斑馬魚在檢測bbp生殖毒性中的應用及快速檢測bbp生殖毒性的方法
【專利摘要】本發(fā)明生物【技術領域】，涉及一種檢測鄰苯二甲酸丁基芐酯（ButylbenzylPhthalate，BBP)的生殖毒性檢測方法。具體涉及一種利用模式生物斑馬魚檢測BBP生殖毒性檢測方法。更具體的是涉及利用成體斑馬魚快速檢測BBP對雄性生精能力和雌性產(chǎn)卵能力的方法。本發(fā)明的方法經(jīng)實驗結果顯示，檢測周期只需8天，短于現(xiàn)有文獻報道的其它方法；檢測BBP的生殖毒性的最低濃度為0.6mg.L-1優(yōu)于其它方法的檢測濃度。
【專利說明】斑馬魚在檢測BBP生殖毒性中的應用及快速檢測BBP生殖 毒性的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明公開了斑馬魚在檢測BBP生殖毒性中的應用及快速檢測BBP生殖毒性的方 法。
【背景技術】
[0002] I) BBP 鄰苯二甲酸酯（PAEs)是一種廣泛使用的聚氯乙烯增塑劑類化合物。近年來，發(fā)現(xiàn)它也 是一類潛在的環(huán)境內分泌干擾物。作為增塑劑，由于PAEs與塑料主體結構之間不以化學鍵 相結合，在使用過程中會不斷從塑料中釋放出來，污染環(huán)境。美國人類生殖危險評估中心 (CERHR)通過綜合評定提出與人類健康密切相關的9種PAEs，BBP就是其中的一種。目前 的檢測BBP類增塑劑的方法GC-MS、液相色譜-質譜聯(lián)用（HPLC-MS)，方法雖然基本可以滿 足常規(guī)檢測要求，但是各種前處理手段繁瑣，成本高昂，需要專業(yè)人員和專業(yè)設備較多而且 該方法需要樣品純度高(不能檢測環(huán)境中BBP)，所以應當探索前處理耗用成本低，靈敏度、 重現(xiàn)性及易操作性均好的方法。研究還發(fā)現(xiàn)，BBP是具有明顯雌激素生物效應的8種酞酸酯 類中的一種，其應用廣泛、難以降解成為備受關注的全球性環(huán)境污染物之一。鄰苯二甲酸丁 基芐酯（BBP)分子式為C 19H2OO4，分子量312. 3。由于BBP在相關的產(chǎn)品中呈游離狀態(tài)，因此 可轉移進入環(huán)境從而對大氣、土壤、水體造成嚴重污染，并通過食物、呼吸、飲水和皮膚接觸 等各種途徑進入人體，造成危害。BBP急性毒性較低，但較高劑量下易引起動物生殖系統(tǒng)。
[0003] 2)生殖毒性 指外來物質對雌性和雄性生殖系統(tǒng)，包括排卵、生精，從生殖細胞分化到整個細胞發(fā) 育，也包括對胚胎細胞發(fā)育所致的損害，引起生化功能和結構的變化，影響繁殖能力，甚至 累及后代。環(huán)境內分泌干擾物的污染及其對人類生育功能的危害，已經(jīng)成為當今環(huán)境醫(yī)學 關注的熱點，也直接關系著人類和自然的可持續(xù)發(fā)展。BBP作為一種環(huán)境污染物對生物生 殖系統(tǒng)所造成的損害不容忽視。迄今為止，較多研究關注了 BBP雄性生殖毒性。在胚胎期， 生殖系統(tǒng)對BBP毒性比較敏感，因為胚胎期是人體各器官發(fā)育的重要時期。動物實驗表明， 胚胎期或者哺乳期暴露高劑量的BBP (>250 mg/d)會導致明顯的生殖發(fā)育毒性包括：隱睪、 尿道下裂、附屬性腺萎縮及發(fā)育不全、睪丸損傷、精子生成減少、青春期發(fā)育推遲、肛殖距減 小。
[0004] 3)斑馬魚 斑馬魚（Zebrafish, Danio rerio)是近年來應用越來越廣泛的重要模式生物。斑馬魚 是一種脊椎動物，與人類基因同源性高，其信號傳導通路與人類基本近似，生物結構和生理 功能與哺乳動物高度相似，具有飼養(yǎng)成本低、體積小、發(fā)育周期短、體外受精、透明易觀察、 單次產(chǎn)卵數(shù)較高等特點。而與線蟲和果蠅這樣的模式生物相比，雖然后者也可用于大規(guī)模 篩選，但并不能闡明高等生物特有的組織或器官發(fā)育和功能。目前，已有一系列論文報道影 響斑馬魚胚胎發(fā)育的突變體的篩選及鑒定，揭開了斑馬魚廣泛應用于與發(fā)育和疾病相關的 基因功能分析的序幕。因此近年來斑馬魚已經(jīng)發(fā)展成為人類疾病和毒理學研究得的良好的 動物模型目前斑馬魚已被美國國家衛(wèi)生研究院（NIH)列為繼人和小鼠之后的第三大模式生 物。目前，在美國及歐洲共有2000多家機構從事斑馬魚相關技術的基礎和應用基礎研究， 并有9家斑馬魚新藥篩選公司向全球范圍提供商業(yè)化服務。近幾年來，歐洲經(jīng)濟與合作發(fā) 展組織（OE⑶）和日本的生殖毒理學家就采用斑馬魚作為檢測水環(huán)境內分泌干擾物濃度的 早期敏感對象，并取得積極成果。中國也已在2011將斑馬魚技術列入"重大新藥創(chuàng)制專項" 十二五計劃。
