一種用于檢測mc-lr型微囊藻毒素的生物電極傳感器及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于檢測MC-LR型微囊藻毒素的生物電極傳感器及其制備方法。所述生物電極傳感器是在絲網印刷電極的工作電極上修飾多壁碳納米管-殼聚糖電沉積薄膜，并在多壁碳納米管-殼聚糖電沉積薄膜的表面進一步交聯上MC-LR型微囊藻毒素抗體。本發明傳感器分析速度快，樣品用量少，易于發展手持設備，便于實現定點和實時測試，而且成本遠低于大型的分析檢測儀器，因此可以進行推廣普及滿足家庭測量需求。
【專利說明】-種用于檢測MC-LR型微囊藻毒素的生物電極傳感器及其 制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于電化學分析和納米材料【技術領域】，特別涉及一種用于檢測MC-LR型微 囊藻毒素的生物電極傳感器及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 微囊藻毒素（Microcystin，簡稱MC)是藍藻產生的多肽毒素，為環狀結構，有多種 變型，含量較多、毒性較大的主要是MC-LR、MC-RR、MC-YR這三種微囊藻毒素（L、R、Y分別代 表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸），本發明主要針對MC-LR型微囊藻毒素進行檢測。微囊藻毒素 會使水體中其他生物中毒，而且也會對人類的健康產生很多潛在的危害。人們在皮膚接觸 含有微囊藻毒素的水體時會引起如眼睛等敏感部位過敏，少量喝入可引起急性腸胃炎，而 且微囊藻毒素是一種肝毒素，是肝癌的強烈促癌劑，長期飲用則可能引發肝癌，因此對微囊 藻毒素的研究已經成為水體環境科學研究的重要內容，快速、準確的檢測微囊藻毒素具有 重要的現實應用意義，能夠實現對水體的檢測預警，及時采取預防措施。
[0003] 目前微囊藻毒素的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC)、酶聯免疫法（ELISA) 等。現有常用的檢測方法都表現出了一些局限性，如HPLC法毒素需要進行預處理，靈敏度 較低，檢測設備比較昂貴而且需要專業人員操作；ELISA法操作步驟繁瑣、成本較高等。
【發明內容】
[0004] 針對現有技術中存在的缺陷，本發明的第一個目的是提供一種用于檢測MC-LR型 微囊藻毒素的生物電極傳感器；本發明的第二個目的是提供一種制備該生物電極傳感器的 方法；本發明的第三個目的是提供一種利用該生物電極傳感器檢測MC-LR型微囊藻毒素的 方法。
[0005] 本發明采用如下技術方案：
[0006] 一種用于檢測MC-LR型微囊藻毒素的生物電極傳感器，所述生物電極傳感器是 在絲網印刷電極的工作電極上修飾多壁碳納米管-殼聚糖電沉積薄膜，并在多壁碳納米 管-殼聚糖電沉積薄膜的表面進一步交聯上MC-LR型微囊藻毒素抗體。
[0007] 在上述方案的基礎上，所述絲網印刷電極是標準三電極，PET基底，工作電極是碳 (直徑3mm)，對電極是碳，參比電極是銀/氯化銀。
[0008] -種制備如上所述的用于檢測MC-LR型微囊藻毒素的生物電極傳感器的方法，具 體制備步驟如下：
[0009] (1)將殼聚糖（CS)溶于0? 5 %的稀鹽酸溶液中，室溫條件下磁力攪拌40min，再進 行抽濾得到I. Owt%的殼聚糖溶液；
[0010] ⑵將多壁碳納米管（MWCNTs)加入到步驟⑴中所得的殼聚糖溶液中，室溫條 件下磁力攪拌3h，初步得到多壁碳納米管分散的殼聚糖溶液，其中多壁碳納米管的濃度為 0. 5mg/mL ；
[0011] (3)將步驟（2)中所得的多壁碳納米管分散的殼聚糖溶液超聲lOmin，進一步得到 均勻分散的多壁碳納米管-殼聚糖溶液，用I. 〇wt%的氫氧化鈉溶液調節此混合溶液的pH 值為4. 0?6. 0 ;
