一種用maldi-tot-tof質譜對蛋白質n端序列進行從頭測序的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種用MALDI-TOT-TOF(基質輔助激光解吸電離-串聯飛行時間)質譜對蛋白質N端序列進行從頭測序的方法和試劑盒。該方法涉及蛋白質的分離、還原烷基化、蛋白質的化學修飾、酶切肽段的質譜分析、蛋白質N端肽段的質譜識別與從頭測序。該方法對膠內蛋白質的賴氨酸進行胍基化，選擇性地將TMPP-Ac修飾在蛋白質N端氨基上；并通過加入終止試劑和洗滌。該方法所得的蛋白質N端氨基修飾物不受過量的試劑和相應的副產物的影響，與質譜技術相容。該方法可對蛋白質的N端肽進行富集，結合反相液相色譜和生物質譜技術，既容易確定蛋白質的N端肽段，又可以很方便地進行從頭測序。
【專利說明】一種用MALD1-TOT-TOF質譜對蛋白質N端序列進行從頭測序的方法和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬于蛋白質測序【技術領域】，具體涉及一種用基質輔助激光解吸電離-串聯飛行時間(MALD1-T0T-T0F)質譜對蛋白質N端序列進行從頭測序的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002]所有蛋白質的合成都起始于N端，N末端序列具有很尚的特異性，可用于鑒定蛋白且對其生物學功能有著巨大的影響。因此，通過對蛋白質N端序列的研宄有利于分析蛋白質的高級結構，揭示蛋白質的生物學功能。
[0003]目前對蛋白N端測序主要分為兩大類，其一為非質譜技術，例如經典的Edman降解法、利用反轉錄RT-PCR得到對應蛋白的cDNA，再來反推得到蛋白序列；其二為質譜技術。經典的Edman降解法已經廣泛應用于蛋白質的N端測序，對于整體純化的蛋白的N端序列分析仍是很有價值的研宄工具。但是Edman降解法受到以下諸多限制:①用于序列分析的蛋白質或多肽必須是高純度的N端封閉的蛋白質難以進行Edman反應不適于高通量分析，靈敏度不夠。利用反轉錄RT-PCR得到對應蛋白的cDNA，再來反推得到蛋白序列，其特點是更加簡便、快速，但它對翻譯加工所導致的氨基酸殘基的修飾及突變等情況無能為力。
[0004]質譜技術已成為當前進行蛋白質鑒定和蛋白質N末端肽測定的主要方法，通過將蛋白質酶切后，對所產生的肽段進行二級質譜分析，再進行數據庫搜索而進行鑒定，這些數據庫是唯一適于基因組已經測序的生物體。盡管被測序的生物數量越來越多，仍然有大量的遺傳密碼未知的物種。另一方面由于蛋白質序列的不知原因的突變，蛋白質序列的多形態，數據庫中的序列錯誤以及蛋白質的翻譯后修飾等原因存在，使得基于數據庫搜索的蛋白質鑒定和蛋白質N末端肽測定存在困難。從頭測序方法(de Novo)不依賴現有的數據庫，根據肽段有規律碎裂的特點，直接從圖譜中推導出肽段的序列，能夠分析新物種、基因組未測序物種以及蛋白質的翻譯后修飾的串聯質譜數據，具有數據庫搜索方法不可替代的優勢。
[0005]許多對末端肽的研宄方法采用的是質譜技術與多種化學方法及生物酶法的結合。通過N端的各種化學標記，運用MS/MS或多級質譜(MSn)的碰撞誘導裂解(CID)、源后裂解(PSD)等碎裂技術測序；或標記的N端肽段先經過選擇性的分離，再進行從頭測序。在所報道的用于標記N端肽段的試劑中，(N-琥珀酰亞胺基氧代羰基甲基)三(2，4，6-三甲氧苯基)溴化膦(TMPP-Ac-OSu)引起大家極大的興趣，它被用于多肽的從頭測序、翻譯后修飾和N端測序，其特點是標記TMPP-Ac后的肽段，在用MALD1-T0F/T0F質譜儀進行CID或PSD碎裂時，產生特征的573.2峰，且主要產生連續的a離子系列，圖譜簡單，便于從頭測序；但是過量的反應試劑及其副產物嚴重干擾隨后的反相液相色譜分析(RP-LC)和質譜分析，影響其廣泛應用于蛋白質組學。