血漿中廈門霉素的定量檢測以及其代謝物的定性檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種血漿中廈門霉素的定量檢測以及其代謝物的定性檢測方法；所述定量檢測方法包括樣品的制備和檢測方法，樣品制備采用包括以下步驟的方法：向待測樣品中依次加入3倍體積的含有維拉帕米為內標的甲醇溶液，混勻；離心，收集上清，進行分析。所述定性檢測中樣品制備采用包括以下步驟的方法：向待測樣品中加入10倍體積的甲醇-乙腈混合溶液，體積比為5∶3，離心，收集上清，進行分析。本發明的檢測方法具有良好的專屬性、精密度和準確度較高，線性范圍較寬，適用于廈門霉素及類似苯并吡喃類化合物的體內藥代動力學測定及代謝產物的分析。
【專利說明】血漿中廈門霉素的定量檢測以及其代謝物的定性檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥學領域，具體涉及在血漿中廈門霉素 A、廈門霉素 B及其相關苯并吡 喃化合物的分析方法和在藥代動力學中的應用。
【背景技術】
[0002] 目前，關于具有抗纖維化活性的苯并吡喃benzopyran類化合物，即廈門霉 素 A、B、C、D，已有一些文獻報道，如日文專利[Kawamura，N. ;Tsuji，E. ;Watanabe， Y. ；Tsuchihashi, K. ；Takako, T. Benzopyran derivatives, their manufacture with Streptomyces species, and their use for treatment of asthma and rheumatoid arthritis. Daiichi Seiyaku Co. , Ltd. ；Mercian Corp. :Kyoto,Japan，7March 2000.]和 本 申請人:前期的工作文獻[Xu，M.J. ;Liu，X.J. ;Zhao，Y.L. ;Liu，D. ;Xu，Z.H. ;Lang，X.M.; Ao, P. ；Lin, W. H. ；Yang, S. L. ；Zhang, Z. G. ;Xu，J.，Identification and characterization of an anti-fibrotic benzopyran compound isolated from mangrove-derived Streptomyces xiamenensis. Mar Drugs 2012,10，(3),639-54 ；Liu, X. J. ；Xu, M. J. ;Fan， S. T. ；Wu, Z. ;Li，J. ；Yang,X. M. ；Wang, Y. H. ;Xu，J. ；Zhang,Z. G. ,Xiamenmycin attenuates hypertrophic scars by suppressing local inflammation and the effects of mechanical stress. J Invest Dermatol 2013,133,（5)，1351-60 ;Yang，Y. ;Fu，L ；Zhang, J. ;Hu，L ；Xu, M. ；Xu, J. Characterization of the xiamenmycin biosynthesis gene cluster in Streptomyces xiamenensis318. PloS one 2014,9，e99537.]中，曾報道了廈 門霉素 A-D的提取分離、結構鑒定、以及廈門霉素生物合成途徑，并報道了其具有抗炎、抗 肺纖維化和抗增生性瘢痕活性，是一類抗纖維化的活性先導化合物。
[0003] 針對廈門霉素的進一步藥學研究，特別是體內藥代動力學特性的研究，對于該類 先導化合物的成藥性非常重要，因此亟需建立一套定量分析廈門霉素 A，即母藥，的定量方 法。同時，還需要對于廈門霉素 A進入體內后的代謝物，如廈門霉素 B，即代謝物，的定性分 析的方法。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一套液相色譜串聯質譜MS/MS的方法，定量檢測血漿樣本 中廈門霉素 A。同時提供一套超高效液相串聯qTOF質譜的方法，定性檢測血漿樣本中，廈門 霉素 A的代謝產物，廈門霉素 B及相關苯并吡喃類化合物的方法。
[0005] 本發明目的是通過以下技術方案來實現的：
[0006] 第一方面，本發明涉及一種液相色譜串聯MS/MS質譜法定量檢測血漿樣本中廈門 霉素 A的方法，包括步驟（1)樣品的制備和步驟（2)檢測方法：
[0007] 步驟（1)樣品制備采用包括以下步驟的方法：向待測樣品中依次加入3倍體積的 含有維拉帕米為內標的甲醇溶液，并混勻；離心，收集上清，進行分析。通過該方法可以有效 提取血樣中的廈門霉素 A。
