乳腺癌分子探針及其制造方法

乳腺癌分子探針及其制造方法
【專利摘要】本發明公開了一種乳腺癌分子探針，由信號組件和親和組件構成，其特征在于其親和組件是對乳腺癌干細胞靶點特異性結合的組件；信號組件是由近紅外熒光信號單元和磁共振信號單元組成。其制備方法為：采用化學共價偶聯方法將信號功能單元與乳腺癌干細胞的特異性表面標志物單克隆抗體偶聯，再經過純化。本發明是對乳腺癌干細胞多靶點特異結合的分子探針，通過該分子探針能夠解決對乳腺癌干細胞的在體檢測和定量分析，為實體腫瘤干細胞成像診斷和靶向治療療效評估新策略提供依據，為腫瘤早期診斷和分級提供“新模式”，為腫瘤治療提供精確信息和評估方法，并為進一步解決復發、轉移問題墊定診斷信息基礎。
【專利說明】乳腺癌分子探針及其制造方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于醫學成像【技術領域】，具體來說是一種分子探針，特別是一種乳腺癌分子探針，用于醫學上乳腺癌診斷和治療的成像。

【背景技術】
[0002]乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率占全身各種惡性腫瘤的7-10%，在婦女僅次于子宮癌，已成為威脅婦女健康的主要病因。它是一種通常發生在乳房腺上皮組織，嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤之一。乳腺癌男性罕見，僅約1-2%的乳腺患者是男性。
[0003]乳腺癌的治療原則臨床上對早、中期以手術治療為首選，采用根治性切除為主。中、晚期以綜合治療為主。癌癥治療中的放、化療的副作用給病人正常機體帶來的傷害和痛苦是有目共睹的。
[0004]對于癌癥的治療，早發現早治療的效果要優于晚期治療。然而，乳腺癌的早期可無癥狀，隨著病情發展，可能表現出局部及全身癥狀。例如腫塊、疼痛、乳房皮膚改變、乳腺輪廊改變、乳頭乳暈改變、乳頭溢液、區域淋巴結腫大以及遠處轉移表現等。因此，對于乳腺癌的早期準確診斷，是早發現和有效治療的基礎和保障。乳腺癌的診斷方法很多，傳統方法主要包括:X線診斷、超聲顯像檢查、細胞學及組織學診斷等，這些方法雖然在乳腺癌的常規檢測中發揮了重要作用，但其檢測的都是疾病終末期的解剖改變，難以實現真正意義上的早期診斷。
[0005]分子影像學是采用高精度影像成像技術，無創性地對活體內參與生理或病理過程的分子、基因和細胞的變化進行可視化的定性和定量檢測。分子影像學主要應用領域是腫瘤學，其基本策略是向體內引入能與靶標特異結合的分子探針(由信號組件和親和組件兩部分構成)，通過直接檢測探針上的信號組件，或者間接檢測分子探針在細胞內外作用后的產物，獲得分子信息，以達到示蹤和診斷目的。分子影像學是在真實、完整的生理環境中通過圖像直接監視細胞和分子通路，對生物活動的發生、發展過程進行實時成像。分子影像技術與傳統方法相比可以更好地在分子水平研宄疾病的機制和特征，可以活體上早期、連續地觀測治療機制和療效，是一種真正的癌癥早期檢測手段，對提高診斷和治療效果，減少復發率，降低死亡率都具有重量意義。
[0006]分子影像中的關鍵技術是分子探針的制備和應用。分子探針是指對某一特定生物分子(如蛋白、DNA和RNA)具有特異性的、并能進行體內或體外示蹤的標記化合物分子，這些標記化合物分子能夠在體或離體反映其靶生物分子的量或功能。分子探針通常由信號組件和親和組件兩部分構成。信號組件是指能產生影像學信號且能被高精度成像技術探測的對比劑或標記物部分(如放射性核素、熒光素或順磁性分子)，親和組件是與成像靶點特異性結合的部分(如配體或抗體等)。
[0007]李緒斌等用化學偶聯法，將超順磁性氧化鐵顆粒(SP1)與生長激素抑制素類似物奧曲肽(OCT)偶聯，制備對乳腺癌細胞表皮長生激素受體(SSTR)的特異性結合的磁共振分子探針SP1-OCT，該分子探針細胞陽性標記率達到96.15% (北京大學學報醫學版，Vol.41Νο.2Apr.2009)。