[0012] (4)將絲網印刷電極（SP)浸入到步驟（3)中所得的多壁碳納米管-殼聚糖混合 溶液中，進行電沉積，電沉積電壓為-1. 5?-3. 0V，沉積時間為20?300s，形成多壁碳納米 管-殼聚糖電沉積薄膜，再用超純水洗滌得到初步修飾電極（CS-MWCNTs/SP);
[0013] (5)將步驟⑷中制得的CS-MWCNTs/SP電極浸入到L Owt %的戊二醛溶液中 0? 5 ?Ih ;
[0014] (6)將步驟（5)中所得修飾后的CS-MWCNTs/SP電極用超純水洗漆，在其工作電 極上滴加5?25 ii L MC-LR型微囊藻毒素抗體溶液（anti-MC-LR)，室溫條件下靜置交聯 0? 5 ?3h，得到目標檢測（anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)電極；
[0015] 一種檢測MC-LR型微囊藻毒素的方法，具體步驟如下：
[0016] (1)制備標準HRP酶標微囊藻毒素溶液：將不同濃度的微囊藻毒素溶液（MC-LR) 分別與微囊藻毒素 HRP酶標物溶液（HRP-MC-LR)以等體積混合，得到一系列標準HRP酶標 微囊藻毒素混合溶液（MC-LR+HRP-MC-LR)，其混合液中MC-LR的濃度是0. 0、0. 3、0. 8、1. 0、 2. Oppb ；
[0017] (2)將生物電極傳感器anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP用超純水洗滌，在其工作電 極上分別滴加5?25 ii L步驟（1)中所制備的MC-LR+HRP-MC-LR溶液，在室溫條件下 孵育0. 5?3h，得到具有不同濃度MC-LR的修飾電極：MC-LR+HRP-MC-LR/anti-MC-LR/ CS-MWCNTs/SP ；
[0018] (3)分別測試步驟（2)中孵育后的 MC-LR+HRP-MC-LR/anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP 電極的電流值Ip ;
[0019] (4)繪制MC-LR濃度與Ip的標準曲線；
[0020] (5)將待測的微囊藻毒素溶液（MC-LR)與微囊藻毒素 HRP酶標物溶液 (HRP-MC-LR)以等體積混合，取5?25 ii L混合液滴加到超純水洗滌過的生物電極傳感器上 (anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)，室溫條件下孵育0. 5?3h，測試孵育后電極的電流值Ip ;結 合步驟（4)繪制的標準曲線即可得到待測樣品溶液中微囊藻毒素的濃度。
[0021] 在上述方案的基礎上，步驟（3)中測試電流值Ip的方法為：測試工作液為含有 2mM對苯二酚（HQ) UmM雙氧水（H2O2)的0. 05M PBS (pH = 7. 0)緩沖液，電化學檢測方法為 微分脈沖伏安法。
[0022] 本發明的有益效果是：
[0023] 本發明通過生物電極傳感器實現微囊藻毒素的檢測，生物電極傳感器將生物樣品 固定在修飾過的電極表面，將生物分子間的相互作用轉化為電信號從而達到檢測生物反應 活動的目的，電信號輸出比ELISA法的光信號更加穩定、靈敏。生物電極傳感器可由選擇性 好的生物材料如特異性抗體構成目標分子的識別元件，可以實現與特定的底物分子發生反 應，更具有專一性。生物電極傳感器相應的檢測系統比較簡單，分析速度快，樣品用量少，易 于發展手持設備，便于實現定點和實時測試，而且成本遠低于大型的分析檢測儀器，因此可 以進行推廣普及滿足家庭測量需求。
