一種測定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種測定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法，所述方法包括以下的步驟：①待檢樣品上樣液的制備；②酪蛋白標準品和乳清蛋白標準品上樣液的制備；③聚丙烯酰胺凝膠電泳；④染色與脫色；⑤成像與計算。所述的方法準確性高、操作簡單、成本低，以標準蛋白質的質量和trace值作參比，無需制作標準曲線即能實現準確檢測乳清蛋白的含量。
【專利說明】一種測定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物領域，具體涉及一種測定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方 法。
【背景技術】
[0002] 牛乳中的蛋白質可大致分為酪蛋白和乳清蛋白兩大類，其中酪蛋白占牛乳中蛋白 質含量的約80%，酪蛋白由a Sl-酪蛋白、a S2-酪蛋白、￠-酪蛋白和K-酪蛋白四種蛋 白質組成，且四種酪蛋白占總酪蛋白的比例分別為40%、10%、40%和10%，所述的百分比 為質量百分比；乳清蛋白約占牛乳中蛋白質含量的20%，乳清蛋白主要由P -乳球蛋白、 a _乳白蛋白、免疫球蛋白和血清白蛋白組成，分別約占總乳清蛋白的50%、20%、12%和 6%，所述的百分比為質量百分比。乳清蛋白相比于酪蛋白能為嬰兒提供更高的營養，另外 嬰兒的消化系統也更易消化乳清蛋白而非酪蛋白。成熟母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例為 60:40,為了使嬰兒配方粉更接近母乳，為嬰兒提供更有利于其生長的營養，我國市售的乳 基嬰兒配方粉都通過添加乳清蛋白來調整乳粉內乳清蛋白的含量。
[0003] 對于乳粉內乳清蛋白含量的檢測，目前國內主要依據GB/T 5413. 2 1997,該法檢 測時用光密度計來檢測不同蛋白的光密度，最后通過計算不同蛋白的光密度來計算乳清蛋 白的含量。光密度檢測法存在一定的缺陷，因為不同的蛋白結合考馬斯亮藍的能力不同，即 使在蛋白質濃度相同的情況下，不同蛋白仍會表現出不同的光密度值，因此僅用蛋白質光 密度掃描的trace值來計算乳清蛋白的含量，會造成檢測結果的準確度較低，誤差較大。因 此需要探尋一種更加準確、操作簡單、成本低、且能適用于乳基嬰幼兒配方粉這一復雜體系 中乳清蛋白含量的檢測方法。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是克服現有技術中僅利用蛋白質光密度掃描的trace 值來檢測乳粉中乳清蛋白含量時檢測結果準確度較低、誤差較大的缺陷，提供一種準確性 高、操作簡單、成本低的測定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法。
[0005] 本發明提供一種測定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法，所述方法包括以 下的步驟：
[0006] ①待檢樣品上樣液的制備：將待檢樣品攪拌并充分溶解于去離子水中，然后與 SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，水浴煮沸，迅速移入到冰水中冷卻，即得所述待檢樣品上樣 液；所述待檢樣品指非水解的乳基嬰幼兒配方粉；
[0007] ②酪蛋白標準品和乳清蛋白標準品上樣液的制備：將a -酪蛋白、0 -酪蛋白和 K-酪蛋白溶解于水得酪蛋白標準品的混合樣；將￠-乳球蛋白、a-乳白蛋白和血清白蛋 白溶解于水得乳清蛋白標準品的混合樣；將所述酪蛋白標準品的混合樣和所述乳清蛋白標 準品的混合樣分別和SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，水浴煮沸，然后迅速移入到冰水中冷 卻，即得酪蛋白標準品上樣液和乳清蛋白標準品上樣液；
[0008] ③聚丙烯酰胺凝膠電泳：將步驟①所述待檢樣品上樣液、步驟②所述酪蛋白標準 品上樣液和所述乳清蛋白標準品的上樣液上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，得聚丙烯酰胺 凝膠；