目前報道的方法不僅將TMPP-Ac標記在蛋白質N端，而且還標記在中間肽和其中的賴氨酸上，因此難以識別出蛋白質N端肽。另一方面，賴氨酸的分子量為(128.09496)與谷氨酰胺的分子量(128.05858)相差很近，難于分辨。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一種簡單快速高靈敏度的、具有良好特異性和普適性，既可對蛋白質N端進行測序，又可對其進行從頭測序的高通量方法，具體為一種用基質輔助激光解吸電離-串聯飛行時間(MALD1-TOT-TOF)質譜對蛋白質N端序列進行從頭測序的新方法。
[0007]為了實現上述目的，本發明的技術方案如下:
[0008]一種用MALD1-TOT-TOF質譜對蛋白質N端序列進行從頭測序的方法，該方法涉及蛋白質的分離、還原烷基化、蛋白質的化學修飾、酶解、分離富集修飾的蛋白質N端肽段以及N端肽段的質譜識別和從頭測序，具體步驟包括:
[0009](I)用一維凝膠電泳(SDS-PAGE GEL)分離蛋白質或將蛋白質凝結在膠上；
[0010](2)在膠內用還原劑打開蛋白質分子中的二硫鍵，破壞其高級結構；用烷基化試劑封閉巰基，防止其重新形成二硫鍵；
[0011](3)在膠內對蛋白質的賴氨酸進行胍基化；
[0012](4)在膠內對蛋白質N端氨基進行酰基化修飾，然后進行終止和洗滌，去除過量的修飾試劑和相應的副產物；
[0013](5)用化學消化或酶消化法對蛋白質進行消化，產生適于質譜分析的肽段；
[0014](6)用質譜分析技術分析蛋白質N端肽段，使其裂解產生碎片離子的質譜圖；
[0015](7)用反相液相色譜技術分離富集蛋白質N端肽段，用質譜分析技術高通量地測定蛋白質N端肽段。
[0016]其中:
[0017]所述胍基化為用O-甲基異脲或S-甲基異脲進行胍基化修飾。
[0018]酰基化修飾試劑為三(2，4，6-三甲氧苯基)膦基乙酰基衍生物，其使蛋白質N端氨基帶上TMPP-Ac基團。
[0019]所述三(2，4，6-三甲氧苯基)膦基乙酰基衍生物為(N-琥珀酰亞胺基氧代羰基甲基)三(2，4，6-三甲氧苯基)溴化膦。
[0020]步驟(4)中進行終止的化學試劑為羥胺、賴氨酸或甘氨酸；進行洗滌的化學試劑為去離子水和乙腈。
[0021]步驟(5)所述酶優選自胰蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶(Glu-C)或α-糜蛋白酶。
[0022]所述質譜分析技術為LC-MALD1-TOF-TOF 或 MALD1-TOF-TOF。
[0023]本發明的目的還在于提供一種用基質輔助激光解吸電離-串聯飛行時間(MALD1-TOT-TOF)質譜對蛋白質N端序列進行從頭測序的試劑盒。
[0024]該試劑盒含有:
[0025](a) 一種化學試劑，對蛋白質的賴氨酸進行胍基化修飾；
[0026](b) 一種化學試劑，對蛋白質的N端氨基進行修飾，使其帶上TMPP-Ac基團；
[0027](c)兩種或多種化學試劑，對蛋白質的修飾反應進行終止；
[0028](d)兩種或多種化學試劑，去除過量的反應試劑和相應的副產物。
[0029]其中，(a)中所述化學試劑為O-甲基異脲或S-甲基異脲。
[0030](b)中所述化學試劑為三(2，4，6-三甲氧苯基)膦基的乙酰化試劑。
[0031](c)中所述化學試劑為三氟乙酸水溶液、羥胺或賴氨酸或甘氨酸；(d)中所述化學試劑為乙腈和去離子水。
[0032]為方便使用，該試劑盒還可包含以下組分中的一種或多種:用于打開蛋白質分子中二硫鍵的還原劑，如三羧乙基膦(TCEP);封閉巰基防止其重新形成二硫鍵的烷基化試劑，如碘代乙酰胺；蛋白質消化劑，如胰蛋白酶、葡萄球菌蛋白酶(Glu-C)或α-糜蛋白酶；緩沖溶液，如磷酸氫鈉-磷酸二氫鈉。
