一種改良的胱抑素c檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種定量檢測胱抑素C(胱抑素C)的膠乳增強免疫比濁試劑盒,包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2,所述試劑R1主要由緩沖液1、穩定劑1、防腐劑1、EDTA、增凝劑和保護劑1組成;所述試劑R2主要由交聯胱抑素C抗體的聚苯乙烯膠乳微球、緩沖液2、穩定劑2、防腐劑2、保護劑2組成,其中聚苯乙烯膠乳微球與胱抑素C抗體之間以共價交聯方式連接。本發明檢測試劑盒制備成本低廉,穩定性好,易于保存,數據重復性好,檢測靈敏度高,可廣泛應用于臨床生化儀。
【專利說明】一種改良的胱抑素C檢測試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物檢測領域,特別是涉及一種改良的胱抑素C檢測試劑盒及其制備 方法和用途。
【背景技術】
[0002] 臨床評價腎臟疾病進展和嚴重程度,一般以腎功能為參考,腎功能一般以腎小球 濾過率(GFR)反映。它是反映腎功能最重要的指標。根據腎小球濾過率(GFR)標志物來 源,分外源性和內源性。外源性標志物包括菊粉(inulin)、碘海醇(i〇heX〇l)、51Cr-EDTA、 99mTc-DTPA等。內源性標志物包括血清肌酐(Scr)、尿素(Urea)、P 2-微球蛋白(@ 2-M)、 ¢-痕跡蛋白(BTP)以及血清胱抑素C(Cystatin C,Cys C)。
[0003] 胱抑素C(Cystatin C,Cys C),又名Y 2痕跡堿性蛋白或后Y球蛋白,是半胱氨 酸蛋白酶抑制劑蛋白質中的一種。編碼Cys C的基因屬于管家基因,能在所有的有核細胞 內以恒定速度持續轉錄與表達,無組織特異性,故Cys C可在體內以恒定速度產生,并存在 于各種體液之中,尤以腦脊液和精漿中含量為高,尿液中最低,不受年齡、性別、體重、炎癥 等因素影響。胱抑素C分子量小(13KD),生理條件下帶正電荷,能自由從腎小球濾過,完全 被腎小管上皮細胞重吸收并于細胞內降解,不重新回到血液中,同時腎小管上皮細胞也不 分泌Cys C至管腔內,因此,其血清濃度主要由GFR決定。近年來有許多試驗證明胱抑素C 是迄今基本滿足理想內源性GFR標志物要求的內源性物質。是新近發展起來的評估腎功能 的一種敏感性好、特異性高的指標。Cystatin C在一系列生理病理過程中也發揮著作用,有 重要的臨床意義。
[0004] 目前臨床對胱抑素C的檢測,主要通過免疫學的方法,借助抗原抗體特異性的結 合,以雙抗夾心的方式定量檢測血清中胱抑素C的含量。具體的檢測方法包括酶聯免疫吸 附測定法、化學發光法和免疫比濁法。酶聯免疫吸附測定法和化學發光法由于操作繁瑣、耗 時長、費用高等不足,限制了其廣泛應用。而免疫比濁法隨著全自動生化儀的普及和多種快 速免疫比濁檢測技術的發展,擁有反應時間短,精密度好,檢測范圍寬,黃疸、溶血和脂血標 本影響小,易于自動化等優點,已成為臨床胱抑素C的主流檢測方法。
[0005] 但是,由于免疫比濁法的檢測原理缺乏酶促放大反應,導致現有的胱抑素 C免疫 比濁檢測試劑盒不給避免的出現靈敏度較低等不足。同時,在試劑盒制備過程中,為保證產 品達到所需靈敏度,較酶聯免疫吸附測定法和化學發光法,其對所用抗體的質量要求更高, 包被量和抗體使用量更大,增加了試劑盒的成本。且目前廣泛使用的鼠單克隆抗體、兔多克 隆抗體或羊多克隆抗體由于自身屬性,在使用過程中都不可避免的會受到類風濕因子和異 嗜性抗體等的干擾,影響最終的檢測結果。