[0009] ④染色與脫色：移出步驟③所述的聚丙烯酰胺凝膠，用染色液染色即得染色的凝 膠；將所述染色的凝膠用脫色液脫色至背景透明，即得脫色的凝膠；
[0010] ⑤成像與計算：將步驟④所述脫色的凝膠置于凝膠成像系統內，用圖像處理軟件 分析記錄所述待檢樣品對應泳道各條帶的trace值，對照所述酪蛋白標準品和所述乳清蛋 白標準品對應泳道各條帶的trace值，并根據步驟③所上樣的酪蛋白標準品或乳清蛋白標 準品的質量，計算所述待檢樣品中乳清蛋白占總蛋白的比例，所述的trace值為SDS-PAGE 的光密度掃描圖譜內蛋白質對應峰的峰面積。
[0011] 步驟①為，待檢樣品上樣液的制備：將待檢樣品攪拌并充分溶解于去離子水中，然 后與SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，水浴煮沸，迅速移入到冰水中冷卻，即得所述待檢樣 品上樣液；所述待檢樣品指非水解的乳基嬰幼兒配方粉。其中，所述去離子水為本領域常規 的去離子水，較佳地為純水，更佳地為超純水。本發明中，所述的溶解是指在水中形成穩定、 均一的體系。所述待檢樣品上樣液A的蛋白質含量的終濃度為本領域常規的終濃度，較佳 地，在2mg/mL?4mg/mL范圍內，更佳地為3mg/mL。所述SDS-PAGE上樣緩沖液為本領域常 規的SDS-PAGE上樣緩沖液，較佳地為2 X SDS-PAGE上樣緩沖液。較佳地，所述2 X SDS-PAGE 上樣緩沖液的口^1值為6.8，含有1'1^8-1〇^1〇〇1111，5〇5〇.〇51^/1，溴酚蘭〇.〇〇21^/1，0-巰 基乙醇0. lkg/L，甘油20%，所述百分比為體積百分比。所述煮沸的時間為本領域常規的時 間，較佳地為2?8min，更佳地為3?5min。
[0012] 步驟②為，酪蛋白標準品和乳清蛋白標準品上樣液的制備：將a-酪蛋白、￠-酪 蛋白和K-酪蛋白溶解于水得酪蛋白標準品的混合樣；將￠-乳球蛋白、a-乳白蛋白和 血清白蛋白溶解于水得乳清蛋白標準品的混合樣；將所述酪蛋白標準品的混合樣和所述乳 清蛋白標準品的混合樣分別和SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，水浴煮沸，然后迅速移入到 冰水中冷卻，即得酪蛋白標準品上樣液和乳清蛋白標準品上樣液。其中，所述酪蛋白標準品 混合樣為本領域常規的酪蛋白標準品混合樣，較佳地由包括以下步驟的方法制備而得：將 a-酪蛋白、￠-酪蛋白和K-酪蛋白以質量比4:3:1的比例溶解于水獲得終蛋白濃度為 I. 70mg/mL的水溶液，即得。所述乳清蛋白標準品混合樣為本領域常規的乳清蛋白標準品 混合樣，較佳地由包括以下步驟的方法制備而得：將￠-乳球蛋白、a-乳白蛋白和血清白 蛋白以質量比8:3:1的比例溶解于水獲得終蛋白濃度為1.43mg/mL的水溶液，即得。所述 SDS-PAGE上樣緩沖液為本領域常規的SDS-PAGE上樣緩沖液，較佳地為2X SDS-PAGE上樣 緩沖液。較佳地，所述2 X SDS-PAGE上樣緩沖液的pH值為6. 8,含有Tris-HCL lOOmM，SDS 0. 05kg/L，溴酚蘭0. 002kg/L，P -巰基乙醇0. lkg/L，甘油20 %，所述百分比為體積百分比。 所述煮沸的時間為本領域常規的時間，較佳地為2?8min，更佳地為3?5min。
[0013] 步驟③為，聚丙烯酰胺凝膠電泳：將步驟①所述待檢樣品上樣液、步驟②所述酪 蛋白標準品上樣液和所述乳清蛋白標準品上樣液上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，得聚丙 烯酰胺凝膠。其中，所述待檢樣品上樣液的上樣量為本領域常規的上樣量，較佳地為2? 6 y L，更佳地為4 y L。所述酪蛋白標準品上樣液的上樣量為本領域常規的上樣量，較佳地為 2?8 y L，更佳地為5 y L。所述乳清蛋白標準品上樣液的上樣量為本領域常規的上樣量， 較佳地為2?8 y L，更佳地為5 y L。所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳的條件為本領域常規的條 件，較佳地為35?45mA恒流電泳30?50min后，電流調為25?35mA恒流，電泳至藍色條 帶距膠底部0. 5cm處；更佳地為40mA恒流電泳40min后，電流調為30mA恒流，電泳至藍色 條帶距膠底部0. 5cm處。所述聚丙烯酰胺凝膠電泳的電泳液為本領域常規的電泳液，較佳 地，所述電泳液pH值為8. 6,含有Tris 25mM/L，甘氨酸192mM/L，SDS lg/L。所述聚丙烯酰 胺凝膠電泳的凝膠為本領域常規的凝膠，較佳地為5%的濃縮膠和12%的分離膠，所述百 分比為質量體積百分比（w/v)。所述聚丙烯酰胺凝膠電泳即為SDS-PAGE。