[0033]本發明的方法和試劑盒適用于蛋白質的鑒定與N端序列的快速測定，適用于生物學、醫學、藥物學研宄和應用領域中蛋白質的鑒定和N端測序，特別適合于基因工程重組產品或藥物的N端序列分析及質量控制，可對蛋白質組進行規模化的N端測序。
[0034]本發明的方法和試劑盒具有廣泛的實用性。用途包括但不限于:在醫學、藥學、農業和畜牧業等領域進行各種動植物和微生物的蛋白質研宄。
[0035]本發明的有益效果為:
[0036]1.本方法具有良好的特異性，可以將TMPP-Ac選擇性地標記在蛋白質N端，克服了目前已有方法中存在的難以區分蛋白質N端肽與中間肽、以及蛋白質中所含賴氨酸與谷氨酰胺難區別的問題，可全面用于蛋白的N端測序。
[0037]2.TMPP-Ac標記后的肽段用質譜分析時，產生特征峰573.2，圖譜簡單，便于從頭測序；此外，蛋白質的N端氨基帶上TMPP-Ac基團后，其疏水性增強，經高壓反相液相色譜分離分析時，其保留時間延長，質譜識別簡便，據此可將蛋白質組中的N端分離富集出來。
[0038]3.賴氨酸的分子量為(128.09496)與谷氨酰胺的分子量(128.05858)相差很近，難于分辨，本方法通過將賴氨酸胍基化則可將兩者進行很好的區分。
[0039]4.本方法中所有的修飾反應均為“在膠內”進行，通過加入終止試劑和大量地洗滌，所得的蛋白質N端氨基修飾物不受過量的試劑和相應的副產物的影響，與質譜技術相容。
[0040]5.本方法大大提高和簡化了蛋白質N端測序的速度和通量化水平，顯著增加了 N端肽在二級質譜中的裂解效率，且圖譜簡單，可根據二級質譜圖對蛋白末端肽進行從頭測序。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041]圖1為人血紅蛋白TMPP-Ac修飾前后酶解所得多肽的MALD1-TOF質譜圖；其中，圖1a為修飾前，圖1b為修飾后。
[0042]圖2為TMPP-Ac修飾后人血紅蛋白N端肽的MALD1-TOF-TOF串聯質譜圖及從頭測序;其中，圖 2a 的序列為 VLSPADK, C+1301.21Da，圖 2b 的序列為 VHLTPEEK, C+1524.56Da。
[0043]圖3為胍基化和TMPP-Ac修飾后人血紅蛋白用葡萄球菌蛋白酶酶切后N端肽的MALD1-TOF-TOF串聯質譜圖及從頭測序；其中，圖3a序列為VHLTPEE，C+1396.54Da ;圖3b的序列為 VHLTPE, C+1267.50Da。
【具體實施方式】
[0044]下面通過實施例結合附圖對本發明給予進一步的說明，但是本發明并不僅僅局限于這些實施例，這些實施例不以任何方式限制本發明的范圍。本領域的技術人員在權利要求的范圍內所做出的某些改變和調整也應認為屬于本發明的范圍。
[0045]實施例1人血紅蛋白的N端測序
[0046]1.1膠內蛋白的制備
[0047]提取蛋白質，每個Eppendorf管中加入4 μ L 2.5mg/mL的蛋白質，2.5 μ Ltris-HClpH 8.8，I yL 水，4.2 yL 30 % Acr/Bis，0.1 μ L 10% SDS,0.2yL TEMED, IyL 10% AP,0.8yL 300mM TCEPo混勻，67°C水浴加熱還原10分鐘，切膠，加新配制的100 μ L 10mM碘代乙酰胺(IAA)，室溫黑暗反應30分鐘，進行烷基化保護。用200 yL乙腈/水(1:1)振蕩20分鐘，棄上清，共洗滌兩次；加入200 μ L乙腈振蕩10分鐘，棄上清。
[0048]也可用本領域傳統的蛋白質分離技術，如一維或二維凝膠電泳方法分離蛋白，將蛋白固定在膠上，用考馬斯亮藍方法顯色。