[0008]朱媛等以乳腺癌表皮生長因子受體2 (HER2)為靶點，制備以順磁性粒子釓為載體的磁共振(MR)分子探針，通過MR靶向成像為乳腺癌個體化治療提供影像學依據。材料與方法利用課題組前期制備的針對HER2的熒光標記探針FITC-LTVSPWY與釓噴替酸葡甲胺(Gd-DTPA)偶聯獲得MR靶向探針(“乳腺癌HER2靶向分子探針的制備及體外MRI初步研宄”，《中國醫學影像學雜志》2014年22卷第5期)。
[0009]中國專利文獻CN102399772A公開了對質粒DNA進行熒光標記，獲得HER2、T0P2A、AGTRE基因探針。
[0010]然而，目前公布的乳腺癌分子探針，還普通具有如下不足:(I)獲得的分子影像不能更全面反映乳腺癌的生物學行為，基于目前分子探針成像技術進行診斷和治療，乳腺癌復發率高，放化療效果不佳。(2)目前的不同乳腺癌分子探針其成像各有不足。其中熒光成像雖然無創、敏感性高，可進行在體實時多目標成像，但存在空間分辨率低、解剖背景不清晰的弱點。與之相反，磁共振成像具有極高的空間分辨力和組織分辨力、無創、無輻射，但是敏感性相對較差。(3)乳腺癌等大多數腫瘤是多基因性疾病，平均每個腫瘤病人有8-10個與腫瘤有關的基因異常變異，當前采用單一靶標的腫瘤或腫瘤干細胞靶向治療多數療效不佳。
[0011]隨著乳腺癌干細胞(breast cancer stem cell，BCSC)的成功分離、鑒定，和對其生理作用和過程的研宄，表明乳腺癌細胞中存在著一部分具有自發更新、多向分化潛能以及高度致瘤能力的細胞亞群一一乳腺癌干細胞。乳腺癌干細胞在乳腺癌組織中占比小(平均約2-9% )，在轉移灶或轉移性淋巴結中絕對含量更少，因此其檢測難度大。但其與腫瘤侵襲轉移、復發和治療抵抗密切相關(“乳腺癌干細胞的研宄進展”，劉明明等，《中國癌癥雜志》，2013年第23卷第8期)。根據2012年2月13日發表在《干細胞》期刊上的一篇文章，美國加州大學舊金山分校的研宄人員第一次報道了放射療法在殺死腫瘤細胞同時，也能夠將其他癌細胞轉變為抵抗治療的乳腺癌干細胞。而一些研宄人員認為乳腺癌干細胞是乳腺癌復發的唯一來源。然而，雖然乳腺癌干細胞的分離和鑒別，以及對其作用的研宄已經取得了許多科研成果，但還未有報道有對乳腺癌干細胞靶向成像的分子探針，因此提供一種能夠對乳腺癌干細胞靶向成像的分子探針，以解決乳腺癌干細胞活體成像和定量分析，為乳腺癌的早期診斷和療效評估提供新方法，為乳腺癌靶向治療提供新策略，具有重要意義。


【發明內容】

[0012]有鑒于此，本發明的目的在于提供一種新型的乳腺癌分子探針，通過對乳腺癌干細胞靶向分子成像，為乳腺癌的早期診斷和療效評估提供新方法，為乳腺癌干細胞和/或乳腺癌靶向的腫瘤治療提供新策略。
[0013]本發明采用的技術該案為:一種乳腺癌分子探針，由信號組件和親和組件構成，其特征在于其親和組件是對乳腺癌干細胞靶點特異性結合的組件，信號組件是由近紅外熒光信號單元和磁共振信號單元組成。雖然乳腺癌分子探針的信號組件可以為現有分子影像學中已有的信號組件，但本發明考慮到輻射對活體的影響問題，以及為解決單一熒光成像和單一磁共振成像在分辨力和敏感性上的不足，本發明優選熒光-磁共振雙模態成像，即所述信號組件是將適用于分子探針的熒光物質與磁共振成像物質偶合成一體的信號組件制成雙模態分子探針。
[0014]進一步地，所述親和組件是乳腺癌干細胞的特異性表面標志物⑶44+、ESA+或CD24-中的配體。由于其他細胞膜上沒有或極少有CD44+與ESA+，故選擇此兩個靶標能使本探針靶向特異性高。優選CD44+和/或ESA+配體，特別是選用特異性更好的CD44單克隆抗體CD44_和/或ESA單克隆抗體ESA mAb，采用抗原-抗體特異性結合的分子成像策略。
