基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的sers基底制備方法
【專利摘要】一種基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的SERS基底制備方法,通過滾環擴增技術將小段引物延伸后,核殼納米金結構組裝的互補單鏈與其相互雜交,彎曲易折的長單鏈變成伸展雙鏈的過程中核殼納米金等距離地嵌入到雙鏈中,利用滾環擴增技術的序列延伸實現信號放大、核殼納米結構自身以及通過DNA雜交實現距離控制所得的納米金結構之間的拉曼信號疊加,實現信號高效相對均一的SERS基底制備,從而可應用于生物分子的高效靈敏檢測、生物傳感器領域。該技術的序列延伸實現信號放大、實現距離控制所得的納米金結構之間的拉曼信號疊加,實現信號高效相對均一的SERS基底制備。
【專利說明】基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的SERS基底制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于DNA納米技術及納米材料的功能化及應用領域,涉及一種基于滾環擴增技術及核殼納米金結構的高效SERS基底的制備方法,可應用于生物分子檢測、生物傳感器等領域。
【背景技術】
[0002]表面增強拉曼散射(SurfaceEnhanced Raman scattering, SERS)是指位于粗糖金屬表面的小分子本身的拉曼信號得到增強的現象。這種現象已在表面科學、分析科學和生物科學等領域得到廣泛的應用,為深入表征各種表面(界面)的結構和過程提供分子水平上的信息,如鑒別分子或離子在表面的鍵合、構型和取向以及材料的表面結構。關于SERS的增強機制,雖然到目前仍存在爭議,但較為認可的是電磁場增強機理,而該機理中涉及到的“熱點”(hot spot)—般是指在一些納米粒子組成的聚集體中,相鄰的納米粒子之間的空隙之處的區域。此區域的SERS效應最強。如何能構建高效均一含有更多的“熱點”的SERS基底,已成為SERS研究領域的熱點和難點。
[0003]現在的研究中,構建高效均一基底的常見方法有如下幾種:
a:金屬電極活性基底,這是目前使用較為廣泛的一種基底。通過電極表面進行適當的粗糙化處理,可以產生粗糙度基本處于宏觀粗糙度與亞微觀粗糙度范圍內。這種方式的缺點是多數金屬經過處理后,表面粗糙尺度變化范圍較大,造成基底上個點表面增強效應變化很大,這種結構上的不均一性直接影響了吸附分子的SERS光譜的穩定性及數據的重現性。
[0004]b:化學刻蝕和化學沉積的活性基底,是通過強腐蝕性物質把金屬表面的原子通過化學反應溶解掉來達到表面粗糙化的目的。這種方式的缺點是反應條件較難控制、沉積的時間、反應的溫度、試劑的濃度等都對基底的粗糙度有影響。
[0005]另外還有平板印刷技術、自助裝技術、有序組裝技術等來制備活性基底,但都存在各自的缺點從而限制了 SERS技術的發展及應用。
【發明內容】
[0006]為克服現有技術的不足,本發明提供一種基于滾環擴增技術及核殼納米金結構的高效SERS基底的制備方法。
[0007]—種基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的SERS基底制備方法,其特征在于,通過滾環擴增技術將小段引物延伸后,核殼納米金結構組裝的互補單鏈與其相互雜交,彎曲易折的長單鏈變成伸展雙鏈的過程中核殼納米金等距離地嵌入到雙鏈中,通過納米金結構自身以及相互之間的拉曼信號,實現高效SERS基底的制備,從而可應用于生物分子的高效靈敏檢測、生物傳感器領域;
所述的滾環擴增技術為單引物的滾環擴增技術以及多引物的超分支滾環擴增技術。
[0008]所述的小段引物為長度在10_40bp的一段無標記人工合成單鏈DNA。
[0009]所述的核殼納米金結構為尺寸介于30_50nm的納米金核殼結構,核殼中間存在l_3nm縫隙,且縫隙里吸附有拉曼小分子,如DTNB (5D0,全稱是5,5’-dith1bis (2-nitrobenzoic acid),中文名:5, 5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)),Cy3(cyanine-3), Cy5 (cyanine-5),FITC (fluorescein isoth1cyannate),批P定。
[0010]所述的互補單鏈為序列上與擴增所用的環模板相同或部分相同的一段經過巰基或生物素標記的一段DNA序列。
[0011]所述的彎曲易折的長單鏈為滾環擴增后所得的數量可達幾十kbp,長度可達數微米的單鏈DNA。
[0012]所述的伸展雙鏈為擴增產物長單鏈與互補鏈雜交后,單鏈本身的二級結構等打開,形成的均一雙鏈或是間斷性均一雙鏈。