[0005] 4)毒理學檢測模型 在毒理研究中，實驗模型的選擇一直是個難題，普通的動物模型如大鼠和小鼠存在著 生長周期較長（8周以上)，檢測指標不確定，靈敏度差，樣品純度高且難以大規(guī)模研究等缺 點，而單純的細胞材料又很難再現(xiàn)體內的實際情況。斑馬魚模型現(xiàn)已廣泛應用于包括急 性毒性、發(fā)育毒性與致畸性、胚胎毒性、心血管毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性、腎毒性、行為毒性 和生殖毒性等在內的一系列藥物毒性評價中。2009年歐洲斑馬魚藥物篩選技術服務公司 Biobide (www. biobide, es)獲得了美國食品與藥品管理局（FDA)和歐洲藥品評估局（EMEA) 的GLP認證，標志著斑馬魚藥物毒理學與安全性評價模型已經(jīng)得到了歐美國家政府的正式 認可。2013年4月8號，美國FDA在其官網(wǎng)刊文報道斑馬魚在藥物早期毒性評價中的作用。 斑馬魚的基因與人類基因相似度達到87%，這意味著在它身上得出的水質監(jiān)測結果，多數(shù)情 況下都適用于人類。
[0006] 斑馬魚模型檢測化合物毒理學案例中。用化合物處理斑馬魚，可觀察到斑馬魚一 系列的特異的組織器官發(fā)育異常，結合半致死率評價方法，并與哺乳動物的致畸作用進行 比較，這樣就可以對化合物毒性獲得較為準確的評估。數(shù)據(jù)顯示，斑馬魚藥物評價系統(tǒng)識別 非致畸物質成功率為75%，識別致畸物質成功率則高達100%。該評價系統(tǒng)的特異性（709T 80%)和敏感性（>80%)非常突出，優(yōu)于小鼠或者大鼠等常規(guī)實驗動物。報道還表明，阿斯利 康等5家跨國醫(yī)藥巨頭已經(jīng)用斑馬魚進行先導化合物早期發(fā)育毒性評價，涉及了 58種遴選 的化合物(不包括BBP)，整體的預測準確定超過80%，具有很高的可靠性和靈敏度。
【發(fā)明內容】
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種低成本的快速檢測二甲酸丁基芐酯生殖毒性的方法，更 具體的，本發(fā)明涉及利用模式生物斑馬魚來快速檢測二甲酸丁基芐酯生殖毒性。
[0008] 模式生物斑馬魚在檢測BBP生殖毒性中的應用，其是采用成體斑馬魚快速檢測 BBP對雄性斑馬魚生精能力、對雌性斑馬魚產(chǎn)卵能力。
[0009] 一種快速檢測BBP生殖毒性的方法，包括下述步驟： 1) 斑馬魚的飼養(yǎng)； 2) 將性成熟斑馬魚轉移進行BBP暴露，然后檢測BBP對于斑馬魚7天的急毒效應，求得 BBP對斑馬魚7天的LC50 ; 3) 檢測BBP的生殖毒性，包括BBP對雄性斑馬魚精子生成能力的影響和BBP對雌性斑 馬魚產(chǎn)卵能力的影響。
[0010] 步驟1)采用AB系野生型斑馬魚作為實驗對象，飼養(yǎng)4-6個月。
[0011] 步驟2)進行BBP暴露時的BBP濃度為0-5mg. L-1之間。
[0012] 本發(fā)明生物【技術領域】，涉及一種檢測鄰苯二甲酸丁基節(jié)酯（Butyl benzyl Phthalate，BBP)的生殖毒性檢測方法。具體涉及一種利用模式生物斑馬魚檢測BBP生殖 毒性檢測方法。更具體的是涉及利用成體斑馬魚快速檢測BBP對雄性生精能力和雌性產(chǎn)卵 能力的方法。本發(fā)明采用模式生物斑馬魚來快速檢測BBP生殖毒性，檢測周期只需8天， 短于現(xiàn)有文獻報道的其它方法；檢測BBP的濃度范圍在0. 6-2. 96 mg. I71之間，最優(yōu)區(qū)間 0. 6-1. 5mg. L'檢測BBP的生殖毒性的最低濃度為0. 6 mg. I71，優(yōu)于其它方法的檢測濃度； 檢測一份樣品的BBP成本測算低于50元/次，低于其它方法成本。本發(fā)明在利用AB斑馬 魚檢測BBP生殖毒性技術中，檢測BBP的濃度范圍在0. 6-2. 96 mg. I71之間，低于此濃度檢 測靈敏度受影響，而超過此濃度則會引起實驗斑馬魚的死亡。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 圖1為BBP對于雄性斑馬魚精子產(chǎn)生的影響。