[0015]由于普通熒光穿透活體組織能力比較弱，本發明優選波長在700nm-1200nm的近紅外熒光材料作為信號組件，該波長范圍內的近紅外熒光對組織的穿透力強，而此范圍內生物組織本身的自發熒光較弱，從而避免背景干擾，提高檢測靈敏度。近紅外熒光組件可以是有機熒光染料，最好是用具有優異光學性質的量子點(quantum dots, QDs)作為熒光材料，QDs是由I1-VI族或II1-V族或1-1I1-VI族元素組成的、直徑約Inm-lOnm、能夠接受激發光產生熒光的半導體納米晶粒，QDs克服了以往常用于細胞和生物分子熒光標記成像的有機染料分子的較大缺陷(激發光譜窄、發射光譜很寬且不對稱；熒光譜峰之間很大重疊，限制了可同時應用的熒光探針數量；光穩定性差、易發生光漂白和光解，光解產物對生物分子往往有殺傷作用等)，具有激發光譜寬且連續分布，可以用各種不同波長的光進行激發；發射光譜窄、對稱而不重疊；光穩定性好、顏色豐富可調等多種優勢。其中波長650nm-900nm的近紅外QDs相對較易合成，能承受多次的激發和光發射，有持久的光化學穩定性，能夠在體內外長時間的連續成像觀測。同時由于近紅外QDs的熒光波長可以根據量子點粒徑大小進行精確調節，因此是可視化區分不同靶標的最佳探針。
[0016]進一步地，本發明的較佳實施例，是將不同粒徑的QDs標記不同靶標，在同一激發光下可呈現不同顏色的熒光，從而實現多靶向分子成像。
[0017]在現有的QDs中，研宄發現含鎘QDs (如CdTe)含有輕毒性，為提高分子探針的安全性，本發明優選非鎘近紅外QDsJn InP、CuInS。本發明QDs優選采用Zn-Cu-1n-S核量子點，最優選的是還可對該核量子點進行表面無機層(如ZnS)包覆，形成的核殼近紅外QDs，可提高核殼量子點的熒光效率和光化學穩定性。
[0018]對于磁共振分子成像探針信號組件可以用超順磁性氧化鐵(SP1)和順磁性釓(Gd3+)。本發明人在本項研宄中發現，SP1納米顆粒具有很強的光吸收性，對與其偶合的QDs熒光有較強的淬滅效應，影響QDs體內熒光成像效果。因此本發明優選順磁性釓(Gd3+)作為雙模態分子探針的MR成像信號功能單元。
[0019]作為本發明優選實施例，本發明將Gd3+作和近紅外QDs兩個功能單元，組裝成優勢互補的焚光效率高、順磁性好的近紅外非鎘量子點納米顆粒(paramagnetic QDs, pQDs)作為雙模態探針的信號組件。同時選取不同粒徑(對應不同發射波長)的近紅外非鎘QDs分別與Gd3+)構建雙模態分子探針標記不同靶標，實現多靶向分子雙模態成像。
[0020]為實現多靶向分子成像，本發明優選的親和組件是基于特異性表面標志物CD44+和ESA+的配體，將⑶44_和ESAmAb兩種單克隆抗體分別與不同波長的近紅外pQDs偶聯，形成BCSC靶向的兩種雙模態分子探針，其不同波長的近紅外pQDS選擇波長如700nm和800nm兩種，分別表示為pQD700、pQD800，對應地本發明的兩種雙模態分子探針為pQD.-⑶44mAb和PQD80O-ESAiiia13,或者為 pQD.-CDA^b和 pQD 7(l(l_ESAmiib。
[0021]對于雙模態探針，在偶聯前，需要磁共振成像材料先偶合在熒光材料表面。例如在偶合前先通過在QDs表面修飾Gd3+螯合劑DOTA，將Gd3+螯合在納米QDs表面。本方法通過在QDs表面修飾Gd3+螯合劑DOTA，提供高密度的Gd3+結合位點，減少了 Gd3 +旋轉來提高其弛預速率，提高敏感性。
[0022]在本發明的一種較佳實施例中，為躲避網狀內皮系統的捕捉，增加探針在體內循環的時間，消除在非病灶部位的非特異性吸附，降低本底信號和假陽性，還用高分子材料如聚乙二醇(PEG)、丙烯酸樹脂(PAA)或多羥基醇等對pQDs進行表面修飾。
[0023]本發明還提供了前述乳腺癌分子探針的制備方法:采用化學共價偶聯方法將熒光/磁共振雙信號功能單元與乳腺癌干細胞的特異性表面標志物偶聯，再經過純化。
[0024]本發明的技術效果和意義體現在如下幾個方面:
[0025](I)與現有公開的乳腺癌分子探針不同，本發明是對乳腺癌干細胞多靶點特異結合的分子探針，通過該分子探針能夠解決對乳腺癌干細胞的在體檢測和定量分析，為實體腫瘤干細胞成像診斷和靶向治療療效評估新策略提供依據，為腫瘤早期診斷和分級提供“新模式”，為腫瘤治療提供精確信息和評估方法，并為進一步解決復發、轉移問題墊定診斷信息基礎。
[0026](2)采用雙模態分子探針，使熒光和MR成像得以揚長避短和優勢互補，可成倍增加單個BCSC上信號組分的數量和密度，提高分子探針的敏感性和分辨率，能夠檢測更低含量甚至微量的BCSC。
[0027](3)采用多靶向技術，結合雙模態，能夠得到BCSC在活體上的位置、含量和分布等重要信息，并檢測前哨淋巴結中BCSC的重要信息，為手術方式的選擇、放療計劃等提供精確信息，為個性化治療提供依據。此外，依據BCSC滅活和殘存情況，來早期無創性評價治療療效，及時調整并加強針對BCSC的治療該案，能更有效預防乳腺癌復發和轉移。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為量子點的TEM圖。
[0029]圖2為Zn-Cu-1n-S及其Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點的熒光發射光譜。其中的插圖為Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點在不同發射波長下的熒光效率。
[0030]圖3為Zn-Cu-1n-S和Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點的熒光衰減圖。
[0031]圖2、3中的ZCIS為Zn-Cu-1n-S量子點的縮寫。
[0032]圖4為親水性非鎘Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點的體內活體熒光成像。
[0033]圖5a為對照組(QDs經PAA修飾但未螯合Gd3+) Tl測量圖；
[0034]圖5b為實驗組(pQDs，即QDs經PAA修飾且螯合Gd3+)的Tl測量；
[0035]圖5c為Tl加權成像(TR = 100ms, TE = 3.1ms)顯示，其中I為去離子水信號，II為未螯合Gd3+探針的QDs信號；111為pQDs信號。

【具體實施方式】
[0036]下面結合最佳實施例，以雙模態分子探針為例對本發明作進一步說明，以助于理解本發明的內容。
[0037]1、分子探針的制備
[0038]1.1順磁性量子點制備
[0039]1.1.1親油性量子點的制備
[0040]本實施例采用1-1I1-VI族元素(如銅，銦，硫，鋅等)，通過高溫油相法制備出單分散性好且結晶度高的Zn-Cu-1n-S核量子點。為獲得更具光穩定性的量子點，繼而對該核量子點進行表面無機層(如ZnS)包覆，提高核殼量子點的熒光效率和光化學穩定性。在設計殼層的組分和結構時需綜合考慮殼層與核量子點的晶格匹配參數，以及殼層材料的禁帶寬度，合理結構和組分的核殼量子點對外界物理、化學環境具有很強的抵抗作用，在親水性修飾過程中能很好的維持原有的熒光效率。具體合成過程如下:
[0041]Zn-Cu-1n-S核量子點制備過程:分別稱取醋酸銅(0.1mmol)，醋酸銦(0.2mmol)，醋酸鋅(0.1mmol)，量取0.5mL油酸，將其混合溶解在1mL十八烯中。整個混合體系抽真空30分鐘后通氬氣，再加熱到120攝氏度，直到混合體系變得光學透明，再加入1.0mL正十二烷基硫醇。反應繼續升溫到200攝氏度，再加入0.3mmol硫源(9.7mg溶解在0.5mL油胺和
1.0mL十八烯中)，整個體系維持在200攝氏度反應2小時。