[0049]1.2蛋白的酰基化
[0050]在上述的Eppendorf管中加入6 μ L pH 4.6-9.0磷酸緩沖液，加3 μ L 1mM新配的(N-琥珀酰亞胺基氧代羰基甲基)三(2，4，6-三甲氧苯基)溴化膦(TMPP-Ac-OSu)乙腈溶液，反應30分鐘；加入30 μ LlOOmM賴氨酸(或甘氨酸)振蕩15分鐘，終止反應。再用乙腈/水(1:1)洗滌二次；加入50 μ L水，在水浴中放置20分鐘，水浴溫度為50-100°C;再用200 μ L乙腈洗滌一次。
[0051]1.3膠內酶切
[0052]加入含10 μ L 20ng/ μ L胰酶的50mM NH4HCO3^fit,于37°C孵化17小時。將膠內酶切的多肽按本領域傳統方法洗脫出來，凍干。
[0053]1.4MALD1-TOF-TOF 質譜分析
[0054]吸取0.5 μ Llpmol上述制備的酶切產物點在靶板上，再與含0.1 % TFA和50%乙腈的CHCA(10mg/mL)基質溶液混合，自然放干，用MALD1-TOF-TOF-MS測定得質譜圖，所有的MALD1-TOF-TOF質譜分析是5800Proteomics Analyzer質譜儀(美國應用生物系統公司)上進行。實驗中所得數據都在反射正離子模式中進行，質譜分子量的校正采用外標法。質量測定的準確度通常在lOppm。做質譜分析時，先做一級質譜，然后選擇最強的50個峰進行二級質譜分析。
[0055]L 5MALD1-T0F-T0F 質譜結果分析
[0056]圖1a是0.5yL Ip的人血紅蛋白酶解所得多肽的MALD1-TOF質譜圖，圖1b是0.5 μ L Ip的TMPP-Ac修飾的人血紅蛋白酶解所得多肽的MALD1-T0F質譜圖，比較兩圖可知，圖1b比圖1a只有兩個多肽的區別，它們分別是m/z為1301.21和1524.56，這些是人血紅蛋白α，β鏈的N端肽被TMPP-Ac修飾后所產生的，說明此方法能選擇性地修飾蛋白質的N端狀。
[0057]在所有的二級圖中，只有m/z為1301.21和1524.56兩個肽段產生有TMPP-Ac的裂解峰m/z573.189，這些是人血紅蛋白α，β鏈的N端肽被TMPP-Ac修飾后所產生的，據此可將蛋白質的N端肽與中間肽區別開。由圖2a，2b可知，所得二級質譜圖圖譜簡單，主要為連續的a離子碎裂離子，且均有TMPP-Ac的裂解峰m/z573.189，它既可以數據庫檢索得到序列，也可很方便地從頭測序，它們的序列分別為VLSPADK，C+1301.21Da(圖2a)，VHLTPEEK, C+1524.56Da(圖 2b)。
[0058]實施例2人血紅蛋白的N端測序
[0059]2.1膠內蛋白的制備
[0060]方法同實施實例I中的1.1。
[0061]2.2蛋白的胍基化
[0062]在上述的Eppendorf管中加入5 μ L2N的O-甲基異脲的碳酸鈉水溶液，反應30分鐘，加入5yL 5%三氟乙酸水溶液，終止反應。用200 μ L乙腈/水(1:1)振蕩10分鐘，棄上清，共洗滌兩次；加入200 μ L乙腈振蕩10分鐘，棄上清。
[0063]2.3蛋白的酰基化
[0064]方法同實施實例I中的1.2。
[0065]2.4膠內酶切
[0066]加入含10 μ L 20ng/ μ L 葡萄球菌蛋白酶(Glu-C)的 50mM NH4HCO3^fit,于 37°C孵化17小時。將膠內酶切的多肽按本領域傳統方法洗脫出來，凍干。
[0067]2.5MALD1-T0F-T0F 質譜結果分析