[0013]所述的等距離地嵌入到雙鏈為納米金通過組裝巰基的互補鏈或組裝有親和素的納米金與生物素標記的互補鏈連接,實現嵌入。
[0014]所述的納米金結構自身以及相互之間的拉曼信號為核殼納米金自身拉曼信號以及核殼結構之間形成的拉曼信號的疊加。
[0015]利用滾環擴增技術的序列延伸實現信號放大、核殼納米結構自身以及通過DNA雜交實現距離控制所得的納米金結構之間的拉曼信號疊加,實現信號高效相對均一的SERS基底制備。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]附圖1為經過滾環擴增之后,得到長單鏈DNA與互補序列充分雜交后所得的雙鏈結構的AFM成像,圖中雙鏈結構較為均一,伸展性良好。圖片掃描尺寸為10 μ m。
【具體實施方式】
[0017]實施例1:
5 μ L 100 μ Μ預成環DNA與10 μ L 100 μ M待測核酸序列加入到0.5mL離心管中。C混合均勻,90°C下lmin,當管中溶液自然冷卻到室溫時,加入3μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液,25°C環境下連接16小時以上,結束后,65°C條件下酶變性lOmin,酶作用完全后,用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液,為環狀DNA模板溶液。
[0018]8μ L milliQ 加入以下溶液:環狀 DNA模板(6μ L),dNTPs (2 μ L, 10 mM), RCAbuffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。90°C條件下酶變性lOmin,4°C環境下保存待用。
[0019]3μ L 上述擴增產物,milliQ water (12 μ L )預成環 DNA (100 μ Μ, 3 μ L), ΤΑΕ 緩沖液(125mM Mg2+,2yL)總體積為20yL混合均勻后,95°C (5min),37°C降至4°C (每20s降低0.2°C),時間約為1.5h進行DNA雜交反應。雜交溶液2 ix L加入18 μ L milliQ 7欠,充分混勻后,取5 μ L滴到平整清潔云母表面,吸附3min后,Mill1-Q滴流沖洗,原子力顯微鏡Tapping-mode 成像。
[0020]實施例2:
5μ L 100 μ Μ預成環DNA與10 μ L 100 μ Μ待測核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻,90°C下lmin,當管中溶液自然冷卻到室溫時,加入3μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液,25°C環境下連接16小時以上,結束后,65°C條件下酶變性lOmin,酶作用完全后,用30KD的超濾管超濾(lOOOOrpm/min, 5min),收集底部溶液,為環狀DNA模板溶液。
[0021]8μ L milliQ加入以下溶液:環狀DNA模板(6μ L),b1-dNTPs (2 μ L, 1 mM),RCAbuffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。90°C條件下酶變性lOmin,4°C環境下保存待用。
[0022]3μ L 上述擴增產物,milliQ water (12 μ L )預成環 DNA (100 μ Μ, 3 μ L), ΤΑΕ 緩沖液(125mM Mg2+,2yL)總體積為20yL混合均勻后,95°C (5min),37°C降至4°C (每20s降低0.2°C ),時間約為1.5h進行DNA雜交反應。
[0023]2uL lOmM avidin加入上述雜交產物中,室溫下反應連接lh。后取此溶液2 μ L加入18 μ L mi 11 iQ水,充分混勻后,取5 μ L滴到平整清潔云母表面,吸附3min后,Mi 11 i_Q滴流沖洗,原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0024]實施例3:
5μ L 100 μ Μ預成環DNA與10 μ L 100 μ Μ待測核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻,90°C下lmin,當管中溶液自然冷卻到室溫時,加入3μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液,25°C環境下連接16小時以上,結束后,65°C條件下酶變性lOmin,酶作用完全后,用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液,為環狀DNA模板溶液。
