一種檢測透明質酸酶的熒光方法

一種檢測透明質酸酶的熒光方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測透明質酸酶的熒光方法。該方法首先將陽離子型共軛聚合物與連接了熒光猝滅劑阿霉素的帶負電荷的透明質酸通過靜電吸引結合；共軛聚合物的熒光由于與阿霉素之間的電子轉移被猝滅，且熒光強度隨阿霉素濃度的增大而減弱；當加入透明質酸酶時，它將透明質酸鏈水解，使陽離子型共軛聚合物與透明質酸的結合削弱，距離增大，阿霉素被釋放，熒光猝滅效應減弱，共軛聚合物的熒光逐漸恢復，且共軛聚合物熒光恢復的程度與透明質酸酶的濃度相關。該方法操作簡便，響應速度快，成本較低，具有較高的選擇性和靈敏度，在生物檢測、疾病的早期診斷和治療中有重要的意義。
【專利說明】一種檢測透明質酸酶的熒光方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于生物傳感及分析領域，特別涉及一種利用陽離子型共軛聚合物和透明質酸探針檢測透明質酸酶的熒光方法。

【背景技術】
[0002]共軛聚合物的共同特征是分子內有大的η-電子共軛體系，提供了電荷大范圍遷移的條件，因為其主鏈的η - 共軛結構與能提供P軌道的原子(如N，S等)相連的P- π共軛結構形成了沿高分子鏈的離域η鍵，電荷可通過該離域η鍵沿高分子鏈運動。因此，共軛聚合物是一種非常高效的能量/電子傳遞介質，它具有“分子導線”特征，即受激發產生的激子可以沿共軛主鏈迅速遷移。把銨根、羧酸根、磺酸根基團或寡聚乙二醇等親水性基團共價連接到共軛聚合物側鏈上可使其具有水溶性。通過引入陽離子基團，可使整條聚合物鏈在水溶液中帶正電荷，能與帶負電荷的生物分子發生相互作用。
[0003]透明質酸是一種帶負電的線性黏多糖，由(IH)D-葡糖醛酸(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡糖的雙糖單位重復連接組成。1934年美國哥倫比亞大學眼科教授Meyer等首先從牛眼玻璃體中分離出該物質，隨后在人體內也發現了它的存在。在機體內，透明質酸顯示出多種重要的生理功能:如維持組織結構完整性、形成圍繞各個細胞的高度水合矩陣、促進細胞遷移和轉移及調解細胞間信號等(Rafal Fudala, MarkE.MummertjZygmunt Gryczynskijet al.Journal ofPhotochemistry and Photob1logyB:B1logy, 2012, (106):69 - 73)。它和蛋白質、核酸一樣，都是生命過程的基本物質，廣泛存在于生物體的軟結締組織中。透明質酸分子中含有的大量羧基、羥基、酰胺基，在生理條件或適當的PH環境下，羧基可充分解離成負離子。因此，透明質酸具有突出的保水性能，還有粘彈性的雙重特征，即它的水溶液既具有凝膠的彈性，也具有溶液的粘性。近年來，由于透明質酸獨特的理化性質和生理功能，它已經在諸多方面得到廣泛應用，例如:保護眼睛、保護和潤滑關節、促進血管生成、促進傷口愈合以及腫瘤的治療等。
[0004]透明質酸酶(Hyaluronidase, HAase)是廣泛分布于自然界中的一類糖苷酶,它可斷開透明質酸糖鏈中的N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖羧酸之間的糖苷鍵，將其解聚和水解成低相對分子質量透明質酸或寡糖。透明質酸酶首次發現于1929年，Duran-Reynals在哺乳動物睪丸及其他組織提取物中發現一種可促進疫苗、染料、毒素等擴散的“擴散因子”，隨后被鑒定為透明質酸酶(F.Duran-Reynals.Tissue permeability and the spreadingfactor in infect1n:A contribut1n to the host:parasite problem[J].Bacter1lRev, 1942,6(4):197-252)。透明質酸酶在許多不同的癌癥細胞中都有過度表達，例如膀胱癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤等。幾種致癌細胞行為，包括組織入侵及血管再生的增強作用等，也與透明質酸酶的活性增加有關。此外，透明質酸酶也可用于抗癌化療劑，透明質酸酶的加入可減少腫瘤細胞的抗藥性。因此，對透明質酸酶進行高效的檢測在腫瘤的早期診斷和治療等方面具有重要的理論和應用研究價值。
