一種檢測黃曲霉毒素m1的磁性免疫層析試劑盒及制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測黃曲霉毒素M1的磁性免疫層析試劑盒，包括至少一個試紙條和一個超順磁性復合粒子標記AFM1抗體溶液；所述試紙條由反應墊、樣品墊1、樣品墊2、吸水墊依次相互交錯粘在底板上并覆蓋透明塑料膜組裝而成；其中反應墊上預包被有AFM1蛋白偶聯物的檢測線和預包被了可與AFM1抗體結合的抗抗體的質控線；所述超順磁性復合粒子標記AFM1抗體為AFM1抗體和超順磁性復合粒子以肽鍵共價結合形成的聚合體。本發明還涉及本發明試劑盒的制備方法及其用于檢測乳及乳品中黃曲霉毒素M1的用途。本發明以磁性顆粒為標記物引入免疫層析技術中，檢測快速、操作簡便、線性范圍廣、靈敏度高。
【專利說明】-種檢測黃曲霉毒素M1的磁性免疫層析試劑盒及制備方 法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于食品檢測領域。具體而言，本發明設及一種檢測黃曲霉毒素Ml的磁性 免疫層析試劑盒、其制備方法W及該試劑盒用于檢測黃曲霉毒素Ml的用途。
【背景技術】
[0002] 黃曲霉毒素主要是由黃曲霉菌（Aspergillus flavs)、寄生曲霉菌（Aspergillus parasiti州S)和集蜂曲霉（Aspergillus nonius)產生的一組高毒和強致癌的次生代謝產 物。黃曲霉毒素MUAflatoxin MLAFM1)是哺乳動物攝入被黃曲霉毒素BUAflatoxin B1， AFB1)污染的食品或飼料之后，在體內肝微粒體單氧化酶的催化下，通過細胞色素P450的 調節作用，末端快喃環C-10被哲基化而生成。由于其主要存在于人類尤其是更容易受到 毒素損害的嬰幼兒的日常消費品乳制品中，AFM1的污染問題引起了社會的廣泛關注。2002 年，AFM1致癌的等級已被國際癌癥研究機構定為一類致癌物。
[0003] 目前AFM1檢測技術主要包括儀器分析法與免疫分析技術。儀器分析法有高效液 相色譜巧光檢測法，高效液相色譜-質譜聯用法。該些分析方法具有較高的靈敏度和特異 性，但是需要復雜的提取凈化步驟和較貴重復雜的儀器，樣品處理繁瑣費時，成本高，而且 需要有經過專口訓練的專業人員來操作復雜的儀器設備。免疫分析技術主要有酶聯免疫吸 附法和免疫層析技術。酶聯免疫吸附法巧LISA)在AFM1檢測中已經廣泛應用，但是存在操 作程序復雜，容易出現假陽性的結果。免疫層析技術是基于抗體抗原相互結合原理的一種 色譜分析技術，興起于上世紀九十年代，實驗操作簡單，僅需加樣一個步驟，反應迅速。目前 應用的標記物主要有膠體金顆粒。膠體金顆粒可使檢測線區域顯示一定的顏色，從而實現 特異性的檢測。但由于結果通常是人眼目測觀察，容易受到觀察者主觀判斷的影響，靈敏度 較低，結果準確度不高。
[0004] 磁性免疫層析技術（Ma即etic ImmunoQiromatographic Test, MICT)是近年來出 現的一種定量檢測技術，它W超順磁微粒代替膠體金標記物來進行免疫層析，通過檢測結 合在超順磁微粒上的目標物來提供對生物樣品的定量檢測數據。該技術與傳統技術相比具 有W下優勢：靈敏度較目測法高10-1000倍；測量結果可在至少4個數量級的范圍內呈線 性；檢測儀器體積小，尺寸僅書本大小；標記物磁微粒由聚合物包被，不隨時間而衰變，分 析結果可存檔并重新檢測。該技術彌補了傳統免疫層析技術靈敏度低，只定性不能定量的 缺點，代表了當前食品檢測技術的發展方向。
[0005] 本發明目的是將磁性免疫層析技術應用在AFM1分析中，簡化操作步驟，縮短檢測 時間，提局檢測靈敏度。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的之一是提供一種檢測黃曲霉毒素Ml的磁性免疫層析試劑盒。所述 試劑盒包括至少一個本發明的試紙條和一種超順磁性復合粒子標記AFM1抗體溶液。