[0014] 步驟④為，染色與脫色：移出步驟③所述的聚丙烯酰胺凝膠，用染色液染色即得染 色的凝膠；將所述染色的凝膠用脫色液脫色至背景透明，即得脫色的凝膠。其中，所述的染 色液為本領域常規的染色液；較佳地為考馬斯亮藍染色液，更佳地為〇. 1 %的考馬斯亮藍 染色液。較佳地，所述0. 1 %的考馬斯亮藍染色液為，冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考馬斯亮藍 R-250 0.1%的水溶液，所述百分比為質量百分比。所述的脫色液為本領域常規的脫色液， 較佳地為冰醋酸7. 5%、甲醇10%的水溶液，所述百分比為質量百分比。所述的染色的時間 為本領域常規的時間，較佳地為1?2小時，更佳地為1. 5小時。
[0015] 步驟⑤為，成像與計算：將步驟④所述脫色的凝膠置于凝膠成像系統內，用圖像 處理軟件分析記錄所述待檢樣品對應泳道各條帶的trace值，對照所述酪蛋白標準品和所 述乳清蛋白標準品對應泳道各條帶的trace值，并根據步驟③所上樣的酪蛋白標準品或乳 清蛋白標準品的質量，計算所述待檢樣品中乳清蛋白占總蛋白的比例，所述的trace值為 SDS-PAGE的光密度掃描圖譜內蛋白質對應峰的峰面積。其中，所述的圖像處理軟件為本領 域常規的圖像處理軟件，較佳地為Quantity One圖像處理軟件。較佳地，所述峰面積的獲 得是利用所述Quantity One圖像處理軟件，經過高斯建模后，以高斯建模后的trace值作 為蛋白質的最終trace值。
[0016] 較佳地，所述計算的方法為：分別將待檢樣品上樣液中a-酪蛋白、￠-酪蛋白、 K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白的trace值除以在酪蛋白標準品上 樣液或乳清蛋白標準品上樣液中各蛋白對應的trace值，再分別乘以在酪蛋白標準品上樣 液或乳清蛋白標準品上樣液中各蛋白所對應的質量，分別計算出待檢樣品中6種蛋白的質 量；最后通過待檢樣品中3種乳清蛋白，即血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白的質 量之和，與6種蛋白，S卩a-酪蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和 3 _乳球蛋白的質量之和的比值計算得出乳清蛋白占總蛋白的百分比。
[0017] 以血清白蛋白、a-酪蛋白為例，其質量的計算公式為：
[0018] M待檢樣品（血清白蛋白）
[0019] =待檢樣品中血清白蛋白的trace值
[0020] /乳清蛋白標準品中血清白蛋白的trace值
[0021] X乳清蛋白標準品中血清白蛋白的上樣量（ilg)
[0022] M待檢樣品（a-酪蛋白）
[0023] =待檢樣品中a -酪蛋白的trace值
[0024] /酪蛋白標準品中a -酪蛋白的trace值
[0025] X酪蛋白標準品中a -酪蛋白的上樣量（ii g)
[0026] 乳清蛋白占總蛋白的百分比的計算公式為：
[0027] 乳清蛋白占總蛋白的百分比（％ )
[0028] =E M待檢樣品（血清白蛋白+a -乳白蛋白
[0029] +3 _乳球蛋白）/ E M待檢樣品（血清白蛋白+a -乳白蛋白
[0030] +P _乳球蛋白+a -酪蛋白+P -酪蛋白+K -酪蛋白）
[0031] 在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實 例。