[0008] 步驟（2)檢測時液相色譜條件如下：色譜柱為反相色譜柱，流動相為流動相A : 0. 1% (體積百分比濃度）甲酸5mM甲酸銨水溶液；流動相B :甲醇；梯度洗脫條件：體積比 為45% B?85% B在兩分鐘內連續梯度變化，流速為0. 3毫升/分鐘。45% B?85% B指 的是，流動相A、B的起始體積比為55 : 45,終體積比為15 : 85。更優選梯度洗脫條件為： 0min、45% B，2min、85% B，2. 8min、85% B，2. 9min、45% B，4. 5min、45% B ;流速為 0? 3 毫升 /分鐘。通過摸索多種色譜條件意外發現，該色譜條件能夠將廈門霉素 A與其他血樣中的雜 質分離，定量數據準確。
[0009] 優選的，質譜采用電噴霧離子化源，電離模式為正離子選擇反應檢測。該方法具有 靈敏度高，線性范圍寬，簡單易行的特點。
[0010] 優選的，質譜噴霧電壓為3500V，廈門霉素 A的碰撞誘導裂解電壓為25eV。
[0011] 第二方面，本發明還涉及本發明的液相色譜串聯MS/MS質譜法定量檢測血漿樣本 中廈門霉素 A的方法在廈門霉素 A藥代動力學評價中的用途。
[0012] 第三方面，本發明還涉及一種超高效液相色譜Q-Tof串聯質譜法定性檢測血漿樣 本中廈門霉素 A及其代謝產物的方法，包括步驟（1)樣品的制備和步驟（2)檢測方法：
[0013] 步驟（1)樣品制備采用包括以下步驟的方法：向待測樣品中依次加入10倍體積的 甲醇-乙腈混合溶液，所述甲醇-乙腈混合溶液中甲醇、乙腈體積比為5 : 3,離心，收集上 清，進行分析。通過該方法可以有效提取血樣中的廈門霉素類化合物。
[0014] 步驟（2)檢測液相色譜條件如下：色譜柱為反相色譜柱，流動相為流動相A :0. 1% 甲酸水溶液；流動相B :0.1% (甲酸的體積百分比濃度）甲酸乙腈，梯度洗脫條件：體積比 為5%B?30%B在2分鐘內進行連續梯度變化，30% B?60% B在2. 5分鐘內進行連續 梯度變化，流速為〇. 4毫升/分鐘。其中，5% B?30% B指的是，第一階段洗脫中，流動相 A、B的起始體積比為95 : 5,終體積比為70 : 30,30% B?60% B指的是，第二階段洗脫 中，流動相A、B的起始體積比為70 : 30,終體積比為40 : 60。更優選梯度洗脫條件：0min、 5% B，2min、30% B，4. 5min、60% B，12min、100% B ;流速為 0? 4 毫升 / 分鐘。通過摸索多種 色譜條件發現，該色譜條件能夠將廈門霉素 A、廈門霉素 B及經甲酯化、雙鍵氧化、羧基還原 后的苯并吡喃類代謝產物進行比較清晰的分離，適用于多種廈門霉素衍生物的檢測。
[0015] 優選的，質譜采用電噴霧離子化源，電離模式為正離子全掃描檢測。同時也對于負 離子條件進行了摸索，發現正離子條件更加容易質子化，廈門霉素類化合物碎裂規律明確， 是檢測類似代謝產物的最佳離子化條件。質譜檢測條件分別比較了正、負離子兩種掃描模 式，發現廈門霉素 A、B及血樣中的代謝產物在電噴霧源正離子模式下響應強度高于負離子 模式。
[0016] 優選的，所述代謝產物包括廈門霉素 B、經甲酯化、雙鍵氧化或羧基還原后的苯并 吡喃類代謝產物。
[0017] 優選的，質譜噴霧電壓為3000V，廈門霉素 A的碰撞誘導裂解電壓為20?30eV，廈 門霉素 B的碰撞誘導裂解電壓為20?30eV，其余代謝產物（經甲酯化、雙鍵氧化或羧基還 原后的苯并吡喃類代謝產物）的碰撞誘導裂解電壓為15?30eV。
[0018] 本發明具有如下的有益效果：
[0019] 1、本發明建立了一種液相色譜串聯MS/MS質譜法定量檢測血漿樣本中廈門霉素 A 的方法，能夠快速的定量廈門霉素 A在體內的血藥濃度；
[0020] 2、本發明建立了一種超高效液相色譜串聯QTof質譜法定量檢測血漿樣本中廈門 霉素 A、廈門霉素 B及相關苯并吡喃類代謝產物的方法，能夠快速的分析廈門霉素 A在體內 的代謝產物；
[0021] 3、通過本發明的定量及定性檢測方法，發現廈門霉素 A的藥代動力學特性，吸收 快，具有良好的市場應用和推廣前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、 目的和優點將會變得更明顯：
[0023] 圖1為本發明的廈門霉素 A在血漿中標準曲線圖；
[0024] 圖2為廈門霉素 A血漿中濃度-時間曲線圖；
[0025] 圖3為廈門霉素 A在體內代謝后血漿中代謝產物的分析圖；
[0026] 圖4為廈門霉素 A在體內代謝后血漿中代謝產物的規律圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域 的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普 通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于 本發明的保護范圍。
