一種基于表面等離子體共振成像生物傳感器芯片的蛋白質固定方法
【專利摘要】本發明提供了一種基于表面等離子共振成像生物傳感器芯片的蛋白質固定方法，該方法通過建立用于蛋白質固定的模型，根據模型來優化芯片表面的化學修飾，控制活性位點之間的距離，從而能夠在表面等離子共振成像生物傳感器芯片上固定蛋白質。通過本發明的方法保證了蛋白質的單點固定，從而避免了因蛋白質被多點固定而導致的失活，并且通過表面等離子共振成像技術確認了通過此方法固定蛋白質能夠獲得優化的檢測信號。
【專利說明】-種基于表面等離子體共振成像生物傳感器巧片的蛋白質 固定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于蛋白質巧片陣列領域，設及一種基于表面等離子體共振成像生物傳感 器巧片的蛋白質固定方法。
【背景技術】
[0002] 在免疫檢測領域，包被抗體（一抗）的定向排列引起了廣泛的興趣和關注。在傳 統檢測中，包被抗體被動地吸附在基底（通常是熱塑性聚合物，例如聚苯己締）表面，使得 僅僅20?30%的包被抗體獲得了理想的取向而擁有檢測活性。在典型的免疫檢測中，對包 被抗體的非有效固定問題一直少有關注。通常包被抗體被過量地固定在固相表面，W保證 有足夠多的抗體吸附在表面時具有合適的取向，用W產生可靠的檢測信號。然而，當擴展到 微米或納米層面的應用時，固定在表面的抗體需要將一定濃度的化端暴露在外面來保證 獲得足夠的檢測信號，此時包被抗體錯誤的取向固定會產生更大的問題。直接取向固定包 被抗體是提升檢測性能的有效手段，據Wilson DS和Knock S報道，通過直接取向固定包被 抗體使信號提高可達10倍，該在微納米層面的應用中體現更為突出。將抗體固定在基底表 面有多種方法，包括吸附固定、共價固定和親和固定，對于取向固定抗體也有一些相應的技 術。目前，大多數直接固定抗體的工作主要集中在抗體化端的化學修飾W及其他化學修飾 方法，該些方法都可W提高固定抗體的有效活性。然而，特定基團固定的策略，尤其是由于 固定使抗體變性，或當抗體的Fab段由于固定的取向被埋藏，可能導致抗體生物活性的喪 失。
[0003] 對于商業化治療性抗體的質量控制來說，最好有一種無標記或者對抗體沒有預先 化學修飾的技術進行檢測。在該類案例當中，過去報道過的取向固定方法由于必須在固定 抗體之前進行化學改性，帶來一些不便。另一方面，隨機共價固定的方式對某些商業化的治 療性抗體有時也可能無效，原因是被固定的基團很有可能在抗體的結合位點附近，而且該 些抗體更有可能在表面上被多點固定，從而導致抗體失活。
[0004] 因此，在本領域需要開發一種能夠單點固定蛋白質并獲得較優化的檢測信號的蛋 白質固定方法。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種基于表面等離子體共振成像生 物傳感器巧片的蛋白質固定方法。
[0006] 為達到此發明目的，本發明采用W下技術方案：
[0007] 本發明提供一種基于表面等離子共振成像生物傳感器巧片的蛋白質固定方法，所 述方法包括W下步驟：
[000引 （1)建立用于蛋白質固定的模型；
[0009] (2)根據所述模型優化巧片表面的化學修飾；
[0010] (3)在巧片上固定蛋白質；
[0011] (4)利用表面等離子共振成像來檢測固定的蛋白質的信號。
[0012] 本發明所述基于表面等離子共振成像生物傳感器巧片的蛋白質固定方法中步驟 (1) 所述用于蛋白質固定的模型為：
[001 引 r 二！奪乎7^' ,
[0014] 其中1為硫醇直徑，r為活性末端之間的平均距離，町為活性末端硫醇溶液被同濃 度非活性末端硫醇溶液稀釋的倍數；