[0032] 本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0033] 本發明的積極進步效果在于：1、待檢樣品預處理簡單易行，只需要對乳基嬰幼兒 配方粉進行簡單地復原，即可加入上樣緩沖液配制成待檢樣品的上樣液用于進行聚丙烯酰 胺凝膠電泳實驗。簡化了乳清蛋白含量的檢測步驟，易于操作，節省時間，檢測費用低，對實 驗儀器要求低，普通實驗室即能開展檢測工作。2、酪蛋白標準品和乳清蛋白標準品上樣液 的上樣量在一定的范圍內，能實現準確的檢測待檢樣的乳清蛋白含量，無需制作標準曲線 既能實現準確檢測乳清蛋白的含量，且SDS-PAGE圖譜中6種蛋白質（a -酪蛋白、P -酪蛋 白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白）的條帶均清晰可辨。因此該檢 測方法的準確度高、可操作性高，且不會因為上樣量的苛刻要求而造成實驗的準確度降低。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034] 圖1為酪蛋白標準品和乳清蛋白標準品的SDS-PAGE圖譜。
[0035] 圖2為酪蛋白標準品和乳清蛋白標準品SDS-PAGE膠的光密度掃描圖譜。
[0036] 圖3為乳基嬰幼兒配方粉的SDS-PAGE圖譜。
[0037] 圖4為乳基嬰幼兒配方粉SDS-PAGE膠的光密度掃描圖譜。
[0038] 圖5為自配乳基嬰幼兒配方粉乳清蛋白檢測的SDS-PAGE圖譜。其中：a為酪蛋 白標準品；b為乳清蛋白標準品；1.乳清蛋白/酪蛋白為75:25 ;2.乳清蛋白/酪蛋白為 70:30 ;3.乳清蛋白/酪蛋白為65:35 ;4.乳清蛋白/酪蛋白為60:40 ;5.乳清蛋白/酪蛋 白為55:45 ;6.乳清蛋白/酪蛋白為50:50,所述比例為質量比。
[0039] 圖6為編號1?6的市售乳基嬰兒配方粉乳清蛋白檢測的SDS-PAGE圖譜。其中：a為酪蛋白標準品；b為乳清蛋白標準品；編號1?6表示6份不同的市售乳基嬰兒配方粉。
[0040] 圖7為編號7?12的市售乳基嬰幼兒配方粉乳清蛋白檢測的SDS-PAGE圖譜。其 中：a為酪蛋白標準品；b為乳清蛋白標準品；標號7?12表示6份不同的市售乳基嬰兒配 方粉。
[0041] 圖8為乳基嬰幼兒配方粉乳清蛋白檢測的SDS-PAGE圖譜
[0042] 圖9為自配乳清蛋白：酪蛋白為50:50的乳基嬰幼兒配方粉乳清蛋白檢測的 SDS-PAGE圖譜，所述比例為質量比。其中：a為酪蛋白標準品；b為乳清蛋白標準品；標號1 表不乳清蛋白：釀蛋白為50:50的乳基嬰幼兒配方粉。
[0043] 圖10為自配乳清蛋白：酪蛋白為75:25的乳基嬰幼兒配方粉乳清蛋白檢測的 SDS-PAGE圖譜，所述比例為質量比。其中：a為酪蛋白標準品；b為乳清蛋白標準品；標號1 表示乳清蛋白：酪蛋白為75:25的市售乳基嬰兒配方粉。
【具體實施方式】
[0044] 下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實 施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0045] 如下實施例，所使用的試劑包括：標準品a-酪蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血 清白蛋白、ct -乳白蛋白和P -乳球蛋白購自美國sigma公司；丙烯酰胺（Acr)、Tris、N-N 甲叉雙丙烯酰胺（Bis)、N，N，N'，N' -四甲基乙二胺（TEMED)、十二烷基硫酸鈉（SDS)、過硫酸 銨（Ap)和巰基乙醇購自上海迪申生物；冰醋酸、甲醇、甘油、考馬斯藍R-250,溴酚藍和甘氨 酸購自國藥集團。市售嬰兒配方粉，從市場上購買獲得。
[0046] 所用的儀器包括：Mini-PROTEAN Tetra Cell 電泳槽、164-5050 Powerpac Basic 電泳儀和Gel Doc? XR+成像系統均購自美國Bio-Rad公司。分析天平購自梅特勒-托利 多集團。
[0047] 所述的2 X SDS-PAGE上樣緩沖液的pH值為6. 8,含有Tris-HCL lOOmM，SDS 0. 05kg/L，溴酚蘭0. 002kg/L，P -巰基乙醇0. lkg/L，甘油20 %，所述百分比為體積百分比。 [0048] 實施例1酪蛋白標準品、乳清蛋白標準品上樣液的制備和酪蛋白標準品、乳清蛋 白標準品的SDS-PAGE檢測
[0049] ①酪蛋白標準品、乳清蛋白標準品上樣液的制備
[0050] 酪蛋白標準品混合樣：將a-酪蛋白、￠-酪蛋白和K-酪蛋白以4:3:1(質量比） 的比例配制成終蛋白濃度為I. 70mg/mL的水溶液即可；