[0007] 所述試紙條由反應墊、樣品墊、吸水墊依次相互交錯地，例如相互交錯2mm，粘在底 板上并在上層覆蓋透明塑料膜組裝而成，所述樣品墊1與樣品墊2連接，反應墊一端連接樣 品墊2,另一端與吸水墊相連。所述硝酸纖維素膜預包被有相互分離的檢測線和質控線，所 述檢測線含有AFM1抗原，所述質控線含有能與所述AFM1抗體特異性結合的抗抗體。
[000引所述反應墊為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜的長度可W為25mm-35mm，例如為 35mm0
[0009] 所述AFM1抗體為AFM1單克隆抗體或AFM1多克隆抗體，優選為AFM1單克隆抗體。
[0010] 所述AFM1抗原為AFM1半抗原與載體蛋白的偶聯物，所述AFM1半抗原為AFM1，所 述載體蛋白為牛血清白蛋白炬SA)或人血清蛋白或鑰孔血藍蛋白化LH)或卵清蛋白，優選 為 BSA。
[0011] 所述AFM1抗體特異性結合的抗抗體為羊抗鼠IgG抗體或兔抗鼠IgG抗體，優選為 羊抗鼠IgG抗體。
[0012] 所述樣品墊1為纖維素膜或玻璃纖維膜或玻璃纖維與纖維素的混合膜。
[0013] 所述樣品墊2為經樣品墊處理液預處理的纖維素膜或玻璃纖維膜或玻璃纖維 與纖維素的混合膜。所述樣品墊處理溶液例如為含有0.5% -2% BSA，1 % -5%庶糖， 0. 5% -3% 曲拉通 X-100 的 0. 01M PBS，抑7. 0-7. 6。
[0014] 所述吸水墊為纖維素膜。
[0015] 所述超順磁性復合粒子標記AFM1抗體溶液為AFM1抗體與超順磁性復合粒子W膚 鍵共價結合形成的聚合體溶解在保存液中形成的溶液。所述保存液例如為1% BSA，0. 5% 1訊6611-20,5%庶糖的9服.5的棚酸緩沖液。
[0016] 所述超順磁性復合粒子為化3〇4納米粒子，粒徑為50-300皿，優選為100-200皿。 所述超順磁性復合粒子表面帶有易于與AFM1抗體偶聯的基團，該些基團可W是駿基、氨基 等基團，優選的基團是駿基基團。
[0017] 本發明還設及用于制備本發明的檢測黃曲霉毒素Ml的磁性免疫層析試劑盒的制 備方法，包括W下步驟：
[001引 I.超順磁性復合粒子標記AFM1抗體的制備；
[0019] (1)將超順磁性復合粒子、1-己基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺巧DC)、N-哲 基了二酷亞胺（N服）和濃度例如為0. lM、pH = 4. 7的2-(N-嗎啡咐）己橫酸（ME巧緩沖液 混勻，EDC與N服的摩爾比為1 : 2,在37°C下反應大約30min，得到活化的磁性粒子；
[0020] 似將步驟（1)得到的活化的磁性粒子、AFM1抗體和濃度為50mM抑=8. 5的棚 酸緩沖液混勻，37°C反應化，得到偶聯后磁性粒子反應液；（3)向步驟（2)中的反應液加入 含有BSA的例如50mM抑=8. 5的棚酸緩沖液，使BSA終濃度為5%，在37°C下反應30min， 得到含有封閉后磁性粒子的反應液；再將封閉后的磁性粒子進行洗漆、保存，得到超順磁性 復合粒子標記AFM1抗體；所述洗漆液為50mM抑=8. 5的棚酸緩沖液，所述保存液為1% BSA，0. 5% Tween-20,5%庶糖的抑8. 5的棚酸緩沖液；
[002U II.反應墊的處理：用例如含有1% -2% BSA的0. 01M PBS、抑7. 0-7. 6的包被緩 沖液將AFM1抗原及抗抗體分別稀釋至例如0. l-2mg/血的濃度，并通過定量噴液裝置例如 W 0. 8-1. 5 y L/cm的量分別將二者噴到硝酸纖維素膜上，分別形成檢測線和質控線，AFM1 抗原與抗體的間隔（即檢測線和質控線之間的間隔）在0.5-lcm之間，噴完后驚干，放入干 燥器中備用；