[0015] 所述用于蛋白質固定的模型的推導過程如下：
[0016] A = a*Dp (I)
[0017] 考慮a > I2并且代入式（I)得到：
[001 引 A = 12 蝴 F (II)
[0019] 考慮活性末端硫醇在有效區域的中屯、，有效區域假設為正方形，所Wr可W如下 計算：
[0020] r ? VI (阻）
[0021] 將式（II)代入式（III)得出所述模型，
[0022] 其中a為硫醇面積，A為平均一個活性末端硫醇分子所占的有效面積。
[0023] 本發明所述基于表面等離子共振成像生物傳感器巧片的蛋白質固定方法中步驟 (2) 所述優化巧片表面的化學修飾包括W下步驟：
[0024] (A)根據所述模型確定活性末端硫醇溶液被同濃度非活性末端硫醇溶液稀釋的倍 數町，
[002引做清洗巧片，氮氣吹干，放入等離子體清洗儀中清洗3分鐘；
[0026] (C)配制混合硫醇溶液；將活性末端硫醇溶液用同濃度非活性末端硫醇溶液稀釋 町倍，制成混合硫醇溶液；
[0027] 做將巧片浸入配制好的混合硫醇溶液中，4°C恒溫解育過夜，取出巧片，清洗巧片 表面，氮氣吹干，備用。
[002引本發明所述活性末端硫醇為一端帶有活性基團的有機硫醇化合物，活性末端可W 是駿基、醒基、酷基、環氧基、氯基、面代姪基、醋基等便于進行化學修飾的基團。在本發明中 所述活性末端硫醇與非活性末端硫醇是一對相互對應的概念，其中所述活性與非活性是相 對于硫醇末端進行化學修飾時要連接的物質而言的，例如，如果待連接的物質是蛋白質，貝U 硫醇末端可與蛋白質的氨基反應的定義為活性末端硫醇，硫醇末端不能與蛋白質的氨基反 應的定義為非活性末端硫醇，例如此時可將駿基末端硫醇稱為活性末端硫醇，而將燒氧基 末端硫醇稱為非活性末端硫醇；再如，對于復雜的巧片表面=維修飾，要在二維修飾基礎上 再次進行修飾，此時所利用的例如硫醇引發劑末端可能帶有面代姪基引發端，此時將面代 姪基末端硫醇稱為活性末端硫醇，而可利用不與修飾物基團反應的哲基末端硫醇為非活性 末端硫醇，但是如果待連接的物質是可W與哲基反應達到化學修飾目的時，哲基末端硫醇 則被稱為活性末端硫醇。
[0029] 在本發明中所述活性末端硫醇可W為但不限于駿基末端硫醇、醒基末端硫醇、酷 基末端硫醇、環氧基末端硫醇、面代姪基末端硫醇、氯基末端硫醇和醋基末端硫醇中的任意 一種；本發明所述非活性末端硫醇可w為但不限于燒基末端硫醇、燒氧基末端硫醇和哲基 末端硫醇中的任意一種。
[0030] 在本發明方法的步驟（2)所述優化巧片表面的化學修飾的步驟做和步驟做中 在氮氣吹干前所述清洗巧片獨立地為用己醇和去離子水交替清洗。
[0031] 本發明方法的步驟（2)所述優化巧片表面的化學修飾包括優化巧片表面的二維 化學修飾和/或=維化學修飾。巧片表面的二維化學修飾是指在巧片表面用直鏈化學修飾 物進行修飾，從而在巧片表面形成二維化學結構；所述=維化學修飾是指利用支化或超支 化化學修飾物（如支化或超支化聚合物）來修飾巧片表面，或者在巧片表面形成二維化學 結構之后，利用二維化學結構的活性末端再與支化或超支化化學修飾物反應，使表面形成 支化或超支化的=維化學結構。
[0032] 本發明所述基于表面等離子共振成像生物傳感器巧片的蛋白質固定方法中步驟 (3) 所述在巧片上固定蛋白質包括W下步驟：
[0033] (a)將表面化學修飾優化的巧片浸入巧片表面上活性末端的活化試劑的溶液中活 化；
[0034] 化）用去離子水清洗巧片，氮氣吹干，將目標蛋白質溶液在巧片表面打印形成蛋白 質陣列；
[003引 （C)用2%的牛血清白蛋白炬SA)的PBS溶液在室溫下封閉20分鐘，完成巧片上 蛋白質的固定。