[0014] 圖2為BBP對于雌性斑馬魚產(chǎn)卵的影響。
[0015] 圖3為斑馬魚置換實驗BBP對于斑馬魚交配的影響。
[0016] 圖4為斑馬魚置換實驗BBP對于斑馬魚交配的影響。
【具體實施方式】
[0017] 下述實施例是對于本
【發(fā)明內容】
的進一步說明以作為對本發(fā)明技術內容的闡釋，但 本發(fā)明的實質內容并不僅限于下述實施例所述，本領域的普通技術人員可以且應當知曉任 何基于本發(fā)明實質精神的簡單變化或替換均應屬于本發(fā)明所要求的保護范圍。
[0018] 實施例1 1.斑馬魚的飼養(yǎng)：1) AB系野生型斑馬魚購自美國俄勒岡州立大學（Oregon State University，OR. USA)國際斑馬魚中心。成年斑馬魚飼養(yǎng)于2. 5 L的魚缸中，循環(huán)的系統(tǒng) 水流經(jīng)過魚缸。每天成年斑馬魚給予鹽水小奸（brine shrimp)喂食2次。鹽水小奸由人 工合成的海水孵化。在小魚出生后2 - 16天，給予幼魚人工飼料Hatchfry EncapsulonTM (Argent Chemical Laboratories, Redmond, WA, USA) ?喂食。魚房恒溫 28.5 °C，光照和 熄燈的時間為14:10小時；2)自來水經(jīng)過活性碳過濾并經(jīng)由反向滲透裝置處理獲得純化 水，而后在其中添加分析純度的天然鹽以合成符合美國環(huán)保署標準（U. S. Environmental Protection Agency Guideline, U.S. EPA, 1986)的淡水。合成的淡水經(jīng)過充氧，以 9 L/天的流速供應給每個魚缸。自動監(jiān)測儀（YSI 5200 Recirculating System Monitor, Aquatic Habitats，F(xiàn)L，USA)持續(xù)監(jiān)測系統(tǒng)水的溫度（28°C)，pH值（6. 9-7. 3)，電導率 (240)，溶氧（6ppm)及氨濃度（小于2.0mg/L)等指標(按斑馬魚操作手冊)。斑馬魚性成熟 后，進行生殖毒性的檢測。
[0019] 2.檢測BBP對于斑馬魚7天的急毒效應：按照周永欣和章宗涉（1989)的方法進 行魚類急性毒性實驗。將性成熟斑馬魚轉移到I L的魚缸中開始BBP暴露。暴露的劑量為 0. 00, 2. 45, 2. 75, 3. 05, 3. 35, 3. 65及3. 95 mg. L'每個魚缸中隨機放入20條魚，每組有3 個魚缸。每24小時用新配置的BBP溶液換水一次。定時觀察魚的中毒癥狀并及時將死魚 撈出，記錄魚的死亡數(shù)量。BBP對斑馬魚7天急性半致死試驗結果如表1所示。從表1中可 以看出7天內隨著BBP濃度的升高斑馬魚死亡率也隨著升高。用SPSS13.0軟件求得BBP 對斑馬魚7天LC50為2. 96 mg. L'
[0020] 表I、BBP對斑馬魚7天急性毒性實驗
【權利要求】
1. 斑馬魚在檢測BBP生殖毒性中的應用，其是采用成體斑馬魚快速檢測BBP對雄性斑 馬魚生精能力、對雌性斑馬魚產(chǎn)卵能力。
2. -種快速檢測BBP生殖毒性的方法，其特征在于，包括下述步驟： 1) 斑馬魚的飼養(yǎng)； 2) 將性成熟斑馬魚轉移進行BBP暴露，然后檢測BBP對于斑馬魚7天的急毒效應，求得 BBP對斑馬魚7天的LC50 ; 3) 檢測BBP的生殖毒性，包括BBP對雄性斑馬魚精子生成能力的影響和BBP對雌性斑 馬魚產(chǎn)卵能力的影響。
3. 如權利要求2所述快速檢測BBP生殖毒性的方法，其特征在于，步驟1)采用AB系野 生型斑馬魚作為實驗對象，飼養(yǎng)4-6個月。
4. 如權利要求2所述快速檢測BBP生殖毒性的方法，其特征在于，步驟2)進行BBP暴 露時的BBP濃度為0-5mg. L-1之間。
【文檔編號】G01N33/00GK104374883SQ201410684262
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月25日 優(yōu)先權日:2014年11月25日
【發(fā)明者】豆長明, 張潔, 齊翠翠, 潘成榮, 王軍, 楊遠盛, 聶天琛 申請人:安徽省環(huán)境科學研究院