[0022] III.樣品墊2的處理：將樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡例如大約0. 5-2小時 后取出，在大約25°C -35°C烘干大約6-12小時；
[0023] 其中所述樣品墊處理溶液例如為含有大約0.5% -2 % BSA，1 % -5 %庶糖， 0. 5% -3% 曲拉通 X-100 的 0. 01M PBS，抑7. 0-7. 6。
[0024] IV.試紙條的組裝：將反應墊、樣品墊、吸水墊依次相互交錯例如2mm粘在含有不 干膠的底板上并在上層覆蓋透明塑料膜，得到試紙板，并切割成寬度為例如3-5mm的試紙 條。
[0025] 本發明進一步設及根據本發明磁性免疫層析試劑盒用于檢測AFM1的用途，所述 試劑盒可W用于檢測乳及乳制品，例如牛奶、奶粉等中的AFM1。
[0026] 在實際應用中，將本發明試劑盒中偶聯有AFM1抗體的磁顆粒與樣品液混合，施加 于試紙條上，按免疫層析原理對樣品進行檢測，結合讀磁儀進行檢測，即可完成快速定量檢 巧。，操作簡單，方便實用。
[0027] 本發明的試劑盒是利用競爭法原理定量檢測樣品中的AFM1，當待測樣品中含有 AFM1時，樣品中的AFM1競爭地與免疫磁微粒上的AFM1抗體結合，從而抑制免疫磁微粒上的 AFM1抗體與檢測線上的AFM1抗原結合，因此結合在檢測線上的免疫磁微粒較少；當待測樣 品中不含有AFM1時，隨著層析作用的進行，免疫磁微粒移動到檢測線位置，免疫磁微粒上 的AFM1抗體與檢測線上的AFM1抗原相結合并聚集于此；無論樣品中是否含有AFM1，未結 合在檢測線上的免疫磁微粒隨著層析作用最終前行到質控線上，抗抗體與磁微粒上的AFM1 抗體結合并聚集。整個反應在30分鐘內進行完全，一般在反應20分鐘后即可讀磁儀進行 檢測，檢測線與質控線都會產生磁性響應，計算檢測線與質控線的比值，根據預設的標準曲 線，對樣品進行定量。
[002引本發明W磁性顆粒為標記物引入免疫層析技術中，較W光學檢測原理為基礎的免 疫層析技術具有更高的檢測靈敏度。因為光學原理測定易受雜質干擾，且只能檢測表面 10%的信號標記物，而90 %的信號標記物無法測定，而磁性測定具有穿透性，可測定100% 的信號標記物，抗干擾能力強。
[0029] 在本發明中，若無特別說明，所用的百分比含量為質量百分比。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030] 圖1所示為本發明所述檢測AFM1的磁性免疫層析試劑盒中的試紙條。
[0031] 圖2所示為AFM1標準曲線圖。
[00對 附圖標記說明：
[003引 1-樣品墊1 ;2-樣品墊2 ;3-反應墊；4-吸水墊；5-檢測線；6-質控線。
【具體實施方式】
[0034] 為了更好的理解本發明，下面結合具體的實施例對本發明做進一步詳細的說明， 但是本發明保護的范圍不限制于實施例所表示的范圍。本發明實施例中使用的試劑均可市 場購得。
[0035] 實施例1 ;制備本發明的試劑盒
[0036] I、試紙條的制備；
[0037] (1)反應墊的處理；用包被緩沖液（含2% BSA的0. 01M PBS溶液，抑為7. 2,過 0. 22ym濾膜）將AFM1-BSA (美國Sigma-Al化ich公司，產品號A6412)稀釋為0. 5mg/mL，羊 抗鼠IgG抗體（上海杰一生物技術有限公司，產品號JY-QT03)稀釋為Img/mU使用Biodot 公司XYZ3060噴膜機的Bio jet噴頭W 1 y L/cm的量將二者W 0. 8cm的間隔噴涂于硝酸纖 維素膜上，37 °C驚干后，加入干燥劑封存備用。
[0038] (2)樣品墊2的處理；樣品墊處理液為含有3%酪蛋白和0. 1% Tween-20的0. 01M pH7. 2的PBS緩沖液。將1cm寬的樣品墊放入適量樣品墊處理液中浸泡1小時后取出，30°C 烘干8小時備用。
[0039] (3)磁免疫層析試紙條的組裝與切割