[0051] 乳清蛋白標準品混合樣：將@ _乳球蛋白、a -乳白蛋白和血清白蛋白以 8:3:1(質量比）的比例配制成終蛋白濃度為1.43mg/mL水溶液即可。
[0052] 所述酪蛋白標準品混合樣和所述乳清蛋白標準品混合樣分別和2XSDS-PAGE上 樣緩沖液等體積混合均勻，水浴煮沸3min，然后迅速移入到冰水中冷卻，即得所述酪蛋白標 準品上樣液和所述乳清蛋白標準品上樣液，可以用于后續檢測。
[0053] ②酪蛋白標準品、乳清蛋白標準品的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析
[0054] 所述酪蛋白標準品上樣液和所述乳清蛋白標準品上樣液的上樣量均為5 y L。分析 條件為：40mA恒流電泳40min后，電流調為30mA恒流電泳至藍色條帶距膠底部0. 5cm處為 止，即得電泳膠。所述電泳的電泳液pH值為8. 6,包含Tris 25mM/L，甘氨酸192mM/L，SDS lg/L〇
[0055] ③染色與脫色
[0056] 移出步驟②所述的電泳膠，用0. 1 %的考馬斯亮藍染色液染色約I. 5h，即得染色 的凝膠。所述0. 1%的考馬斯亮藍染色液為，冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考馬斯亮藍R-250 〇. 1 %的水溶液，所述百分比為質量百分比。
[0057] 將所述染色的凝膠，用脫色液脫色至背景透明，即得脫色的凝膠。所述脫色液為： 冰醋酸7. 5%，甲醇10%的水溶液，所述百分比為質量百分比。
[0058] ④成像
[0059] 將步驟③所述的脫色的凝膠置于凝膠成像系統內，用Quantity One圖像處理軟件 成像。圖1即為酪蛋白標準品和乳清蛋白標準品的SDS-PAGE圖譜。由圖1可知酪蛋白混 合標準品（a -酪蛋白、P -酪蛋白和K -酪）和乳清蛋白混合標準品（血清白蛋白、a -乳 白蛋白和￠-乳球蛋白）中各蛋白質在如上所述電泳條件下都實現了很好的分離。
[0060] 圖2為酪蛋白標準品和乳清蛋白標準品SDS-PAGE膠的光密度掃描圖譜。如圖2 所示，掃描圖譜中a-酪蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳 球蛋白實現了很好的分離。圖譜中K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白 的單峰，說明這四種蛋白質與其它蛋白質實現了完全分離。
[0061] 實施例2乳基嬰幼兒配方粉上樣液的制備和乳基嬰幼兒配方粉的SDS-PAGE檢測
[0062] ①乳基嬰幼兒配方粉上樣液的制備
[0063] 所述乳基嬰幼兒配方粉為光明乳業市售的培兒貝瑞1段產品。
[0064] 將所述乳基嬰幼兒配方粉攪拌并充分溶解于超純水中，攪拌使所述乳基嬰幼兒配 方粉充分溶解使其蛋白質含量的終濃度為2mg/mL，然后和2X SDS-PAGE上樣緩沖液等體積 混合均勻，水浴煮沸2min，迅速移入到冰水中冷卻，即得所述乳基嬰幼兒配方粉上樣液，可 以用于后續檢測。
[0065] ②乳基嬰幼兒配方粉的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析
[0066] 所述乳基嬰幼兒配方粉上樣液的上樣量為4yL。分析條件為：40mA恒流電泳 40min后，電流調為30mA恒流電泳至藍色條帶距膠底部0. 5cm處為止，即得電泳膠。所述電 泳的電泳液口!1值為8.6，包含1^8 251111/1，甘氨酸1921111/1，503 18/1。
[0067] ③染色與脫色
[0068] 移出步驟②所述的電泳膠，用0. 1 %的考馬斯亮藍染色液染色約I. 5h，即得染色 的凝膠。所述0. 1%的考馬斯亮藍染色液為，冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考馬斯亮藍R-250 0. 1 %的水溶液，所述百分比為質量百分比。
[0069] 將所述染色的凝膠，用脫色液脫色至背景透明，即得脫色的凝膠。所述脫色液為， 冰醋酸7. 5%，甲醇10%的水溶液，所述百分比為質量百分比。
[0070] ④成像