[0025]8yL milliQ 加入以下溶液:環狀 DNA 模板(6yL),dNTPs (2 μ L, 1 mM), RCAbuffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。90°C條件下酶變性lOmin,4°C環境下保存待用。
[0026]3 μ L 上述擴增產物,milliQ water (12 μ L ), b1-預成環 DNA (100 μ M, 3 μ L),ΤΑΕ緩沖液(125mM Mg2+,2 μ L)總體積為20 μ L混合均勻后,95°C (5min),37°C降至4°C(每20s降低0.2°C ),時間約為1.5h進行DNA雜交反應。
[0027]2uL 10mM avidin加入上述雜交產物中,室溫下反應連接lh。后取此溶液2 μ L加入18 μ L mi 11 iQ水,充分混勻后,取5 μ L滴到平整清潔云母表面,吸附3min后,Mi 11 i_Q滴流沖洗,原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0028]實施例4:
5μ L 100 μ Μ預成環DNA與10 μ L 100 μ Μ待測核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻,90°C下lmin,當管中溶液自然冷卻到室溫時,加入3μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液,25°C環境下連接16小時以上,結束后,65°C條件下酶變性lOmin,酶作用完全后,用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液,為環狀DNA模板溶液。
[0029]8yL milliQ 加入以下溶液:環狀 DNA 模板(6yL),dNTPs (2 μ L, 1 mM), RCAbuffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。90°C條件下酶變性lOmin,4°C環境下保存待用。
[0030]3 μ L 上述擴增產物,milliQ water (12 μ L ), b1-預成環 DNA (100 μ M, 3 μ L),ΤΑΕ緩沖液(125mM Mg2+,2 μ L)總體積為20 μ L混合均勻后,95°C (5min),37°C降至4°C(每20s降低0.2°C ),時間約為1.5h進行DNA雜交反應。
[0031]lmL 5nm金溶液中,加入20yL lmg/mL streptavidin,充分混勻后,室溫下吸附連接lh,加入200yL BSA (10%)溶液,封閉30min后,超濾管過濾,回收100 μ LAu-streptavidin 產物。
[0032]10 μ L Au-streptavidin加入上述雜交產物中,室溫下反應連接lh。后取此溶液2uL加入18 μ L milliQ水,充分混勻后,取5 μ L滴到平整清潔云母表面,吸附3min后,Mill1-Q滴流沖洗,原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0033]實施例5
5μ L 100 μ Μ預成環DNA與10 μ L 100 μ Μ待測核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻,90°C下lmin,當管中溶液自然冷卻到室溫時,加入3μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液,25°C環境下連接16小時以上,結束后,65°C條件下酶變性lOmin,酶作用完全后,用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液,為環狀DNA模板溶液。
[0034]8yL milliQ 加入以下溶液:環狀 DNA 模板(6yL),dNTPs (2 μ L, 1 mM), RCAbuffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。90°C條件下酶變性lOmin,4°C環境下保存待用。
[0035]3 μ L 上述擴增產物,milliQ water (12 μ L ), b1-預成環 DNA (100 μ M, 3 μ L),ΤΑΕ緩沖液(125mM Mg2+,2 μ L)總體積為20 μ L混合均勻后,95°C (5min),37°C降至4°C(每20s降低0.2°C ),時間約為1.5h進行DNA雜交反應。
[0036]lmL 5nm金溶液中,加入20yL lmg/mL streptavidin,充分混勻后,室溫下吸附連接lh,加入200yL BSA (10%)溶液,封閉30min后,超濾管過濾,回收100 μ LAu-streptavidin 產物。