[0024] 本發明采用活性的海洋多糖殼聚糖為生物電極傳感器的載體，殼聚糖是來自于海 洋的生物活性多糖，具有好的成膜特性、生物相容性，可以作為電極傳感器的修飾材料，用 于進一步固定生物活性物質如抗體，顯著提高電極負載抗體后的穩定性。本發明引入了多 壁碳納米管，其具有大的比表面積、良好的導電性，可以促進電極檢測過程中電子的傳遞， 進一步增強殼聚糖膜的導電性，從而提高響應速度，具有更高的檢測靈敏度。
[0025] 本發明通過實驗可以得到殼聚糖、多壁碳納米管的混合溶液，通過電沉積的方法 實現絲網印刷電極的修飾，即采用電信號進行電極修飾，不同于一般的滴涂法，相應的電沉 積電壓、電沉積時間更容易控制，得到的修飾電極重現性更好，為進一步固定微囊藻毒素抗 體奠定良好基礎。另外此生物電極傳感器的檢測過程將生物分子間的相互作用轉化為電信 號進行檢測，即以電信號形式輸出，不同于傳統的檢測微囊藻毒素的光信號輸出，電信號靈 敏度更高，信號更穩定，且易于操作，進而實現快速準確的檢測微囊藻毒素的目的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026] 圖1 一種用于檢測MC-LR型微囊藻毒素的生物電極傳感器（a)未加入HRP酶標物 溶液孵育的電極和（b)加入HRP酶標物溶液孵育的電極的微分脈沖伏安曲線圖。
[0027] 圖2 -種用于檢測MC-LR型微囊藻毒素的生物電極傳感器檢測微囊藻毒素的標準 曲線圖（內插圖是此生物電極傳感器檢測微囊藻毒素的微分脈沖伏安曲線圖）。
【具體實施方式】
[0028] 下面通過具體實施例，結合附圖對本發明作進一步說明。
[0029] 本實施例所用到的主要設備：CHI1040C型電化學工作站、SCIENTZ- II D超聲波細 胞粉碎機、Master-E plus UF超純水機、84-1A磁力攪拌器、SHZ-D III循環水真空泵。
[0030] 實施例
[0031] 1、用于檢測MC-LR型微囊藻毒素的生物電極傳感器的制備方法，具體為：
[0032] (1)將0? 5g殼聚糖溶于50mL 0? 5%的稀鹽酸溶液中，室溫條件下磁力攪拌4〇1^11， 再進行抽濾得到I. Owt%的殼聚糖溶液；
[0033] (2)稱取5. Omg多壁碳納米管加入10. OmL步驟（1)中所得的殼聚糖溶液中，室溫 條件下磁力攪拌3h，初步得到多壁碳納米管分散的殼聚糖溶液，其中多壁碳納米管的濃度 為 0? 5mg/mL ;
[0034] (3)將步驟（2)中所得的多壁碳納米管分散的殼聚糖溶液超聲lOmin，進一步得到 均勻分散的多壁碳納米管-殼聚糖溶液，用I. Owt%的氫氧化鈉溶液調節此混合溶液的pH 值為5. 0 ;
[0035] (4)將絲網印刷（SP)電極（標準三電極，PET基底，工作電極是碳-直徑3mm，對 電極是碳，參比電極是銀/氯化銀）浸入到步驟（3)中所得的溶液中，進行電沉積（沉積電 壓：-1. 8V，沉積時間：30s)，形成多壁碳納米管-殼聚糖電沉積薄膜，再用超純水洗滌得到 初步修飾電極（CS-MWCNTs/SP);
[0036] (5)將步驟⑷中制得的CS-MWCNTs/SP電極浸入到I. Owt %的戊二醛溶液中 0. 5h ；
[0037] (6)將步驟（5)中所得修飾后的CS-MWCNTs/SP電極用超純水洗滌，在其工 作電極上滴加20 y L微囊藻毒素抗體溶液（anti-MC-LR)，靜置交聯2h，得到目標檢測 (anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)電極；
[0038] 2、利用上述制備的生物電極傳感器檢測MC-LR型微囊藻毒素的方法，具體步驟如 下：
[0039] (1)制備標準HRP酶標微囊藻毒素溶液：將不同濃度的微囊藻毒素溶液（MC-LR) 分別與微囊藻毒素 HRP酶標物溶液（HRP-MC-LR)等體積混合，得到一系列標準HRP酶標微 囊藻毒素混合液（MC-LR+HRP-MC-LR)，混合液中相應微囊藻毒素的濃度為0. 0、0. 3、0. 8、 1. 0>2. Oppb ；