[0040] 試紙板的組裝：將35mm寬的反應墊，25mm寬的吸水墊，10mm寬的樣品墊粘貼在透 明塑料底板上，上層蓋上透明塑料膜，組成試紙板。
[0041] 試紙條的裁切：使用上海金標生物科技有限公司ZQ2000切條機將上述試紙板切 成5mm寬的試紙條。
[0042] 將切割好的5mm寬的試紙條放入塑料底卡的卡槽內，蓋上上蓋，利用壓卡機（美國 Quantum Design公司，產品號4094-497-01)將上下兩片塑料卡壓緊，確保整個試紙條處于 結月緊狀態。加入干燥劑室溫下封存備用。
[0043] II、超順磁性復合粒子標記AFM1抗體溶液的制備：
[0044] 將2. 5mg粒徑為200nm的超順磁性復合粒子（美國如antum Design公司，產品號 100001)、0. 96mg 1-己基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺巧DC，美國化ermo公司，產品號 22980)、1. 15mg N-哲基了二酷亞胺（N服，美國Thermo公司，產品號24500)和1血濃度為 0. 1M抑=4. 7的2-(N-嗎啡咐）己橫酸（MES，美國Sigma-Al化ich公司，產品號M3671)緩 沖液（稱取1. 〇66g MES，0. 45g化C1溶于50血純水，調抑至4. 7)混勻，37°C反應30min， 得到活化后磁性粒子；
[0045] 用磁鐵吸附磁微粒，棄上層清液，并用上述MES緩沖液洗漆兩次；再加入0. 8血的 P服.5、濃度為50mM的棚酸緩沖液和0. 2mg AFM1單克隆抗體（北京市理化分析測試中屯、， 1B6)，37°C 反應化；
[0046] 向上述反應液中加入含有BSA(美國Sigma-Al化ich公司，產品號A4612)的50mM 抑=8. 5的棚酸緩沖液，使BSA終濃度為5%，37°C反應30min，得到含有封閉后的磁性粒子 的反應液；用磁鐵吸附磁微粒，棄上層清液，并用0. 8mL P服.5的棚酸緩沖液洗漆兩次；最 后加入0. 5血含有1% BSA，0. 5% Tween-20,5%庶糖的抑8. 5的棚酸緩沖液，得到超順磁性 復合粒子標記AFM1抗體溶液，于4°C下保存備用。
[0047] 實施例2本發明試劑盒標準曲線建立和回收率測定
[0048] 1.試劑盒標準曲線的建立
[0049] 取適量AFM1標準品（美國Sigma-Al化ich公司，產品號46319-U) W不含AFM1的 牛奶（北京市理化分析測試中屯、提供）稀釋為3. 33,1. 11,0. 37,0. 12,0. 04和O.Olng/mL， 分別與等體積PBST溶液（0. 01M的抑7. 2的PBS含1 %曲拉通X-100)混合，取100 y L上述 混合液與2 y L超順磁性復合粒子標記AFM1抗體溶液加入實施例1中的試紙條中，等待反 應20min后，將試紙條插入讀磁儀（美國如antum Design公司，產品號8094-600-01)的插 卡口中，采用讀磁儀讀取檢測線與質控線的MAR值，結果見表1。檢測結果通過四參數邏輯 斯蒂回歸擬合，其標準曲線如圖2所示，其中橫坐標為AFM1濃度，縱坐標為檢測線MR值與 質控線MR值的比值（即T/C)。由圖可W看出，標準曲線擬合良好，R 2= 0. 999。
[0050] 表1讀磁儀測定MR值
[0化1]
【權利要求】
1. 一種檢測黃曲霉毒素 Ml的磁性免疫層析試劑盒，包括：至少一個試紙條和一種超順 磁性復合粒子標記黃曲霉毒素 Ml抗體溶液。
2. 根據權利要求1所述的磁性免疫層析試劑盒，其中所述超順磁性復合粒子標記黃曲 霉毒素 Ml抗體溶液為黃曲霉毒素 Ml抗體與超順磁性復合粒子以肽鍵共價結合形成的聚 合體溶解在保存液中形成的溶液，所述超順磁性復合粒子為表面帶有易于與黃曲霉毒素 Ml 抗體偶聯的基團的Fe304納米粒子。
