以形態學方法對胚乳組織進行詳細分類的研究方法
【專利摘要】本發明提高了一種以形態學方法對胚乳組織進行詳細分類的研究方法，包括以下步驟：種植玉米、高粱、小麥和水稻，取發育不同天數的穎果進行實驗；體式顯微鏡觀察穎果的大小、形態與色澤變化，并觀察胚乳組織的位置與分布變化；熒光顯微鏡觀察穎果不同組織的熒光特性，分析其成分；光鏡觀察穎果與胚乳組織發育的顯微結構變化；掃描電鏡觀察細胞壁、淀粉體、蛋白體和糊粉粒的立體形態結構與分布；透射電鏡觀察細胞內亞細胞結構的特征與變化。本發明以四種主要谷物為實驗材料，通過各種形態學觀察技術分析并探明谷物胚乳的發育全過程，揭示了胚乳在穎果發育中的重要作用，且通過比較不同谷物胚乳的結構性差異來為谷物進化提供重要的資料。
【專利說明】以形態學方法對胚乳組織進行詳細分類的研究方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物科學與農業科學理論與【技術領域】，是一套切實可行的植物形態學研究方案。
【背景技術】
[0002]形態學觀察技術是植物學、動物學及醫學等領域非常重要的研究手段，國內比較常見的有體式顯微鏡觀察、熒光顯微鏡觀察、光鏡觀察、掃描電鏡觀察與透射電鏡觀察等。但是，國內能綜合利用這幾種觀察技術對特殊植物組織進行層次分明、邏輯嚴密的深入探究的幾乎是鳳毛麟角。
[0003]玉米、高粱、小麥和水稻是四種主要谷物，它們的穎果被廣泛用于人類食物、禽畜飼料和工業原料。胚乳是谷物穎果內重要的養分運輸與貯藏組織，對穎果的發育具有重要的作用。然而，如今對胚乳發育的研究并不深入，特別是胚乳的分化過程。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種以形態學方法對胚乳組織進行詳細分類的研究方法，以四種主要谷物為實驗材料，通過各種形態學觀察技術分析并探明谷物胚乳的發育全過程，揭示了胚乳在穎果發育中的重要作用，且通過比較不同谷物胚乳的結構性差異來為谷物進化提供重要的資料。
[0005]為實現上述目的，本發明采用以下技術方案:
[0006]一種以形態學方法對胚乳組織進行詳細分類的研究方法，包括以下步驟:
[0007](I)種植玉米、高粱、小麥和水稻，取發育不同天數的穎果進行實驗；
[0008](2)體式顯微鏡觀察穎果的大小、形態與色澤變化，并觀察胚乳組織的位置與分布變化；
[0009](3)熒光顯微鏡觀察穎果不同組織的熒光特性，分析其成分；
[0010](4)光鏡觀察穎果與胚乳組織發育的顯微結構變化；
[0011](5)掃描電鏡觀察細胞壁、淀粉體、蛋白體和糊粉粒的立體形態結構與分布；
[0012](6)透射電鏡觀察細胞內亞細胞結構的特征與變化。
[0013]本發明的有益效果是:
[0014]本發明與常規研究相比，具有以下優點:
[0015]本發明對玉米、高粱、小麥和水稻這四種主要谷物同時進行比較性研究，這在國內很少見。另外，從谷物進化角度來看，這四種谷物很具有代表性，玉米和高粱為C4植物，而小麥和水稻為C3植物。
[0016]本發明采用了多種觀察方式，從宏觀上穎果的形態、色澤與大小等特征至微觀上胚乳細胞內細胞器的超微結構，都進行了系統地研究，層次分明地揭示了胚乳發育的規律及其對穎果發育的影響。
[0017]本發明對胚乳組織進行了更加細致而合理的分類，并對各種組織發育過程中的結構變化規律進行了全面的觀察研究，這就大大深化了胚乳分化的研究。
[0018]本發明通過比較不同谷物胚乳組織的結構差異，進一步分析了各種胚乳組織的功能特性，同時為谷物進化研究提供了豐富的證據與資料。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1是玉米(A?C)，高粱(D?F)和小麥(G?I)穎果的剖面圖；
[0020]圖2是玉米(A，B)，高粱(C，D)和小麥(E，F)穎果下半部發育早中期的顯微結構圖；
[0021]圖3是玉米(A, D, G)，高粱(B, E, H)和小麥(C，F，I)胚乳傳遞細胞的顯微結構圖；
[0022]圖4是水稻穎果內不同部位的胚乳組織的顯微結構圖；
