理是：
[0015] 先將含有抗人類風濕因子抗體、促凝劑及緩沖液的試劑Rl與樣本混合，使樣本中 的類風濕因子抗原與試劑Rl中的抗人類風濕因子抗體結合成抗原抗體復合物并凝集成大 顆粒，將類風濕因子抗原清除。再將含有包被了高特異性的抗人纖維結合蛋白抗體的膠乳 顆粒及緩沖液的試劑R2與上述樣本-試劑Rl混合液中相應的纖維結合蛋白抗原發生特異 性結合，在促凝劑的作用下，形成不溶性的以（抗原-抗體-膠乳顆粒-抗體）為聚合單位 的聚合度不等的復合物，產生一定的濁度，其濁度高低與樣本中的纖維結合蛋白抗原濃度 成正比關系，在一定波長下進行濁度測定，即可測得樣本中被檢測纖維結合蛋白的含量。
[0016] 本發明中，選取的檢測波長為340?800nm，優選540?600nm。
[0017] 采用本發明所述的試劑盒測定血清或血漿中纖維結合蛋白時，先將樣本與試劑Rl 混勻后孵育3-5分鐘，然后加入試劑R2,攪拌均勻后，立即讀取第一點吸光度值（Al)，計時 反應5分鐘后，讀取第二點吸光度值（A2)，計算兩點吸光度差值，根據校準曲線得到樣本中 纖維結合蛋白的含量。
[0018] 本發明采用5點定標法，以樣條函數或logit-log(4p)作為計算模式，繪制出校準 曲線。
[0019] 本發明所述的試劑盒，用于測定人血清或血漿中纖維結合蛋白，與現有技術相比， 本發明具有以下優點：采用了多克隆抗體致敏的膠乳增強免疫比濁檢測方法，可以同時滿 足靈敏度高和自動化快速批量檢測的要求，抗干擾能力強，，穩定性高，且抗體的用量小，降 低了成本。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1 :本發明纖維結合蛋白檢測試劑盒檢測血清纖維結合蛋白線性范圍。
[0021] 圖2 :本發明纖維結合蛋白檢測試劑盒檢測血清纖維結合蛋白與用于檢測血清中 纖維結合蛋白的現有進口試劑盒相關性。
【具體實施方式】
[0022] 下面用具體實施例對本發明做進一步詳細說明，但本發明不僅局限于以下具體實 施例。
[0023] 實施例1
[0024] 纖維結合蛋白檢測試劑盒的制備：
[0025] 試劑Rl:200mmol/LTris-HCl緩沖液，20g/L聚乙二醇（PEG)，20g/L氯化鈉，lg/L 疊氮化鈉，〇. 5g/L抗人類風濕因子抗體。
[0026] 試劑R2 :標記有抗人纖維結合蛋白多克隆抗體的膠乳顆粒的制備：將粒徑為 IOOnm的膠乳顆粒，用50mmol/LMES，pH6. 0緩沖液稀釋膠乳顆粒到3g/L，每ml溶液中加入 EDACO. 5mg，室溫反應1小時，20000rpm轉速下離心30min，去上清，將沉淀懸浮于50mmol/L MES，pH6. 0緩沖液中，超聲分散；再次20000rpm轉速下離心30min，去上清，將沉淀懸浮于 50mmol/LMES，pH6. 0緩沖液中，使得膠乳顆粒終濃度為6g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等體 積的含8mg/ml抗人纖維結合蛋白抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應2小時，膠乳顆粒 終濃度為3g/L。20000rpm轉速離心30min，去上清，沉淀懸浮于50mmol/LMES，pH6. 0緩沖 液中，膠乳顆粒終濃度為3g/L，超聲分散，加入BSA使得BSA最終濃度達到20g/L，4°C封閉 過夜。離心去上清，用含50mmol/LTris，pH7. 5緩沖液、10g/LBSA、20g/L鹿糖、lg/L疊氮 化鈉的分散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為3g/L，超聲分散。
[0027] 實施例2
[0028] 人血清樣本中纖維結合蛋白的測定：
[0029] 測定儀器：日立7060全自動生化分析儀；
[0030] 分析方法：兩點終點法；
[0031] 分析參數：Rl:240ul，R2:60ul，樣本：3ul;波長：546nm;
[0032] 測定步驟：先加入試劑Rl和樣本，于37°C孵育5分鐘后，加入試劑R2,立即讀取第 一點吸光度值，計時反應5分鐘后，讀取第二點吸光度值，計算兩點吸光度差值。
[0033] 定標曲線制作：以定標液濃度為橫坐標，各濃度定標液對應的吸光度差值為縱坐 標，做l〇git-log(4p)函數曲線。
[0034] 樣本濃度計算方法：根據樣本的吸光度值差值，代入定標曲線，計算相對應的濃度 值。
[0035] 實施例3
[0036] 試劑盒性能試驗：
[0037] (1)靈敏度試驗
[0038] 以水為空白樣本，選取一份低值血清樣本進行倍比稀釋，配制出不同濃度（0、5、 10、20、40mg/L)的樣本，每個樣本重復測定10次，計算均值和標準差，結果見表1，從表1可 見，本發明試劑盒的對血清纖維結合蛋白的檢測靈敏度為5mg/L。
[0039]表 1 [00401
【權利要求】
1. 一種纖維結合蛋白檢測試劑盒，包括試劑R1和試劑R2,其特征在于：所述試劑R1為 含有抗人類風濕因子抗體和促凝劑的緩沖液；所述試劑R2為含有標記抗人纖維結合蛋白 抗體的膠乳顆粒的緩沖液。
2. 根據權利要求1所述的纖維結合蛋白檢測試劑盒，其特征在于：所述抗人類風濕因 子抗體是含有功能部位的完整抗體或抗體片段，為兔抗人多克隆抗體或羊抗人多克隆抗體 或單克隆抗體。
3. 根據權利要求1所述的纖維結合蛋白檢測試劑盒，其特征在于：所述抗人纖維結合 蛋白抗體是含有功能部位的完整抗體或抗體片段，為兔抗人多克隆抗體、羊抗人多克隆抗 體或單克隆抗體中的一種。
4. 根據權利要求1所述的纖維結合蛋白檢測試劑盒，其特征在于：所述促凝劑為聚乙 二醇（PEG)，聚乙烯吡咯烷酮（PVP)中的一種或兩種。
5. 根據權利要求1所述的纖維結合蛋白檢測試劑盒，其特征在于：所述膠乳顆粒為 60?400nm的聚苯乙稀顆粒。
6. 根據權利要求5所述的纖維結合蛋白檢測試劑盒，其特征在于：所述膠乳顆粒為 100?200nm的聚苯乙烯顆粒。
7. 根據權利要求1所述的纖維結合蛋白檢測試劑盒，其特征在于：標記抗人纖維結合 蛋白抗體的膠乳顆粒在試劑R2中的含量為0. 5?5g/L。
8. 根據權利要求7所述的纖維結合蛋白檢測試劑盒，其特征在于：標記抗人纖維結合 蛋白抗體的膠乳顆粒在試劑R2中的含量為1?3g/L。
9. 根據權利要求1所述的纖維結合蛋白檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑R1組成 為：50 ?200mmol/L Tris-HCl 緩沖液，0 ?30g/L 聚乙二醇（PEG)，5 ?30g/L 氯化鈉，0? 5 ? lg/L疊氮化鈉，0. 1?lg/L抗人類風濕因子抗體。
【文檔編號】G01N33/53GK104483475SQ201410803868
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月22日 優先權日:2014年12月22日
【發明者】鄒炳德, 鄒繼華, 方亮, 劉獻文 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司