[0005]目前已報道的透明質酸酶的檢測方法有濁度法、粘度法、酶譜法、免疫測定法以及一些其他的化學方法等(Dan Cheng, Weiye Han, Kuncheng Yang, etal.Talanta, 2014(130):408 - 414)。其中應用較多的方法濁度法，濁度法是基于大分子量的透明質酸鹽于酸化血清中發生沉降現象建立起來的，但這種方法需要大量的酶，且測量結果相對不準確。酶譜法較簡單但不適合敏感的定量分析。免疫測定法則需要專業和昂貴的試劑。因此找到一種既能特異性檢測透明質酸酶，又操作簡便、快速、成本低的檢測方法，成為亟待解決的問題。


【發明內容】

[0006]技術問題:本發明要解決的技術問題是針對現有檢測透明質酸酶方法的不足，提供一種利用透明質酸探針與陽離子型水溶性共軛聚合物結合的利用熒光信號來檢測透明質酸酶的方法，靈敏度和特異性好，并且操作簡便、快速，成本低。
[0007]技術方案:本發明為一種基于陽離子型水溶性共軛聚合物和透明質酸探針檢測透明質酸酶的熒光方法，運用該方法可以實現對透明質酸酶的定性和定量檢測。該技術的核心是利用透明質酸酶與結合熒光猝滅劑透明質酸探針發生作用前后，陽離子型水溶性共軛聚合物的熒光猝滅和恢復的程度進行透明質酸酶的檢測。當透明質酸酶濃度為零時，共軛聚合物與透明質酸探針通過靜電作用結合，共軛聚合物的熒光由于與透明質酸探針上的阿霉素之間的電子轉移被猝滅；當透明質酸酶濃度增大時，透明質酸酶與透明質酸發生作用，透明質酸鏈被水解成片段，大大削弱了共軛聚合物與透明質酸探針的靜電結合作用，使兩者的距離增大，因此共軛聚合物的熒光得以恢復；共軛聚合物熒光恢復的程度與透明質酸酶的濃度相關，因此根據本方法可以對透明質酸酶進行定量檢測。
[0008]本發明的檢測透明質酸酶的熒光方法基于陽離子型水溶性共軛聚合物和透明質酸HA探針，包括以下步驟:
[0009]I)制備結合熒光猝滅劑的透明質酸探針；
[0010]2)將陽離子型水溶性共軛聚合物與所述透明質酸探針結合，進行熒光檢測；
[0011]3)在透明質酸探針中加入透明質酸酶，待其與透明質酸酶作用后，在其中加入陽離子水溶性共軛聚合物，再次進行熒光檢測。
[0012]突光粹滅劑包括阿霉素DOX的小分子突光粹滅劑。
[0013]所述陽離子型水溶性共軛聚合物，其熒光發射由于與阿霉素熒光猝滅劑之間的電子轉移能夠被粹滅。
[0014]所述陽離子型水溶性共軛聚合物與透明質酸探針是通過靜電吸引作用結合。
[0015]所述透明質酸探針與透明質酸酶的作用，是透明質酸酶將透明質酸鏈水解為透明質酸短鏈的過程。
[0016]所述的熒光檢測中，所使用的緩沖溶液是0.15M NaCU0.02M PBS緩沖液，pH =
5.6o
[0017]所述的熒光檢測中，溫度為25°C。
[0018]所述熒光檢測，是加入透明質酸酶溶液在37°C下孵育30分鐘后測量熒光發射光
-1'TfeP曰。
[0019]所述的熒光檢測是用熒光分光光度計進行檢測，激發波長在陽離子型水溶性共軛聚合物最大紫外-可見吸收峰處，發射波長掃描范圍為415 — 600nm。
[0020]有益效果:本發明所述的熒光檢測方法基于水溶性共軛聚合物信號倍增和實時檢測的優勢，以及阿霉素能夠猝滅水溶性共軛聚合物的熒光和透明質酸酶能夠水解透明質酸的特點，利用透明質酸酶與透明質酸探針發生作用前后，陽離子型水溶性共軛聚合物的熒光恢復的程度進行透明質酸酶的檢測。該方法操作簡便，響應速度快，成本較低，且具有較高的選擇性和靈敏度，是一種分析效率較高的檢測方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為陽離子型水溶性共軛聚合物(PFEP)、透明質酸(HA)、阿霉素(DOX)的分子結構式。