[0068]在所有的二級圖中，只有m/z為1267.50和1396.54Da的多肽產生有TMPP-Ac的裂解峰m/z573.189，這是人血紅蛋白β鏈的N端肽被TMPP-Ac修飾后所產生的，據此可將蛋白質的N端肽與中間肽區別開。圖3是胍基化和TMPP-Ac修飾后人血紅蛋白用葡萄球菌蛋白酶酶切后N端肽的MALD1-TOF-TOF串聯質譜圖，由圖可知，所得二級質譜圖圖譜簡單，主要為連續的a離子碎裂離子，它既可以數據庫檢索得到序列，也可很方便地從頭測序，它們的序列分別為 VHLTPEE, C+1396.54Da(圖 3a)，VHLTPE, C+1267.50Da(圖 3b)。
【權利要求】
1.一種用MALD1-TOT-TOF質譜對蛋白質N端序列進行從頭測序的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)用一維凝膠電泳分離蛋白質或將蛋白質凝結在膠上； (2)在膠內用還原劑打開蛋白質分子中的二硫鍵，破壞其高級結構；用烷基化試劑封閉巰基，防止其重新形成二硫鍵； (3)在膠內對蛋白質的賴氨酸進行胍基化； (4)在膠內對蛋白質N端氨基進行酰基化修飾，然后進行終止和洗滌，去除過量的修飾試劑和相應的副產物； (5)用化學消化或酶消化法對蛋白質進行消化，產生適于質譜分析的肽段； (6)用質譜分析技術分析蛋白質N端肽段，使其裂解產生碎片離子的質譜圖； (7)用反相液相色譜技術分離富集蛋白質N端肽段，用質譜分析技術高通量地測定蛋白質N端肽段。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述胍基化為用O-甲基異脲或S-甲基異脲進行胍基化修飾。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，酰基化修飾試劑為三(2，4，6-三甲氧苯基)膦基乙酰基衍生物，其使蛋白質N端氨基帶上TMPP-Ac基團。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述三(2，4，6-三甲氧苯基)膦基乙酰基衍生物為(N-琥珀酰亞胺基氧代羰基甲基)三(2，4，6-三甲氧苯基)溴化膦。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中進行終止的化學試劑為羥胺、賴氨酸或甘氨酸；進行洗滌的化學試劑為去離子水和乙腈。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述質譜分析技術為LC-MALD1-TOF-TOF或 MALD1-TOF-TOF。
7.—種用MALD1-T0T-T0F質譜對蛋白質N端序列進行從頭測序的試劑盒，其特征在于，此試劑盒含有: (a)一種化學試劑，對蛋白質的賴氨酸進行胍基化修飾； (b)一種化學試劑，對蛋白質的N端氨基進行修飾，使其帶上TMPP-Ac基團； (c)兩種或多種化學試劑，對蛋白質的修飾反應進行終止； (d)兩種或多種化學試劑，去除過量的反應試劑和相應的副產物。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，(a)中所述化學試劑為O-甲基異脲或S-甲基異脲。
9.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，(b)中所述化學試劑為三(2，4，6-三甲氧苯基)膦基的乙酰化試劑。
10.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，(c)中所述化學試劑為三氟乙酸水溶液、羥胺或賴氨酸或甘氨酸；(d)中所述化學試劑為乙腈和去離子水。
【文檔編號】G01N27/62GK104483374SQ201410722851
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月2日 優先權日:2014年12月2日
【發明者】鄒霞娟, 楊彬 申請人:北京大學