[0036] 本發明所述在巧片上固定蛋白質的步驟（a)中所述巧片表面上活性末端的活化 試劑是指能夠使經修飾的巧片表面的活性末端活化的試劑，在本發明中該活化試劑可W根 據活性末端基團的不同選擇1- (3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亞胺鹽酸鹽巧DC) /N-哲基 班巧酷亞胺（N服H0. 4M/0. 1M)混合溶液或者N，N' -班巧酷亞胺基碳酸醋值SC)和4-二甲 氨基化晚值MAP)的二甲基甲酷胺值M巧溶液。
[0037] 在本發明所述在巧片上固定蛋白質的步驟化）中所述將目標蛋白質溶液在巧片 表面打印為手動點樣或利用蛋白質打印機進行。
[003引本發明所述在巧片上固定蛋白質不局限于在巧片上固定一種蛋白質，還可W在第 一種蛋白質固定之后，通過蛋白質與蛋白質之間的相互作用將第二種或兩種W上的其他蛋 白質固定在巧片上，例如，可W先將鏈霉親和素固定在巧片上，而后通過鏈霉親和素與生物 素標記蛋白之間的特異結合將生物素標記蛋白固定在巧片上。
[0039] 本發明所述基于表面等離子共振成像生物傳感器巧片的蛋白質固定方法中步驟 (4) 所述利用表面等離子體共振成像（SPRi)來檢測固定蛋白質的信號包括W下步驟：清洗 表面打印有蛋白質陣列的巧片，吹干后裝入表面等離子體共振成像儀，向系統中加入緩沖 溶液，調整光學位置W選定點樣點，待基線穩定之后，用重生液將巧片表面重生5次，通入 待檢測溶液，重生，依次通入校正液1和校正液2,檢測蛋白質的信號。
[0040] 在本發明所述利用表面等離子體共振成像來檢測固定的蛋白質的信號中所述 清洗為用PBS緩沖液和去離子水依次清洗；優選地，所述緩沖溶液為含0. 05 %吐溫20的 IxPBS，抑=7. 4 ;優選地，所述重生液為溶質磯酸與溶劑水的體積比為1:400的磯酸溶液； 優選地，所述待檢測溶液為能夠與所述巧片上固定的蛋白質發生相互作用而產生可檢測信 號的蛋白質溶液，例如當巧片上固定的蛋白質為抗體hR3或生物素標記蛋白時，檢測溶液 可W是EGFR溶液，當巧片上固定的蛋白質為Hi s標簽的抗體，檢測溶液可W是細胞裂解液 (全蛋白濃度）；優選地，所述校正液1為IxPBS，校正液2為2xPBS。
[0041] 本發明所述PBS是指磯酸鹽緩沖溶液，所述IxPBS的1L配方為；氯化鋼（化Cl) 8g， 氯化鐘化C1)0. 2g，磯酸氨二鋼（化2冊〇4)1.44肖，磯酸二氨鐘（皿2口〇4)〇. 24g;所述2xPBS的 溶質濃度為IxPBS中溶質濃度的2倍。
[0042] 在本發明所述基于表面等離子體共振成像生物傳感器巧片的蛋白質固定方法中 所述巧片W金或銀為基底。
[0043] 本發明提供了一種固定蛋白質的方法，簡單地說，可W通過控制活性位點之間的 距離，來控制抗體或者其他蛋白質被單點固定在表面，從而避免蛋白質被多點固定而導致 的失活，同時使得活性位點暴露在溶液中，即使被固定的基團在活性位點周圍，也能夠保證 獲得抗原與抗體相互作用的檢測信號。本發明在金或銀表面上實現了治療性抗體陣列的制 備，并利用表面等離子體共振成像技術對抗體進行了確認。
[0044] 本發明具有W下有益效果；本發明通過建立模型來優化巧片表面的化學修飾，從 而達到控制活性位點之間的距離，使得能夠在表面等離子體共振成像傳感器巧片上固定蛋 白質，保證了蛋白質的單點固定，從而避免了因蛋白質被多點固定而導致的失活，并且通過 表面等離子體共振成像技術確認了通過此方法固定蛋白質能夠獲得優化的檢測信號，因此 本發明方法在保證蛋白質被固定在表面的同時使得活性位點暴露在溶液中，即使被固定的 基團在活性位點周圍，也能夠保證獲得抗原與抗體相互作用的較高檢測信號。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0045] 圖1是本發明中用于蛋白質固定模型的建立過程圖。