[0022]圖2為利用陽離子型水溶性共軛聚合物和透明質酸探針檢測透明質酸酶的工作原理圖。
[0023]圖3為基于陽離子型水溶性共軛聚合物和透明質酸探針的熒光檢測方法對不同濃度的透明質酸酶進行檢測的熒光光譜圖。透明質酸酶濃度范圍為O?1.85U/mL。
[0024]圖4為不同濃度透明質酸酶加入待測體系前后，體系熒光強度變化的對應關系曲線圖。注解:小圖表示體系熒光強度與O?1.30U/mL濃度范圍內的透明質酸酶的線性關系圖。
[0025]圖5為特異性分析圖。分別為檢測底液中加入透明質酸酶，凝血酶(Thrombin),溶菌酶(Lysozyme)和PBS緩沖溶液的對比結果。

【具體實施方式】
[0026]為了更好地理解本發明的內容，下面以陽離子型水溶性共軛聚合物和熒光素標記的透明質酸探針檢測透明質酸酶的實驗為例，說明本發明技術的【具體實施方式】。
[0027]運用該技術包括如下三個步驟:
[0028]I)制備結合阿霉素的透明質酸探針；
[0029]2)將陽離子型水溶性共軛聚合物與所述透明質酸探針結合，進行熒光檢測；
[0030]3)在透明質酸探針中加入透明質酸酶，待其與透明質酸酶作用后，在體系中加入陽離子水溶性共軛聚合物，再次進行熒光檢測。
[0031]其中:
[0032]步驟I反應機理為:透明質酸上的羧基與阿霉素上的氨基在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的催化作用下發生縮合反應連接在一起。透明質酸和阿霉素的分子結構式如圖1所示。
[0033]步驟2中的陽離子型水溶性共軛聚合物可參照文獻(Huang Y Q, Fan QL，Lu X M，Fang C，Liu S J，Li Hj Wen Yj Wang L H，Huang W.Journal ofPolymerScience: PartA: Polymer Chemistry2006，44 (19)，5778-5794)制備，其濃度以重復單兀的摩爾濃度表示。透明質酸探針的濃度也以其重復單元的摩爾濃度表示。該共軛聚合物通過靜電吸引作用與透明質酸探針結合，使該共軛聚合物的熒光被阿霉素猝滅，從而使熒光信號顯著減弱。共軛聚合物的熒光恢復程度用加入透明質酸酶前后的熒光強度的比值，即I。/Itl來表示。當透明質酸酶濃度為零時，共軛聚合物的熒光強度用Itl表示。
[0034]熒光檢測所用的儀器為島津RF-5301PC熒光分光光度計。熒光光譜測量條件:氣燈激發，激發波長為404nm，發射掃描范圍為415_600nm。檢測緩沖液為pH = 5.6的0.15MNaCU0.02M PBS緩沖液，用4mL石英比色皿進行測量，樣品體積2.7mL ;陽離子型水溶性共軛聚合物濃度為1.5X 10_7mol/L，透明質酸探針的濃度為O?3.1X 10_6mol/L，檢測溫度25。。。
[0035]步驟3在透明質酸探針中加入透明質酸酶，在37°C下孵育30分鐘后，在體系中加入陽離子水溶性共軛聚合物后進行熒光檢測。由于透明質酸酶將透明質酸鏈水解，削弱了共軛聚合物與透明質酸探針的靜電結合作用，使兩者的距離增大，阿霉素對共軛聚合物的熒光猝滅作用減弱，共軛聚合物的熒光得以恢復。用^表示加入透明質酸酶后共軛聚合物的熒光強度，計算熒光強度變化的相對值Λ I:
[0036]Δ I = Ic/10
[0037]Λ I與透明質酸酶的濃度相關，根據兩者的關系曲線可以對透明質酸酶進行定量檢測。
[0038]熒光檢測所用的儀器、熒光光譜測量條件、檢測緩沖液同步驟2，用700uL石英比色皿進行測量，樣品體積540uL ;陽離子型水溶性共軛聚合物濃度為1.5X10_7mol/L，透明質酸探針的濃度為1.48X 10_6mOl/L，透明質酸酶的濃度為O?1.85U/mL，檢測溫度25°C。
[0039]實施例1檢測不同濃度的透明質酸酶