[0037]10 μ L Au-streptavidin加入上述雜交產物中,室溫下反應連接lh。后取此溶液2uL加入18 μ L milliQ水,充分混勻后,取5 μ L滴到平整清潔云母表面,吸附3min后,Mill1-Q滴流沖洗,原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0038]實施例6:
5μ L 100 μ Μ預成環DNA與10 μ L 100 μ Μ待測核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻,90°C下lmin,當管中溶液自然冷卻到室溫時,加入3μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液,25°C環境下連接16小時以上,結束后,65°C條件下酶變性lOmin,酶作用完全后,用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液,為環狀DNA模板溶液。
[0039]8yL milliQ 加入以下溶液:環狀 DNA 模板(6yL),dNTPs (2 μ L, 1 mM), RCAbuffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。90°C條件下酶變性lOmin,4°C環境下保存待用。
[0040]3 μ L 上述擴增產物,milliQ water (12 μ L ), b1-預成環 DNA (100 μ M, 3 μ L),ΤΑΕ緩沖液(125mM Mg2+,2 μ L)總體積為20 μ L混合均勻后,95°C (5min),37°C降至4°C(每20s降低0.2°C ),時間約為1.5h進行DNA雜交反應。
[0041]lmL 15nm金溶液中,加入20yL lmg/mL streptavidin,充分混勻后,室溫下吸附連接 lh,加入 200yL BSA (10%)溶液,封閉 30min后,離心洗滌 3 次(12500rpm/min, 20min)回收 100 μ L Au-streptavidin 產物。
[0042]10 μ L Au-streptavidin加入上述雜交產物中,室溫下反應連接lh。后取此溶液2uL加入18 μ L milliQ水,充分混勻后,取5 μ L滴到平整清潔云母表面,吸附3min后,Mill1-Q滴流沖洗,原子力顯微鏡Tapping-mode成像。
[0043]實施例7: 5μ L 100 μ Μ預成環DNA與10 μ L 100 μ M待測核酸序列加入到0.5mL離心管中混合均勻,90°C下lmin,當管中溶液自然冷卻到室溫時,加入3μ LT4連接酶及2 μ LT4連接酶緩沖液,25°C環境下連接16小時以上,結束后,65°C條件下酶變性lOmin,酶作用完全后,用30KD的超濾管超濾(10000rpm/min, 5min),收集底部溶液,為環狀DNA模板溶液。
[0044]8yL milliQ 加入以下溶液:環狀 DNA 模板(6yL),dNTPs (2 μ L, 1 mM), RCAbuffer (2 μ L, 10 X), phi29 polymerase (2 μ L, 10 U/μ L),混合溶液終體積為 20 μ L。然后30°C水浴中擴增30 min。90°C條件下酶變性lOmin,4°C環境下保存待用。
[0045]3 μ L 上述擴增產物,milliQ water (12 μ L ), b1-預成環 DNA (100 μ M, 3 μ L),ΤΑΕ緩沖液(125mM Mg2+,2 μ L)總體積為20 μ L混合均勻后,95°C (5min),37°C降至4°C(每20s降低0.2°C ),時間約為1.5h進行DNA雜交反應。
[0046]10(^1^,1011]\1粒徑為1511111的納米金中加入4 4 1^,10(^]\1 SH-polyA (15 個 A 序列)DNA,室溫輕微振蕩過夜;后加入老化液0.1M PB (pH7.4)溶液10 μ L,室溫條件350rpm/min振蕩30min,后加入2M NaCl 20 μ L,分四次加入,間隔為30min,室溫下350rpm/min振蕩過夜;4°C,12000rpm/min,20min條件下進行離心洗滌三次,洗滌液為lOmMPB,后lmL0.1M PBS重懸浮;100 μ L 0.1Μ 5D0小分子溶液加入到500 μ L上述溶液中,室溫下350rpm/min振蕩,吸附 2-3 天。取 100 μ L 上述溶液然后加入 50 μ L1%PVP, 25 μ L lOmM NH20H *HC1,25 μ L5mM HAuC14,混勻振蕩lmin后20°C 4000rpm/min,每次6min離心洗漆三次,洗漆液為MilliQ水,后100μ LMilliQ水重懸浮;該方式制備得到的粒徑在35nm左右,濃度為InM,具備高增強特征峰的一種核殼納米金結構。