[0046] 圖2是hR3抗體化端的賴氨酸（粗線標出）。
[0047] 圖3是利用表面等離子體成像檢測巧片上蛋白質得到的在不同硫醇稀釋倍數下 的信號強度隨時間的變化圖。
[0048] 圖4是利用表面等離子體成像檢測巧片上蛋白質得到的不同硫醇稀釋倍數下信 噪比的圖。
【具體實施方式】
[0049] 下面通過【具體實施方式】來進一步說明本發明的技術方案。本領域技術人員應該明 了，所述實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。
[00加]律立用于帝白質固定的橫巧并對橫巧講行輪證 [0化1] 模型的建立；
[0化2] 目的在于建立一個基于駿基/氨基偶聯共價固定蛋白的模型，該模型可W反映出 二維巧片表面駿基密度（距離）與兩種硫醇溶液混合比例的關系。在巧片表面，利用兩種 末端基團（駿基、燒氧基）的硫醇在金表面形成自組裝單分子層，其一，可W保護巧片表面， 起到抗非特異性吸附的作用；其二，可W提供末端基團（主要利用駿基），與抗體殘留氨基 反應，共價偶聯，將抗體固定在巧片表面。利用該模型，就可W相對精確地控制表面駿基的 密度（距離），避免因駿基過多導致的抗體被多點固定而失活的現象，又可W避免駿基過少 引起的抗體固定量不足，導致信號下降的現象。
[0053] 建立的模型（圖1)如下：
[0054] r 二 I *、而，
[0化5] 其中1為硫醇直徑，r為駿基末端之間的平均距離，町為駿基末端硫醇溶液被同濃 度燒氧基末端硫醇溶液稀釋的倍數；
[0056] 所述用于蛋白質固定的模型的推導過程如下；
[0化7] A = a*〇F (I)
[005引考慮a > I2并且代入式（I)得到：
[0059] A = 12 蝴 F (II)
[0060] 考慮駿基末端硫醇（活性末端硫醇）在有效區域的中屯、，有效區域假設為正方形 (如圖1所示），所Wr可W如下計算：
[00川 r : (III)
[006引將式（n)代入式（III)得出r二7 *
[0063] 其中a為硫醇面積，A為平均一個駿基末端硫醇分子所占的有效面積。
[0064] 對于需要提供動力學信息的研究來說，由于實驗過程中需要對樣品進行多次重 生，所W共價固定是最理想的一種方法。單克隆抗體的平均長度是15nm左右。對于精確固 定來說，當活性位點（即硫醇的活性末端）的間距r在15nmW上才能發揮固定抗體的活性。 r的值與硫醇稀釋倍數D湘關，由所建立的模型計算得出稀釋倍數D P與活性位點間距離r 的關系，如表1所不：
[0065] 表1稀釋倍數町與活性位點間距離r的關系
[0066]
【權利要求】
1. 一種基于表面等離子共振成像生物傳感器芯片的蛋白質固定方法，其特征在于，所 述方法包括以下步驟： (1) 建立用于蛋白質固定的模型； (2) 根據所述模型優化芯片表面的化學修飾； (3) 在芯片上固定蛋白質； (4) 利用表面等離子共振成像來檢測固定的蛋白質的信號。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述用于蛋白質固定的模型為：
其中1為硫醇直徑，r為活性末端之間的平均距離，DF為活性末端硫醇溶液被同濃度非 活性末端硫醇溶液稀釋的倍數； 所述用于蛋白質固定的模型的推導過程如下： A=a*DF (I) 考慮a~I2并且代入式⑴得到： A= 12*Df (II) 考慮活性末端硫醇在有效區域的中心，有效區域假設為正方形，所以r可以如下計算：