3. 根據權利要求1所述的磁性免疫層析試劑盒，其中所述試紙條由反應墊、樣品墊1、 樣品墊2、吸水墊依次相互交錯地粘在底板上并在上層覆蓋透明塑料膜組裝而成；所述反 應墊一端連接樣品墊，另一端與吸水墊相連；所述反應墊預包被有相互分離的檢測線和質 控線，所述檢測線含有黃曲霉毒素 Ml抗原，所述質控線含有能與所述黃曲霉毒素 Ml抗體特 異性結合的抗抗體。
4. 根據權利要求3所述的磁性免疫層析試劑盒，其中所述反應墊為硝酸纖維素膜，所 述樣品墊1為纖維素膜或玻璃纖維膜或玻璃纖維與纖維素的混合膜，所述樣品墊2為經樣 品墊處理液預處理的纖維素膜或玻璃纖維膜或玻璃纖維與纖維素的混合膜；所述吸水墊為 纖維素膜。
5. 根據權利要求4所述的磁性免疫層析試劑盒，其中所述黃曲霉毒素 Ml抗體為黃曲 霉毒素 Ml單克隆抗體或黃曲霉毒素 Ml多克隆抗體，所述黃曲霉毒素 Ml抗原為黃曲霉毒素 Ml半抗原與載體蛋白的偶聯物；所述黃曲霉毒素 Ml抗體特異性結合的抗抗體為羊抗鼠 IgG 抗體或兔抗鼠 IgG抗體。
6. 根據權利要求5所述的磁性免疫層析試劑盒，其中所述黃曲霉毒素 Ml半抗原為黃曲 霉毒素 Ml，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或人血清蛋白或鑰孔血藍蛋白或卵清蛋白。
7. 根據權利要求1所述的磁性免疫層析試劑盒的制備方法，包括如下步驟： I. 超順磁性復合粒子標記黃曲霉毒素 Ml抗體的制備： (1) 將超順磁性復合粒子、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC)、N-羥基丁 二酰亞胺（NHS)和2-(N-嗎啡啉）乙磺酸（MES)緩沖液混勻，反應得到活化的磁性粒子； (2) 將步驟（1)得到的活化的磁性粒子、黃曲霉毒素 Ml抗體和硼酸緩沖液混勻，反應得 到偶聯后磁性粒子反應液； (3) 向步驟（2)中的反應液加入含有牛血清白蛋白的硼酸緩沖液，反應得到含有封閉 后磁性粒子的反應液；再將封閉后的磁性粒子進行洗滌、保存，最終得到超順磁性復合粒子 標記黃曲霉毒素 Ml抗體； II. 反應墊的處理：用包被緩沖液將黃曲霉毒素 Ml抗原及抗抗體分別稀釋至合適的濃 度，并通過定量噴液裝置以一定的間隔分別將二者噴到硝酸纖維素膜上，分別形成檢測線 和質控線，噴完后晾干，放入干燥器中備用； III. 樣品墊2的處理：將樣品墊放入樣品墊處理溶液中浸泡后取出烘干； IV. 試紙條的組裝：將反應墊、樣品墊、吸水墊依次相互交錯粘在含有不干膠的底板上 并在上層覆蓋透明塑料膜，得到試紙板，并切割成試紙條。
8. 根據權利要求7所述的方法，其中步驟I中所述用于洗滌的溶液為50mM的pH = 8. 5的硼酸緩沖液，所述用于保存的溶液為1%牛血清白蛋白、0. 5% Tween-20和5%蔗糖 的pH8. 5的硼酸緩沖液；步驟II中的所述包被緩沖液為含有1% -2% BSA的0. 01M PBS、 pH7. 0-7. 6的溶液；步驟III中所述樣品墊處理溶液為含有0. 5% -2%牛血清白蛋白、 1% -5%蔗糖和 0? 5% -3% 曲拉通 X-100 的 0? 01M PBS，pH7. 0-7. 6。
9. 根據權利要求7所述的方法，其中在步驟I (1)中，在37°C下反應30分鐘，在步驟 I⑵中，在37°C下反應3小時；在步驟1(3)中，在37°C下反應30分鐘；在步驟II中，黃曲 霉毒素 Ml抗原與抗體的間隔為0. 5-lcm ;在步驟III中，樣品墊2在樣品墊處理液中浸泡1 小時。
10. 根據權利要求1-4任一項所述的磁性免疫層析試劑盒用于檢測乳及乳制品中黃曲 霉毒素 Ml的用途。
【文檔編號】G01N33/577GK104502553SQ201410737660
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月8日 優先權日:2014年12月8日
【發明者】武會娟, 管笛, 亢子佳, 賈迪 申請人:北京百歐美生科技有限公司