[0071] 將步驟③所述的脫色的凝膠置于凝膠成像系統內，用Quantity One圖像處理軟件 成像，經過高斯建模后，以高斯建模后的trace值作為蛋白質的最終trace值。
[0072] 圖3即為所述乳基嬰幼兒配方粉的SDS-PAGE圖譜。由圖3可知乳基嬰幼兒配方 粉內主要的6種蛋白質（a -酪蛋白、￠-酪蛋白、K -酪蛋白、血清白蛋白、a -乳白蛋白和 3 _乳球蛋白）在如上所述電泳條件下實現了很好的分離。
[0073] 圖4即為所述為乳基嬰幼兒配方粉SDS-PAGE膠的光密度掃描圖譜。如圖4所示， 掃描圖譜中a-酪蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋 白實現了很好的分離。其中K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白在掃描 圖譜中是單峰說明這四種蛋白質與其它蛋白質實現了完全分離。以上實驗結果表明，該方 法適合乳粉內主要蛋白質的電泳分離，且能達到理想的效果。
[0074] 實施例3自配乳基嬰幼兒配方粉的SDS-PAGE檢測和乳清蛋白含量測定
[0075] ①自配乳基嬰幼兒配方粉的上樣液的制備
[0076] 以生產嬰幼兒奶粉的生產工藝，生產乳清蛋白含量不同的配方粉。共設計6個不 同乳清蛋白含量（乳清蛋白：酪蛋白分別為50 :50,55 :45,60 :40,65 :35,70 :30和75 :25， 所述比例為質量比）的配方粉。將所述自配乳基嬰幼兒配方粉攪拌并充分溶解于超純水 中并控制其蛋白質含量的終濃度為3mg/mL，然后和2XSDS-PAGE上樣緩沖液等體積混合均 勻，水浴煮沸5min，迅速移入到冰水中冷卻，即得所述自配乳基嬰幼兒配方粉上樣液，可以 用于后續檢測。
[0077] ②自配乳基嬰幼兒配方粉的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析
[0078] 所述自配乳基嬰幼兒配方粉上樣液的上樣量為4 y L。取實施例1獲得的酪蛋白標 準品上樣液和乳清蛋白標準品上樣液，所述酪蛋白標準品上樣液和所述乳清蛋白標準品上 樣液的上樣量均為5 ii L。分析條件為：40mA恒流電泳40min后，電流調為30mA恒流電泳至 藍色條帶距膠底部0. 5cm處為止，即得電泳膠。所述電泳的電泳液pH值為8. 6,包含Tris 25mM/L，甘氨酸 192mM/L，SDS lg/L。
[0079] ③染色與脫色
[0080] 移出步驟②所述的電泳膠，用〇. 1 %的考馬斯亮藍染色液染色約I. 5h，即得染色 的凝膠。所述0. 1%的考馬斯亮藍染色液為，冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考馬斯亮藍R-250 0. 1 %的水溶液，所述百分比為質量百分比。
[0081] 將所述染色的凝膠，用脫色液脫色至背景透明，即得脫色的凝膠。所述脫色液為， 冰醋酸7. 5%，甲醇10%的水溶液，所述百分比為質量百分比。
[0082] ④成像
[0083] 將步驟③所述的脫色的凝膠置于凝膠成像系統內，用Quantity One圖像處理軟件 成像，經過高斯建模后，以高斯建模后的trace值作為蛋白質的最終trace值分析記錄各泳 道的蛋白質條帶trace值，對照標準蛋白質條帶的trace值和上樣量（ii g)即可以計算乳 清蛋白與總蛋白質的比例。
[0084] 圖5即為所述自配乳基嬰幼兒配方粉的SDS-PAGE圖譜。由圖5可知乳清蛋白含 量不同的乳基嬰幼兒配方粉、酪蛋白標準品和乳清蛋白標準品內主要的6種蛋白質（a-酪 蛋白、￠-酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白）在如上所述電 泳條件下實現了很好的分離。
[0085] ⑤計算乳清蛋白含量
[0086] 乳清蛋白占總蛋白的百分比的計算公式為：
[0087] 乳清蛋白占總蛋白的百分比（％ )
[0088] =E M待檢樣品（血清白蛋白+a -乳白蛋白
[0089] +3 _乳球蛋白）/ E M待檢樣品（血清白蛋白+a -乳白蛋白
[0090] +P _乳球蛋白+a -酪蛋白+P -酪蛋白+K -酪蛋白）
[0091] 其中：
[0092] M待檢樣品（X)
[0093] =待檢樣品中X的trace值/A中X的trace值
[0094] XA中X的上樣量（y g)