將式（II)代入式（III)得出所述模型， 其中a為硫醇面積，A為平均一個活性末端硫醇分子所占的有效面積。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟（2)所述優化芯片表面的化學修 飾包括以下步驟： (A) 根據所述模型確定活性末端硫醇溶液被同濃度非活性末端硫醇溶液稀釋的倍數 Df; (B) 清洗芯片，氮氣吹干，放入等離子體清洗儀中清洗3分鐘； (C) 配制混合硫醇溶液：將活性末端硫醇溶液用同濃度非活性末端硫醇溶液稀釋Df 倍，制成混合硫醇溶液； (D) 將芯片浸入配制好的混合硫醇溶液中，4°C恒溫孵育過夜，取出芯片，清洗芯片表 面，氮氣吹干，備用。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述活性末端硫醇為羧基末端硫醇、醛基 末端硫醇、酰基末端硫醇、環氧基末端硫醇、齒代烴基末端硫醇、氰基末端硫醇或酯基末端 硫醇中的任意一種； 優選地，所述非活性末端硫醇為燒基末端硫醇、燒氧基末端硫醇和輕基末端硫醇中的 任意一種； 優選地，步驟（B)和步驟（D)中在氮氣吹干前所述清洗芯片是用乙醇和去離子水交替 清洗。
5. 根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，步驟（2)所述優化芯片表面的 化學修飾包括優化芯片表面的二維化學修飾和/或三維化學修飾。
6. 根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述在芯片上固定蛋 白質包括以下步驟： (a) 將表面化學修飾優化的芯片浸入芯片表面上活性末端的活化試劑的溶液中進行活 化； (b) 用去離子水清洗芯片，氮氣吹干，將目標蛋白質溶液在芯片表面打印形成蛋白質陣 列； (c) 用2%的牛血清白蛋白的PBS溶液在室溫下封閉20分鐘，完成芯片上蛋白質的固 定。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（b)所述將目標蛋白質溶液在芯片表 面打印為手動點樣或利用蛋白質打印機進行打印。
8. 根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其特征在于，步驟（4)所述利用表面等離子 體共振成像來檢測固定的蛋白質的信號包括以下步驟： 清洗表面打印有蛋白質陣列的芯片，吹干后裝入表面等離子共振成像儀，向系統中加 入緩沖溶液，調整光學位置以選定點樣點，待基線穩定之后，用重生液將芯片表面重生5 次，通入待檢測溶液，重生，依次通入校正液1和校正液2,檢測蛋白質的信號。
9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述清洗為用PBS緩沖液和去離子水依次 清洗； 優選地，所述緩沖溶液為含0. 05 %吐溫20的lxPBS，pH= 7. 4 ; 優選地，所述重生液為溶質磷酸與溶劑水的體積比為1:400的磷酸溶液； 優選地，所述待檢測溶液為能夠與所述芯片上固定的蛋白質發生相互作用而產生可檢 測信號的蛋白質溶液； 優選地，所述校正液1為lxPBS，所述校正液2為2xPBS。
10. 根據權利要求1-9中任一項所述的方法，其特征在于，所述芯片以金或銀為基底。
【文檔編號】G01N21/55GK104502311SQ201410778164
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月15日 優先權日:2014年12月15日
【發明者】朱勁松, 巴蒂斯塔· 佩雷斯 哈維爾·, 楊墨, 迪彭德拉·特亞吉, 埃內斯托·莫雷諾, 洛尼·卡爾沃, 程志強, 李少鵬, 周文菲 申請人:國家納米科學中心