[0006] 卵黃抗體(Egg yolk antibodies, eyAb),也稱卵黃免疫球蛋白(Egg yolk immunoglobulin, IgY),是一種從免疫禽蛋中提取出的針對特定抗原的抗體,與傳統鼠單克 隆抗體、兔多克隆抗體或羊多克隆抗體相比,卵黃抗體具有以下優點:⑴產量高,免疫時間 短,易于大量制備;⑵物理性質穩定性強;⑶與哺乳動物種系差別大,可識別更多表位;⑷ 特異性強,同一家族抗原無交叉反應;(5)干擾小,不能識別哺乳動物體內的補體和人Fe受 體,不會和類風濕因子及HAM(人抗鼠抗體)反應。由于其自身優點突出,IgY抗體將來有 望越來越多的進入診斷試劑的領域,在診斷試劑的開發中發揮更加重要的作用。
【發明內容】
[0007] 鑒于以上所述現有技術的缺點,本發明的目的在于提供提供一種改良的胱抑素 C 檢測試劑盒,該試劑盒與現有胱抑素C檢測試劑盒相比,能進一步提高血清中胱抑素C的檢 測靈敏度,不受類風濕因子和異嗜性抗體的干擾,具靈敏度高,特異性好、線性范圍寬和穩 定性佳的特點,且成本更低,易于推廣使用。
[0008] 為實現上述目的及其他相關目的,本發明提供一種定量檢測胱抑素 C的膠乳增強 免疫比濁試劑盒,包括彼此獨立的試劑Rl和試劑R2,所述試劑Rl主要由緩沖液1、穩定劑 1、防腐劑1、EDTA、增凝劑和保護劑1組成;所述試劑R2主要由交聯胱抑素 C抗體的聚苯乙 烯膠乳微球、緩沖液2、穩定劑2、防腐劑2、保護劑2組成,其中聚苯乙烯膠乳微球與胱抑素 C抗體之間以共價交聯方式連接。
[0009] 本發明中的防腐劑1和2是指可以抑制試劑中細菌和微生物污染的一類試劑,對 試劑具有防腐殺菌的作用。試劑R2中的保護劑2是一類能夠保護膠乳顆粒表面的抗體的 試劑。穩定劑1和2可以保持試劑內的電荷平衡。
[0010] 本技術方案中的胱抑素C膠乳增強免疫比濁試劑盒,將胱抑素C抗體交聯在聚苯 乙烯膠乳微球表面,當血液中的胱抑素C與胱抑素C抗體反應時,帶動聚苯乙烯膠乳微球聚 集產生一定濁度,而濁度與血液中的胱抑素C含量在一定范圍成正比,可以用全自動生化 儀在400-800nm波長下檢測血液中胱抑素C的含量。
[0011] 優選地,所述試劑Rl中的緩沖液1選自Ifepes緩沖液、TriS-HCl緩沖液、MOPS緩 沖液、PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼砂緩沖液中的任意一種或多種的組合,其pH為7. 0? 9. 0,濃度為25?500mmol/L ;所述試劑R2中的緩沖液2選自PBS緩沖液、硼砂緩沖液、甘 氨酸緩沖液、Hepes緩沖液、GOODS緩沖液、MOPS緩沖液中任意一種或多種的組合,其pH為 7. 0 ?9. 0,濃度為 25 ?500mmol/L。
[0012] 優選地,為了使得試劑盒具有更佳的靈敏度和顯色效果,本發明對所述試劑Rl中 的緩沖液1進行了改進,所述試劑Rl中的緩沖液1包括下列組分:水蘇糖、明礬、果糖二磷 酸鈉、六偏磷酸鈉和甘氨酸,且水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六偏磷酸鈉、甘氨酸的總濃度 為3. 5 - 7. 5g/L,生物緩沖液1的pH值為7. 2 - 7. 6。
[0013] 優選地,各組分在緩沖液1中的濃度為:
[0014]
【權利要求】
1. 一種胱抑素C檢測試劑盒,包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2,所述試劑R1主要由 緩沖液1、穩定劑1、防腐劑1、EDTA、增凝劑和保護劑1組成;所述試劑R2主要由交聯胱抑 素C抗體的聚苯乙烯膠乳微球、緩沖液2、穩定劑2、防腐劑2、保護劑2組成,其中聚苯乙烯 膠乳微球與胱抑素C抗體之間以共價交聯方式連接。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑R1中的緩沖液1選自Hepes 緩沖液、Tris-HCl緩沖液、MOPS緩沖液、PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼砂緩沖液中的任意一 種或多種的組合,其pH為7. 