[0095] X :代表不同的蛋白質（a-酪蛋白、P -酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳 白蛋白或乳球蛋白）；A:代表乳清蛋白標準品或酪蛋白標準品。
[0096] 如待檢樣品中a-酪蛋白的質量的計算公式如下：
[0097] M待檢樣品a-酪蛋白）
[0098] =待檢樣品中a -酪蛋白的trace值
[0099] /酪蛋白標準品中a -酪蛋白的trace值
[0100] X酪蛋白標準品中a -酪蛋白的上樣量（ii g)
[0101] A標準品中X的上樣量（]i g)
[0102] = A標準品上樣量（ii g) X X在A標準品中所占的比例
[0103] 如酪蛋白標準品中a -酪蛋白的上樣量：
[0104] 酪蛋白標準品中a -酪蛋白的上樣量（iig)
[0105] =酪蛋白標準品的上樣量（y g) X [V(l+3+4)]
[0106] 所述酪蛋白標準品和乳清蛋白標準品的上樣量的質量分別為4.25 yg和 3. 575 u g〇
[0107] 自配乳基嬰幼兒配方粉內乳清蛋白含量的測定結果如表1所示：
[0108] 表1自配乳基嬰幼兒配方粉內乳清蛋白含量的測定
【權利要求】
1. 一種測定乳基嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法，其特征在于，所述方法包括以 下的步驟： ① 待檢樣品上樣液的制備：將待檢樣品攪拌并充分溶解于去離子水中，然后與 SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，水浴煮沸，迅速移入到冰水中冷卻，即得所述待檢樣品上樣 液；所述待檢樣品指非水解的乳基嬰幼兒配方粉； ② 酪蛋白標準品和乳清蛋白標準品上樣液的制備：將a-酪蛋白、￠-酪蛋白和k-酪 蛋白溶解于水得酪蛋白標準品的混合樣；將0 _乳球蛋白、a _乳白蛋白和血清白蛋白溶解 于水得乳清蛋白標準品的混合樣；將所述酪蛋白標準品的混合樣和所述乳清蛋白標準品的 混合樣分別和SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，水浴煮沸，然后迅速移入到冰水中冷卻，即 得酪蛋白標準品上樣液和乳清蛋白標準品上樣液； ③ 聚丙烯酰胺凝膠電泳：將步驟①所述待檢樣品上樣液、步驟②所述酪蛋白標準品上 樣液和所述乳清蛋白標準品上樣液上樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，得聚丙烯酰胺凝膠； ④ 染色與脫色：移出步驟③所述的聚丙烯酰胺凝膠，用染色液染色即得染色的凝膠； 將所述染色的凝膠用脫色液脫色至背景透明，即得脫色的凝膠； ⑤ 成像與計算：將步驟④所述脫色的凝膠置于凝膠成像系統內，用圖像處理軟件分析 記錄所述待檢樣品對應泳道各條帶的trace值，對照所述酪蛋白標準品和所述乳清蛋白標 準品對應泳道各條帶的trace值，并根據步驟③所上樣的酪蛋白標準品或乳清蛋白標準品 的質量，計算所述待檢樣品中乳清蛋白占總蛋白的比例，所述的trace值為SDS-PAGE的光 密度掃描圖譜內蛋白質對應峰的峰面積。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟①中，所述水為去離子水；所述待檢樣 品上樣液的蛋白質含量的終濃度在2mg/mL?4mg/mL范圍內；所述SDS-PAGE上樣緩沖液 為2 X SDS-PAGE上樣緩沖液；所述2 X SDS-PAGE上樣緩沖液的pH值為6. 8,含有Tris-HCL lOOmM，SDSO. 05kg/L，溴酚蘭0? 002kg/L，0 -巰基乙醇0? lkg/L，甘油20 %，所述百分比為體 積百分比；和/或，所述煮沸的時間為2?8min。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟①中，所述水為超純水；所述待檢樣品 上樣液的蛋白質含量的終濃度為3mg/mL ;和/或，所述煮沸的時間為3?5min。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟②中，所述酪蛋白標準品混合樣由包 括以下步驟的方法制備而得：將a-酪蛋白、￠-酪蛋白和k-酪蛋白以質量比4:3:1的 比例溶解于水獲得終蛋白濃度為1. 