[0042]Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點制備過程:先配置好殼層的鋅前體，即稱取0.1mmol的醋酸鋅，使其溶解在體積比(1/4)的油胺/十八烯溶液中。取上述得到的4.0mLZn-Cu-1n-S核量子點，再加入5mL十八烯和ImL正十二烷基硫醇，通氬氣30分鐘后開始加熱升溫到220攝氏度，再注入事先配置好的鋅前體，維持體系溫度在220攝氏度，反應I小時后降溫到室溫，加入無水乙醇，離心純化得到Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點。
[0043]采用高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM)、原子力顯微鏡(AFM)、光電子能譜、粒度分析儀、熒光和紫外-可見分光光度計等對量子點的形貌、結構、粒徑、光譜等進行表征。
[0044]由圖1可以看出，量子點的尺寸在4納米左右，尺寸均一。
[0045]由圖2和3可以看出，采用ZnS包裹后的核殼量子點比未包裹的核量子點熒光效率提高數倍，衰減速度明顯降低。
[0046]1.1.2量子點親水性改性
[0047]雙親性高分子的制備--聚(叔丁基丙烯酸脂乙基丙烯酸脂甲基丙烯酸)三嵌段共聚物與辛胺以1:40的摩爾比混合溶解在DMF中，加入偶聯劑EDC反應12h，得到的混合物透析純化，凍干后保存待用。
[0048]取適量的親油性量子點粉末和雙親性三嵌段高分子溶解在氯仿/乙醇混合溶液中，攪拌數小時以除去氯仿有機溶劑。再加入適量的PBS緩沖溶液，超聲分散3分鐘。所得到的溶液過0.22um膜以除去大量未結合的高分子，過膜后溶液變得光學透明。所得溶液過凝膠色譜柱(G200)，進一步除去未結合的高分子，最終得到純化好的親水性量子點。
[0049]1.1.3順磁性量子點制備
[0050]將親水性量子點與DOTA-NH2分子偶聯，再加入GdCl 3進行Gd3+螯合，獲得順磁性量子點。具體制備過程是:按照摩爾比1:100:4000將親水性量子點，DOTA-NH2和碳二亞胺鹽酸鹽混合，室溫反應2小時，超速離心純化得到QDs-DOTA。再在所獲得的QDs-DOTA基礎上，加入Gd3+，室溫螯合反應4小時，再經過超速離心純化得到順磁性量子點。
[0051]根據納米量子點粒徑不同，分別獲得pQD700、pQD800。
[0052]為考察本發明順磁性量子點的MR成像特性，進行MR成像實驗。如圖5所示，圖5a為對照組(QDs經PAA修飾但未螯合Gd3+) Tl測量。圖5b為實驗組(pQDs，即QDs經PAA修飾且螯合Gd3+)的Tl測量。兩者比較后發現，pQDs的Tl時間明顯縮短，弛豫率明顯升高。圖5c為Tl加權成像(TR = 100ms, TE = 3.1ms)顯示，pQDs信號強度(III)顯著高于去離子水(I)和未螯合Gd3+探針的QDs (II)。
[0053]1.2革El向乳腺癌干細胞的順磁性量子點制備
[0054]將順磁性量子點與單克隆抗體分子CD44mAb、ESAmAb偶聯，獲得可特異性識別乳腺癌干細胞的順磁性量子點。具體制備過程是:按照摩爾比1:10:4000將順磁性量子點，抗體和碳二亞胺鹽酸鹽混合，室溫反應2小時。超速離心純化得到靶向乳腺癌干細胞的順磁性量子點 pQDTOO-aMtAdP PQD800-ESA.。
[0055]2、活體測試
[0056]為了驗證本發明的分子探針用于BCSC多靶向雙模態成像效果和安全性，進行如下實驗:
[0057]2.1基于親水性非鎘Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點的體內活體熒光成像
[0058]將親水性Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點首先進行了細胞毒性實驗，結果表明所制備的親水性Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點具有良好的生物相容性。隨后進行了體內熒光成像的研宄，結果如圖4所示，結果表明制備的近紅外非鎘Zn-Cu-1n-S/ZnS核殼量子點可以進行活體熒光成像。