0?9. 0,濃度為25?500mmol/L ;所述試劑R2中的緩沖液2 選自PBS緩沖液、硼砂緩沖液、甘氨酸緩沖液、Hepes緩沖液、GOODS緩沖液、MOPS緩沖液中 任意一種或多種的組合,其pH為7. 0?9. 0,濃度為25?500mmol/L。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑R1中的緩沖液1包括下列組 分:水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六偏磷酸鈉和甘氨酸,且水蘇糖、明礬、果糖二磷酸鈉、六 偏磷酸鈉、甘氨酸的總濃度為3. 5 - 7. 5g/L,生物緩沖液1的pH值為7. 2 - 7. 6。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑R1中的穩定劑1選自KC1、 似(:1、0&(:12中的任意一種或多種的組合,其質量濃度為0.5%?10% ;所述試劑1?2中的 穩定劑2采用離子穩定劑和懸浮穩定劑配合使用;其中離子穩定劑為NaCl、KC1、Na2C03、 Na2S04或者K2S04,懸浮穩定劑為PEG8000、鹿糖、甘油或者葡萄糖。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑R1中的防腐劑1為疊氮鈉、硫 柳汞或者ProClin300 ;所述試劑R2中的防腐劑2為疊氮鈉、硫柳汞或ProClin300。
6. 根據權利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑R1中的增凝劑為PEG8000或 者葡聚糖。
7. 根據權利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑R2中的聚苯乙烯乳膠微球 的表面官能團為氨基、羧基、酰肼、醛基或環氧基,聚苯乙烯乳膠微球的的粒徑在100? 600nm〇
8. 根據權利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑R1中的保護劑1為牛血清白 蛋白;所述試劑R2中的保護劑2為牛血清白蛋白。
9. 根據權利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑R1中的EDTA的濃度為10? 100mmol/L〇
10. 根據權利要求1?9任一權利要求所述的試劑盒的制備方法和使用方法,其特征在 于,具體包括如下步驟: (1) 試劑R1的制備: 在緩沖液1中加入穩定劑1、增凝劑、防腐劑1、保護劑1和EDTA,攪拌混合均勻,即得試 劑R1 ; (2) 試劑R2的制備: 步驟一:將胱抑素C抗體進行4°C透析,再用緩沖液2將胱抑素C抗體稀釋至2mg/ml, 得到胱抑素C抗體稀釋液;將聚苯乙烯膠乳微球用蒸餾水離心、洗滌3次; 步驟二:用緩沖液2將經過步驟一洗滌后的聚苯乙烯膠乳微球稀釋到質量濃度為1%, 再加入質量濃度為〇. 01 % _〇. 1 %的EDC,在室溫下攪拌反應30min,反應結束后15000rpm 離心洗滌以除去未反應的EDC,然后加入步驟一得到的胱抑素C抗體稀釋液,室溫下攪拌反 應30min,再加入終止液終止反應,將得到的反應液15000rpm離心,用緩沖液2洗漆沉淀,重 復離心洗滌3次,最后加入緩沖液2、防腐劑2、穩定劑2、保護劑2攪拌混合均勻即得試劑 R2。
【文檔編號】G01N33/531GK104360081SQ201410735830
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年12月5日 優先權日:2014年12月5日
【發明者】李元麗 申請人:重慶中元生物技術有限公司