70mg/mL的水溶液，即得酪蛋白標準品混合樣；所述 乳清蛋白標準品混合樣由包括以下步驟的方法制備而得：將￠-乳球蛋白、乳白蛋白 和血清白蛋白以質量比8:3:1的比例溶解于水獲得終蛋白濃度為1.43mg/mL的水溶液， 即得乳清蛋白標準品混合樣；所述SDS-PAGE上樣緩沖液為2XSDS-PAGE上樣緩沖液，所 述2XSDS-PAGE上樣緩沖液的pH值為6. 8,含有Tris-HCL lOOmM，SDSO. 05kg/L，溴酚蘭 0.002kg/L，￠-巰基乙醇0. lkg/L，甘油20%，所述百分比為體積百分比；和/或，所述煮沸 的時間為2?8min。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟②中，所述煮沸的時間為3?5min。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟③中，所述待檢樣品上樣液的上樣量為 2?6 y L ;所述酪蛋白標準品上樣液的上樣量為2?8 y L ;所述乳清蛋白標準品上樣液的 上樣量為2?8 y L ;所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳的條件為35?45mA恒流電泳30?50min 后，電流調為25?35mA恒流，電泳至藍色條帶距膠底部0. 5cm處；所述聚丙烯酰胺凝膠電 泳的電泳液pH值為8. 6,含有Tris 25mM/L，甘氨酸192mM/L，SDS lg/L ;和/或，所述聚丙 烯酰胺凝膠電泳的凝膠為5%的濃縮膠或12%的分離膠，所述百分比為質量體積百分比。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟③中，所述待檢樣品上樣液的上樣量為 4U L ;所述酪蛋白標準品上樣液的上樣量為5 y L ;所述乳清蛋白標準品上樣液的上樣量為 5 y L ;和/或，所述聚丙烯酰胺凝膠電泳的條件為40mA恒流電泳40min后，電流調為30mA 恒流，電泳至藍色條帶距膠底部0. 5cm處。
8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟④中，所述的染色液為考馬斯亮藍染色 液；所述的脫色液為冰醋酸7. 5%、甲醇10%的水溶液，所述百分比為質量百分比；和/或， 所述的染色的時間為1?2小時。
9. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟④中，所述的染色液為0. 1 %的考馬 斯亮藍染色液，所述〇. 1 %的考馬斯亮藍染色液為冰醋酸7. 5%，甲醇10%，考馬斯亮藍 R-2500. 1 %的水溶液，所述百分比為質量百分比；和/或，所述的染色的時間為1. 5小時。
10. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟⑤中，所述的圖像處理軟件為 Quantity One圖像處理軟件；所述峰面積的獲得是利用所述Quantity One圖像處理軟件， 經過高斯建模后，以高斯建模后的trace值作為蛋白質的最終trace值；所述計算的方法 為：分別將待檢樣品上樣液中a-酪蛋白、￠-酪蛋白、k-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白 蛋白和￠-乳球蛋白的trace值除以在酪蛋白標準品上樣液或乳清蛋白標準品上樣液中各 蛋白對應的trace值，再分別乘以在酪蛋白標準品上樣液或乳清蛋白標準品上樣液中各蛋 白所對應的質量，分別計算出待檢樣品中6種蛋白的質量；最后通過待檢樣品中3種乳清蛋 白，即血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白的質量之和，與6種蛋白，S卩a-酪蛋白、 酪蛋白、K-酪蛋白、血清白蛋白、a-乳白蛋白和￠-乳球蛋白的質量之和的比值計算 得出乳清蛋白占總蛋白的百分比。
【文檔編號】G01N33/68GK104360078SQ201410722848
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年12月2日 優先權日:2014年12月2日
【發明者】賈宏信, 郭本恒 申請人:光明乳業股份有限公司