[0040]在溫度為25°C，pH = 5.6的PBS緩沖液中，向含8 X 10_5mol/L透明質酸探針的底液中加入一系列不同量的透明質酸酶，在37°C下孵育30分鐘，之后稀釋至透明質酸探針濃度為1.48X10_6mol/L，加入1.5X10_7mol/L陽離子型水溶性共軛聚合物，掃描其熒光發射光譜，實驗結果如圖5所示透明質酸酶的終濃度分別為0、0.19,0.38,0.56,0.74,0.93、1.11、
1.30、1.49、1.85U/mL。從圖中可見隨著透明質酸酶的濃度增大，陽離子型水溶性共軛聚合物的熒光恢復程度越高。計算△ I，對透明質酸酶的濃度作圖得圖4。該圖表明在透明質酸酶濃度為O?1.30U/mL范圍內具有很好的線性范圍，大于該范圍，Λ I的曲線趨向平緩，表示加入透明質酸酶的濃度趨于飽和。
[0041]該方法的檢測限公式:L0D = 3&/S，其中Stl表示空白樣品的標準偏差，S表示在該方法線性范圍內的靈敏度(Eggins B R, Chemical Sensors and B1sensors, Johnffiley&Sons Ltd, West Sussex, England, 2002)。本實驗空白樣的標準偏差為0.04,結合線性曲線的靈敏度計算得到檢測限為0.075U/mL。
[0042]實施例2特異性分析
[0043]檢測1:將濃度為0.38U/mL的透明質酸酶加入檢測底液中，其它實驗條件同實施例I。
[0044]同時，做如下試驗作為對比。
[0045]檢測2:用等體積濃度為透明質酸酶5倍的溶菌酶(Lysozyme)和凝血酶(Thrombin)進行試驗,作為陰性對照,其它實驗條件同實施例1。
[0046]檢測3:用等體積的空白緩沖溶液代替透明質酸酶進行試驗，作為空白對照，其它實驗條件同實施例1。
[0047]結果如圖5所示。加入透明質酸酶的檢測體系的共軛聚合物的熒光恢復程度顯著高于其他3種對照體系，表明該方法對透明質酸酶的檢測具有較高的特異性。
【權利要求】
1.一種檢測透明質酸酶的熒光方法，其特征在于該方法基于陽離子型水溶性共軛聚合物和透明質酸HA探針，包括以下步驟: 1)制備結合熒光猝滅劑的透明質酸探針； 2)將陽離子型水溶性共軛聚合物與所述透明質酸探針結合，進行熒光檢測； 3)在透明質酸探針中加入透明質酸酶，待其與透明質酸酶作用后，在其中加入陽離子水溶性共軛聚合物，再次進行熒光檢測。
2.根據權利要求1所述的一種檢測透明質酸酶的熒光方法，其特征在于熒光猝滅劑包括阿霉素DOX的小分子熒光猝滅劑。
3.根據權利要求1所述的一種檢測透明質酸酶的熒光方法，其特征在于所述陽離子型水溶性共軛聚合物，其熒光發射由于與阿霉素熒光猝滅劑之間的電子轉移能夠被猝滅。
4.根據權利要求1所述的一種檢測透明質酸酶的熒光方法，其特征在于所述陽離子型水溶性共軛聚合物與透明質酸探針是通過靜電吸引作用結合。
5.根據權利要求1所述的一種檢測透明質酸酶的熒光方法，其特征在于所述透明質酸探針與透明質酸酶的作用，是透明質酸酶將透明質酸鏈水解為透明質酸短鏈的過程。
6.根據權利要求1所述的一種檢測透明質酸酶的熒光方法，其特征在于所述的熒光檢測中，所使用的緩沖溶液是0.15M NaCU0.02M PBS緩沖液，pH = 5.6。
7.根據權利要求1所述的一種檢測透明質酸酶的熒光方法，其特征在于所述的熒光檢測中，溫度為25°C。
8.根據權利要求1所述的一種檢測透明質酸酶的熒光方法，其特征在于所述熒光檢測，是加入透明質酸酶溶液在37°C下孵育30分鐘后測量熒光發射光譜。
9.根據權利要求1所述的一種檢測透明質酸酶的熒光方法，其特征在于所述的熒光檢測是用熒光分光光度計進行檢測，激發波長在陽離子型水溶性共軛聚合物最大紫外-可見吸收峰處，發射波長掃描范圍為415 — 600nm。
【文檔編號】G01N21/64GK104390947SQ201410669140
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月20日 優先權日:2014年11月20日
【發明者】黃艷琴, 宋彩霞, 劉興奮, 范曲立, 黃維 申請人:南京郵電大學