[0047]lmL核殼納米金結構中,加入20 μ L lmg/mL streptavidin,充分混勻后,室溫下吸附連接lh,加入200 μ L BSA (10%)溶液,封閉30min后,離心洗滌3次(8000rpm/min,20min)回收 100 μ L 核殼 Au-streptavidin 產物。10 μ L 核殼 Au-streptavidin 加入上述雜交產物中,室溫下反應連接lh。后取此溶液2 μ L加入18 μ L milliQ水,充分混勻后,取5 μ L滴到平整清潔云母表面,吸附3min后,Mill1-Q滴流沖洗,原子力顯微鏡Tapping-mode成像。取10 μ L滴到錫箔上,進行ΤΕΜ成像。取10 μ L滴到硅片上,進行SERS信號檢測。
【權利要求】
1.一種基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的SERS基底制備方法,其特征在于,通過滾環擴增技術將小段引物延伸后,核殼納米金結構組裝的互補單鏈與其相互雜交,彎曲易折的長單鏈變成伸展雙鏈的過程中核殼納米金等距離地嵌入到雙鏈中,通過納米金結構自身以及相互之間的拉曼信號,實現高效SERS基底的制備,從而可應用于生物分子的高效靈敏檢測、生物傳感器領域。
2.根據權利要求1所述基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的SERS基底制備方法,其特征在于,所述的滾環擴增技術為單引物的滾環擴增技術以及多引物的超分支滾環擴增技術。
3.根據權利要求1所述基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的SERS基底制備方法,其特征在于,所述的小段引物為長度在10-40bp的一段無標記人工合成單鏈DNA。
4.根據權利要求1所述基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的SERS基底制備方法,其特征在于,所述的核殼納米金結構為尺寸介于30-50nm的納米金核殼結構,核殼中間存在l_3nm縫隙,且縫隙里吸附有拉曼小分子,如DTNB (MO,全稱是5,5’-dith1bis (2-nitrobenzoic acid),中文名:5, 5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)),Cy3(cyanine-3), Cy5 (cyanine-5),FITC (fluorescein isoth1cyannate),批P定。
5.根據權利要求1所述基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的SERS基底制備方法,其特征在于,所述的互補單鏈為序列上與擴增所用的環模板相同或部分相同的一段經過巰基或生物素標記的一段DNA序列。
6.根據權利要求1所述基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的SERS基底制備方法,其特征在于,所述的彎曲易折的長單鏈為滾環擴增后所得的數量可達幾十kbp,長度可達數微米的單鏈DNA。
7.根據權利要求1所述、基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的SERS基底制備方法,其特征在于,所述的伸展雙鏈為擴增產物長單鏈與互補鏈雜交后,單鏈本身的二級結構等打開,形成的均一雙鏈或是間斷性均一雙鏈。
8.根據權利要求1所述基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的SERS基底制備方法,其特征在于,所述的等距離地嵌入到雙鏈為納米金通過組裝巰基的互補鏈或組裝有親和素的納米金與生物素標記的互補鏈連接,實現嵌入。
9.根據權利要求1所述基于滾環擴增技術和核殼納米金結構的SERS基底制備方法,其特征在于,所述的納米金結構自身以及相互之間的拉曼信號為核殼納米金自身拉曼信號以及核殼結構之間形成的拉曼信號的疊加。
【文檔編號】G01N21/65GK104406952SQ201410661203
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月19日 優先權日:2014年11月19日
【發明者】何丹農, 顏娟, 胡沖婭 申請人:上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司