[0028] 實施例1、廈門霍素 A的標準曲線的律立及質量控制
[0029] 標準曲線的配制：實際稱取2. 45mg廈門霉素 A，I. 225mL100% DMSO溶解，渦旋使 之充分溶解至澄清狀態，配制成儲備液（2mg/mL)。從儲備液吸取IOOul至EP管中，加入甲醇 1900ul配制成lOOug/ml工作液，渦旋混勻，再分別從此工作液中吸取100、200、400、500ul 至EP管中，分別加入900、800、600、500ul甲醇，渦旋混勻，配制成濃度為10、20、40、50ug/ml 的工作液，分別從10、20、50ug/ml的工作液中各取IOOul至EP管中，分別加入900ul甲醇， 渦旋混勻，得100、200、500ng/ml工作液，按此法依次稀釋，最終獲得濃度為10、20、50、100、 200、500、1000、2000、5000、10000、20000、40000、50000ng/ml 的工作液。配制標準曲線時，分 別取不同濃度工作液各3ul，加入27ul空白小鼠血漿，渦旋混勻，得濃度為1、2、10、50、100、 200、500、1000、2000、5000ng/ml的標準含藥血漿，按前處理方法處理，進樣分析獲得標準曲 線。20、2000、40000ng/ml工作液用于隨行質量控制。
[0030] 廈門霉素 A在血漿中的標準曲線數據見表1，As代表待測化合物的峰面積，Ai代 表內標峰面積，f表示相對峰面積，標準曲線見圖1。
[0031] 表1廈門霉素 A在血漿中的標準曲線
【權利要求】
1. 一種液相色譜串聯MS/MS質譜法定量檢測血漿樣本中廈門霉素A的方法，包括樣品 的制備和檢測方法，其特征在于，所述樣品的制備采用包括以下步驟的方法：向待測樣品中 依次加入3倍體積的含有維拉帕米為內標的甲醇溶液，混勻；離心，收集上清，進行分析。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，液相色譜條件如下：色譜柱為反相色譜柱， 流動相包括流動相A :0. 1 %甲酸5mM甲酸銨水溶液，流動相B :甲醇；梯度洗脫條件：體積比 為45% B?85% B在兩分鐘內連續梯度變化，流速為0. 3毫升/分鐘。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，質譜采用電噴霧離子化源，電離模式為正離 子選擇反應檢測。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，質譜噴霧電壓為3500V，廈門霉素A的碰撞 誘導裂解電壓為25eV。
5. -種如權利要求1?4中任一項所述的液相色譜串聯MS/MS質譜法定量檢測血漿樣 本中廈門霉素A的方法在廈門霉素A藥代動力學評價中的用途。
6. -種超高效液相色譜串聯Q-Tof串聯質譜法定性檢測血漿樣本中廈門霉素A及其 代謝產物的方法，包括樣品的制備和檢測方法，其特征在于，所述樣品制備采用包括以下步 驟的方法：向待測樣品中加入10倍體積的甲醇-乙腈混合溶液，離心，收集上清，進行分析； 所述甲醇-乙腈混合溶液中甲醇、乙腈體積比為5 : 3。
7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，液相色譜條件如下：色譜柱為反相色譜柱， 流動相包括流動相A :0. 1 %甲酸水溶液；流動相B :0. 1 %甲酸乙腈；梯度洗脫條件：體積比 為5%B?30%B在2分鐘內進行連續梯度變化，30% B?60% B在2. 5分鐘內進行連續 梯度變化，流速為〇. 4毫升/分鐘。
8. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，質譜采用電噴霧離子化源，電離模式為正離 子全掃描檢測。
9. 如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述代謝產物包括廈門霉素B、經甲酯化、雙 鍵氧化或羧基還原后的苯并吡喃類代謝產物。
10. 如權利要求9所述的方法，其特征在于，質譜噴霧電壓為3000V，廈門霉素A的碰撞 誘導裂解電壓為20?30eV，廈門霉素B的碰撞誘導裂解電壓為20?30eV，經甲酯化、雙鍵 氧化或羧基還原后的苯并吡喃類代謝產物的碰撞誘導裂解電壓為15?30eV。
【文檔編號】G01N30/88GK104407084SQ201410714321
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】徐岷涓, 馮蕾, 徐俊 申請人:上海交通大學