[0059]2.2安全性實驗
[0060]配置不同濃度的分子探針，經過細胞毒性3-(4，5-dimethylthiazol_2-yl)-2，5_diphenyltetrazolium bromide (MTT)試驗，本發明的分子探針具有很好的生物安全性。以Cu含量計算，Cu離子含量在2 μΜ，經過96小時共孵育，細胞存活率在95%以上。
[0061]2.3成像敏感性實驗
[0062]對裝有經雙模態分子探針標記但BCSC數目不同的(BCSC細胞數分別為1、5、I X 10\50,1 X 12U X 10\ I X 10\ I X 15)的Ep管分別行熒光成像、MR Tl成像，觀察并比較熒光成像、MR Tl成像能夠檢測的最低細胞數。實驗數據表明，熒光成像模式的最低可分辨的成像細胞個數為5 ；MR Tl成像模式的最低可分辨的成像細胞個數為50。
[0063]2.4靶向特異性實驗
[0064]以⑶44-/ESA-的乳腺癌細胞做對照，將BCSC分別與pQD700_⑶44mAb雙模態分子探針、PQD700共培養孵育，洗滌后與熒光顯微鏡下觀測BCSC和CD44-/ESA-的乳腺癌細胞的熒光信號，再分別行MR TlW成像，評價熒光信號與磁共振信號是否一致，并判斷該探針的靶向性能。對PQDSOO-ESAmAb雙模態分子探針同樣進行上述實驗。經過細胞靶向成像實驗，本發明的雙模態分子探針具有優異的靶向性檢測效果。
【權利要求】
1.一種乳腺癌分子探針，由信號組件和親和組件構成，其特征在于其親和組件是對乳腺癌干細胞靶點特異性結合的組件；信號組件是由近紅外熒光信號單元和磁共振信號單元組成。
2.如權利要求1所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述親和組件是乳腺癌干細胞的特異性表面標志物⑶44+和/或23八—的配體。
3.如權利要求1所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述親和組件是0)44單克隆抗體⑶44-和/或單克隆抗體
4.如權利要求3所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述熒光信號單元為近紅外量子點。
5.如權利要求4所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述近紅外量子點為211-011-111-8非錦量子點。
6.如權利要求4所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述近紅外量子點為211-011-111-8核量子點外包括有2113的核殼結構量子點。
7.如權利要求4所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述磁共振信號材料為順磁性釓。
8.如權利要求5所述的乳腺癌分子探針，其特征在于:所述探針為多靶向雙模態分子探針，為和？卯口叫與？卯2在近紅外波段但波長不同。
9.一種權利要求1至8中之一所述乳腺癌分子探針的制造方法，其特征在于:采用化學共價偶聯方法將信號功能單元與乳腺癌干細胞的特異性表面標志物單克隆抗體偶聯，再經過純化。
10.如權利要求9所述的制造方法，其特征在于:還用聚乙二醇、丙烯酸樹脂或多羥基醇對？如8進行表面修飾。
【文檔編號】G01N24/10GK104483296SQ201410718641
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月1日 優先權日:2014年12月1日
【發明者】方向明, 張兵波, 胡春洪 申請人:無錫市人民醫院