[0023]圖5是玉米穎果內的養分運輸路徑；
[0024]圖6是本發明具體實施方案簡圖；
[0025]圖中，AC.糊粉層細胞，ACC.糊粉輸導細胞，AG.糊粉粒，CSE.中心胚乳淀粉貯藏細胞，Em.胚，ECC.胚乳輸導細胞，ETC.胚乳傳遞細胞，ESR.胚周圍胚乳細胞，LB.脂質體，Pb.蛋白體，SA.亞糊粉層，SG.淀粉體，ST.篩管，VB.維管束，W1.壁內突。
【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖及具體實施例對本發明做進一步說明。
[0027]實施例
[0028]實驗材料與方法
[0029]種植玉米、高粱、小麥和水稻，取發育不同天數的穎果進行實驗:
[0030](I)樣品的體式顯微鏡觀察
[0031]將穎果縱切或橫切，取縱剖面直接或經TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)和I2-KI (碘-碘化鉀)染色后進行體式顯微鏡(Leica MZ6)觀察。
[0032](2)樣品的熒光顯微鏡觀察
[0033]將穎果徒手或采用冰凍切片機(Leica CMl 100)縱切，利用纖維素有自發熒光的原理，在熒光顯微鏡(Leica DMLB)下直接觀察穎果組織的熒光特性。
[0034](3)樣品的光鏡和透射電鏡觀察
[0035]將穎果縱切，取所要觀察的部位，先用質量濃度為2.5%的戊二醛前固定3小時，然后以PH為7.2的0.lmol/L的磷酸緩沖液清洗3次，再用質量濃度為0.5%的鋨酸后固定3小時；以pH為7.2的0.lmol/L的磷酸緩沖液清洗后，乙醇系列脫水，環氧丙烷置換，用低粘性的Spurr樹脂浸透與包埋；先切I μ m半薄切片，用質量濃度為0.5%的甲苯胺蘭-O、質量濃度為0.5%的番紅或質量濃度為1%的甲基紫染色，在光鏡(Leica DMLS)下觀察顯微結構。在光鏡觀察的基礎上，進一步作超薄切片(60nm);用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行雙重染色，在透射電鏡(Philips Tecnai 12)下觀察切片的超微結構。
[0036](4)樣品的掃描電鏡觀察
[0037]將穎果用液氮處理后縱向斷裂，取所要觀察的部位，在質量濃度為2.5%的戊二醛低溫固定3小時后，以pH為7.2的0.lmol/L的磷酸緩沖液清洗3次；乙醇系列脫水，醋酸異戊酯置換，CO2零界點干燥；最后經過離子濺射鍍金制樣后，便可在掃描電鏡(PhilipsXL-30 ESEM)下觀察。
[0038]結果與分析:
[0039]各種胚乳組織的分化、生長與衰亡
[0040](I)穎果發育早期，胚乳傳遞細胞分化產生，其內部壁內突不斷增加；穎果發育中期，它們成熟，其內部壁內突增至最多；穎果發育后期，它們逐漸衰亡，壁內突皺縮。
[0041](2)糊粉層細胞分化產生之后，細胞壁不斷增厚，內部積累脂質體與糊粉粒，但核不凋亡。
[0042](3)穎果發育早期，胚乳輸導細胞占據胚乳絕大部分；穎果發育中后期，它們逐漸衰亡減少。
[0043](4)胚周圍胚乳細胞在胚發育早期包裹著胚，但隨著胚的生長而快速衰亡。
[0044](5)隨著穎果的發育，胚乳貯藏細胞的細胞核逐漸消亡，它們內部不斷積累淀粉體和蛋白體。
[0045]不同谷物胚乳發育的比較
[0046](I)玉米胚乳傳遞細胞壁內突很多，高粱較少，小麥更少；玉米和高粱胚乳傳遞細胞幾乎不積累養分，而小麥胚乳傳遞細胞外層積累糊粉粒，內層積累淀粉體；水稻沒有胚乳傳遞細胞，僅有糊粉輸導細胞。
[0047](2)玉米胚乳輸導細胞又多又長，高粱胚乳輸導細胞較短較少，小麥胚乳輸導細胞更短更少；玉米和高粱的胚乳輸導細胞比小麥衰亡慢。
[0048](3)玉米和高粱的胚周圍胚乳細胞比小麥衰亡慢。
[0049](4)水稻胚乳內含復粒淀粉體，玉米、高粱和小麥胚乳內含單粒淀粉體。各種胚乳組織的功能特性
[0050](I)胚乳傳遞細胞具有壁內突結構，可以有效地促進來自維管束的養分進入胚乳。