[0040] (2)將所得anti-MC-LR/CS-WWCNTs/SP電極用超純水洗滌，再分別滴加20 ii L步驟 (1) 中所制備的系列MC-LR+HRP-MC-LR溶液，在室溫條件下孵育2. 5h ;
[0041] (3)在含有2mM HQ、ImM H2O2的0? 05M PBS(pH = 7. 0)緩沖液中分別測試步驟 (2) 中孵育后電極的電流值Ip，測試方法：微分脈沖伏安法，具體測試掃描條件：起始電壓 0. 12V，終止電壓-0. 3V，掃描幅度0. 05V，記錄在-0. 12V附近產生的特征峰的電流值Ip ;
[0042] (4)繪制MC-LR濃度與電流值Ip的標準曲線；
[0043] (5)將待測的微囊藻毒素溶液（MC-LR)與微囊藻毒素 HRP酶標物溶液 (HRP-MC-LR)以等體積混合，取20 ii L混合液滴加到超純水洗滌過的生物電極傳感器上 (anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)，室溫條件下孵育2. 5h，測試孵育后電極的電流值Ip ;結合步 驟（4)繪制的標準曲線即可得到待測微囊藻毒素的濃度。
[0044] 性能表征：
[0045] 1、電化學催化性能
[0046] 配制兩種微囊藻毒素溶液，一種添加 HRP酶標物，一種不添加，使用本發明實施1 制備的生物電極傳感器（anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)進行檢測，檢測結果如圖1所示。在 所得孵育電極中沒有HRP酶標物時未出現特征電流峰（圖la)，有HRP酶標物時得到明顯的 特征電流峰（圖Ib)，由此可知：本發明所制備的anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP生物電極傳感 器對HRP酶標微囊藻毒素具有良好的催化性能，可用于測定微囊藻毒素的濃度。
[0047] 2、標準曲線
[0048] 為了得到目標檢測電極（anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)對于檢測微囊藻毒素具有 較好的響應范圍以及檢測限，我們主要采用微分脈沖伏安法針對不同濃度的微囊藻毒素溶 液進行了電化學分析測試。HRP酶標藻毒素混合溶液中微囊藻毒素 HRP酶標物和微囊藻毒 素與電極上固定化的有限的抗體活性位點發生競爭性結合，微囊藻毒素濃度越大相應與固 定化抗體發生免疫反應的HRP酶標物越少，則微分脈沖伏安法測定的峰電流信號會隨著待 測溶液中微囊藻毒素濃度的增大而呈下降的趨勢。
[0049] 本發明所制備的目標檢測電極（anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)對檢測微囊藻毒素 的電化學分析測試實驗結果如圖2所示，由內插圖可知相應峰電流Ip隨著微囊藻毒素濃 度的增大而逐漸減小，符合競爭免疫反應的預期結果，并且微囊藻毒素濃度在〇. Oppb? 2. Oppb范圍內微分脈沖伏安法測定的峰電流信號隨溶液中微囊藻毒素濃度的增大并不是
【權利要求】
1. 一種用于檢測MC-LR型微囊藻毒素的生物電極傳感器，其特征在于，所述生物電極 傳感器是在絲網印刷電極的工作電極修飾上多壁碳納米管-殼聚糖電沉積薄膜，并在多壁 碳納米管-殼聚糖電沉積薄膜的表面進一步交聯上MC-LR型微囊藻毒素抗體。
2. 根據權利要求1所述的一種用于檢測MC-LR型微囊藻毒素的生物電極傳感器，其特 征在于，所述絲網印刷電極是標準三電極，PET基底，工作電極是碳（直徑3mm)，對電極是 碳，參比電極是銀/氯化銀。