[0051](2)糊粉層積累脂質體與糊粉粒；不斷增厚的細胞壁可代替衰亡的果皮和珠被來保護胚和胚乳，使其免受物理損傷或病原菌侵害。
[0052](3)胚乳輸導細胞是介于胚乳傳遞細胞和胚乳貯藏細胞之間的中間類型細胞，它們將胚乳傳遞細胞吸收的養分轉運至胚乳貯藏細胞。胚乳輸導組織的上部不斷轉化成胚乳貯藏組織，下部不斷衰亡而為胚生長提供空間。
[0053](4)胚周圍胚乳細胞在胚發育早期包裹著胚，保護胚并為其提供養分。
[0054](5)胚乳貯藏細胞是胚乳養分貯存的主體，主要積累淀粉和蛋白質。
[0055]討論總結
[0056](I)谷物胚乳組織大致分為養分運輸組織與養分貯藏組織兩類，不同谷物(特別是C4與C3植物之間)的胚乳組織分類、結構與功能會存在一些差異。
[0057](2)在玉米、高粱和小麥中，養分運輸組織包括胚乳傳遞細胞、胚乳輸導細胞和胚周圍胚乳細胞，養分貯藏組織包括糊粉層細胞、亞糊粉層細胞與中心胚乳貯藏細胞；在水稻中，養分運輸組織包括糊粉輸導細胞和胚周圍胚乳細胞，養分貯藏組織包括糊粉層細胞、亞糊粉層細胞與中心胚乳貯藏細胞。
[0058](3)玉米和高粱的胚乳傳遞細胞與胚乳輸導細胞相似，它們與小麥的有些不同。小麥胚乳傳遞細胞還留有類似于水稻的糊粉輸導組織特性和中心胚乳貯藏細胞特性。
【權利要求】
1.一種以形態學方法對胚乳組織進行詳細分類的研究方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)種植玉米、高粱、小麥和水稻，取發育不同天數的穎果進行實驗； (2)體式顯微鏡觀察穎果的大小、形態與色澤變化，并觀察胚乳組織的位置與分布變化； (3)熒光顯微鏡觀察穎果不同組織的熒光特性，分析其成分； (4)光鏡觀察穎果與胚乳組織發育的顯微結構變化； (5)掃描電鏡觀察細胞壁、淀粉體、蛋白體和糊粉粒的立體形態結構與分布； (6)透射電鏡觀察細胞內亞細胞結構的特征與變化。
2.如權利要求1所述的以形態學方法對胚乳組織進行詳細分類的研究方法，其特征在于:步驟(2)中，體式顯微鏡觀察是將穎果縱切或橫切，取縱剖面直接或經TTC和I2-KI染色后進行體視顯微鏡觀察。
3.如權利要求1所述的以形態學方法對胚乳組織進行詳細分類的研究方法，其特征在于:步驟(3)中，熒光顯微鏡觀是將穎果徒手或采用冰凍切片機縱切，利用纖維素有自發熒光的原理，在熒光顯微鏡下直接觀察穎果組織的熒光特性。
4.如權利要求1所述的以形態學方法對胚乳組織進行詳細分類的研究方法，其特征在于:步驟(4)中，光鏡觀察是將穎果縱切，取所要觀察的部位，先用質量濃度為2.5%的戊二醛前固定3小時，然后以pH為7.2的0.lmol/L的磷酸緩沖液清洗3次，再用質量濃度為.0.5%的鋨酸后固定3小時；以pH為7.2的0.lmol/L的磷酸緩沖液清洗后，乙醇系列脫水，環氧丙烷置換，用Spurr樹脂浸透與包埋；先切I μ m半薄切片，用質量濃度為0.5 %的甲苯胺蘭-O、質量濃度為0.5%的番紅或質量濃度為I %的甲基紫染色，在光鏡下觀察顯微結構。
5.如權利要求4所述的以形態學方法對胚乳組織進行詳細分類的研究方法，其特征在于:步驟(6)中，透射電鏡觀察是在光鏡觀察的基礎上，進一步作超薄切片，所述超薄切片的厚度為60nm ;用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進行雙重染色，在透射電鏡下觀察切片的超微結構。
6.如權利要求1所述的以形態學方法對胚乳組織進行詳細分類的研究方法，其特征在于:步驟(5)中，掃描電鏡觀察是將穎果用液氮處理后縱向斷裂，取所要觀察的部位，在.2.5%戊二醛低溫固定3小時后，以pH為7.2的0.lmol/L的磷酸緩沖液清洗3次；乙醇系列脫水，醋酸異戊酯置換，CO2零界點干燥；最后經過離子濺射鍍金制樣后，便可在掃描電鏡下觀察。
【文檔編號】G01N21/84GK104390978SQ201410693169
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月25日 優先權日:2014年11月25日
【發明者】鄭彥坤, 王 忠 申請人:揚州大學