3. -種制備如權利要求1或2所述的用于檢測MC-LR型微囊藻毒素的生物電極傳感器 的方法，其特征在于，具體制備步驟如下： (1) 將殼聚糖（CS)溶于0.5 %的稀鹽酸溶液中，室溫條件下磁力攪拌40min，再進行抽 濾得到1. 〇wt %的殼聚糖溶液； (2) 將多壁碳納米管加入到步驟（1)中所得的殼聚糖溶液中，室溫條件下磁力攪拌3h， 初步得到多壁碳納米管分散的殼聚糖溶液，其中多壁碳納米管的濃度為0. 5mg/mL ; (3) 將步驟（2)中所得的多壁碳納米管分散的殼聚糖溶液超聲lOmin，進一步得到均勻 分散的多壁碳納米管-殼聚糖溶液，用1. 〇wt %的氫氧化鈉溶液調節此混合溶液的pH值為 4. 0 ?6. 0 ; (4) 將絲網印刷電極（SP)浸入到步驟（3)中所得的多壁碳納米管-殼聚糖溶液中，進 行電沉積，電沉積電壓為-1. 5?-3. 0V，沉積時間為20?300s，形成多壁碳納米管-殼聚 糖電沉積薄膜，再用超純水洗滌得到初步修飾電極（CS-MWCNTs/SP); (5) 將步驟（4)中制得的CS-MWCNTs/SP電極浸入到1. Owt%的戊二醛溶液中0? 5? lh ; (6) 將步驟（5)中所得修飾后的CS-MWCNTs/SP電極用超純水洗滌，在其工作電極上滴 加5?25 ii L MC-LR型微囊藻毒素抗體溶液（anti-MC-LR)，室溫條件下靜置交聯0. 5?3h， 即得到目標檢測（anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)電極傳感器。
4. 一種檢測MC-LR型微囊藻毒素的方法，其特征在于，使用了如權利要求1-3任一項所 述的生物電極傳感器。
5. 根據權利要求4所述的一種檢測MC-LR型微囊藻毒素的方法，其特征在于，具體步驟 如下： (1) 制備標準HRP酶標微囊藻毒素溶液：將不同濃度的微囊藻毒素溶液（MC-LR)分別 與微囊藻毒素HRP酶標物溶液（HRP-MC-LR)以等體積混合，得到一系列標準HRP酶標微 囊藻毒素混合溶液（MC-LR+HRP-MC-LR)，其混合液中MC-LR的濃度是0. 0、0. 3、0. 8、1. 0、 2. Oppb ； (2) 將生物電極傳感器（anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP)用超純水洗滌，再分別滴加5? 25 y L步驟（1)中所制備的MC-LR+HRP-MC-LR溶液，在室溫條件下孵育0. 5?3h，得到具有 不同濃度 MC-LR 的修飾電極：MC-LR+HRP-MC-LR/anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP ; (3) 分別測試步驟（2)中孵育后的 MC-LR+HRP-MC-LR/anti-MC-LR/CS-MWCNTs/SP 電極 的電流值Ip ; (4) 繪制MC-LR濃度與Ip的標準曲線； (5) 將待測的微囊藻毒素溶液（MC-LR)與微囊藻毒素HRP酶標物溶液（HRP-MC-LR)以 等體積混合，取5?25 y L混合液滴加到超純水洗滌過的生物電極傳感器（anti-MC-LR/ CS-MWCNTs/SP)上，室溫條件下孵育0. 5?3h，測試孵育后電極的電流值Ip ;結合步驟（4) 繪制的標準曲線即可得到待測樣品溶液中微囊藻毒素的濃度。
6.根據權利要求5所述的一種檢測MC-LR型微囊藻毒素的方法，其特征在于，步驟（3) 中測試電流值Ip的方法為：測試工作液為含有2mM對苯二酚（HQ)、lmM雙氧水（H202)的 0. 05M PBS (pH = 7. 0)緩沖液，電化學檢測方法為微分脈沖伏安法。
【文檔編號】G01N27/48GK104407039SQ201410713946
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】施曉文, 蘇曉明, 曹發, 劉桂亭 申請人:青島海佑海洋生物工程有限公司