一種電化學發光適配體傳感器、其制備方法及其用途
一種電化學發光適配體傳感器、其制備方法及其用途
【專利摘要】本發明涉及一種電化學發光適配體傳感器、其制備方法及其用途，更具體而言，本發明涉及一種基于Eu(III)-MWCNTs作為發光材料構建的電化學發光適配體傳感器、其制備方法，以及由該方法制備的電化學發光適配體傳感器在測定凝血酶中的用途。本發明的電化學發光適配體傳感器表現出優良的準確性、穩定性、重現性與高的靈敏度，對推廣適配體傳感器在疾病預防、疾病診斷和藥物篩選中的實際應用具有重要的意義。
【專利說明】一種電化學發光適配體傳感器、其制備方法及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種電化學發光適配體傳感器、其制備方法及其用途，更具體而言，本發明涉及一種基于Eu (III)-多壁碳納米管(MWCNTs)作為發光材料構建的電化學發光適配體傳感器、其制備方法，以及由該方法制備的電化學發光適配體傳感器在測定凝血酶中的用途。
【背景技術】
[0002]凝血酶是由凝血酶原活化變成的絲氨酸蛋白質水解酶。它在炎癥、血液凝固和創傷愈合等方面發揮著極其重要的作用，常用于毛細血管出血的局部止血和外科手術后組織的愈合。凝血酶的濃度及活性作為衡量凝血機制的重要指標之一，對早期診斷、療效及愈后判斷具有十分重要的意義。因此建立準確、快速、高靈敏檢測凝血酶濃度的方法是十分必要的。在傳統檢測方法中，凝血酶的檢測主要是利用抗體與抗原之間的特異作用，然而由于抗體在制備、保存等方面存在缺點，因此在一定程度上限制了它的發展。適配體與抗體類似，除了可以與很多目標分子高親和力、高特異性地結合，而且還具有許多抗體無法比擬的優點，例如:(I)目標分子范圍廣泛；(2)體外篩選、化學合成；(3)分子量小；(4)性質穩定。這對提高傳感器的使用壽命、穩定性、再生性等非常有利。由于適配體具有以上提及的許多優點，將適體一配體識別技術與其他分析方法結合而發展形成了各種形式的適配體傳感器，主要有熒光適配體傳感器、電化學適配體傳感器以及電化學發光(ECL)適配體傳感器等。其中電化學發光適配體傳感器集成了電化學發光傳感器和適配體兩方面的優勢，既具有電化學發光傳感器的高靈敏度、儀器簡單、可進行原位發光分析等優點，又具有適配體的高選擇性和特異性，從而提高了傳感器的靈敏度、選擇性和穩定性，在凝血酶檢測方面具有廣闊的應用前景。
[0003]目前，常見的電化學發光物質主要有釕聯吡啶及其衍生物、魯米諾及其衍生物、發光納米材料。近期，通過對發光納米粒子在生物體內循環和安全性的研究，人們發現除了含毒性元素的納米粒子(如CdSe量子點)在生物體內具有毒副作用外，其他生物相容性好的納米材料(如ZnO、S12, Au等)也表現出了毒性，而且交叉學科的研究證實了在同樣尺寸下發光納米材料中的碳納米材料在生物體內毒性表現最低，所以目前發光碳納米材料被認為是一種非常理想的具有應用前景的檢測材料，備受人們的廣泛關注。發光功能化碳納米材料不僅在化學穩定性、生物相容性、低毒性等方面都具有明顯的優勢，此外還具有光學性能穩定、水溶性好、易功能化等優點。因此開發既具有載體功能又具有發光功能的碳納米材料在生命科學和材料科學研究中具有重要意義，而Eu (III)-MWCNTs作為發光材料用于構建檢測凝血酶的電化學發光適配體傳感器尚未見報道。
[0004]本發明將金摻雜的石墨烯滴涂到玻碳電極表面，用于固定捕獲探針，Eu(III)-MWCNTs作為發光材料，利用雜交鏈式反應信號放大和基于核酸外切酶RecJf的目標物循環信號放大策略，制備了檢測凝血酶的電化學發光適配體傳感器，測試結果顯示，上述方法制備的電化學發光適配體傳感器的靈敏度、選擇性和穩定性高，基于上述發現，發明人完成了本發明。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是提供一種電化學發光適配體傳感器，所述電化學發光適配體傳感器包括:工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾金摻雜的石墨烯、捕獲探針與凝血酶適配體的混合溶液、巰基己醇(MCH)、含0.15U/μ L RecJf 的凝血酶、NH2-DNAl 和 NH2_DNA2 的混合溶液和 Eu (III) -MWCNTs。
[0006]本發明的再一個目的在于提供一種電化學發光適配體傳感器的制備方法，所述方法制備的傳感器靈敏度高、重現性好。
[0007]本發明的另一目的是提供所述電化學發光適配體傳感器在測定凝血酶中的用途。
[0008]為了解決上述技術問題，本發明是通過以下措施來實現的。
[0009]本發明的電化學發光適配傳感器包括:工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾金摻雜的石墨烯、捕獲探針與凝血酶適配體的混合溶液、巰基己醇、含0.15 U/μ L RecJf的凝血酶、NH2-DNAl和NH2_DNA2的混合溶液和Eu (III) -MWCNTs0所述工作電極與參比電極、對電極組成電化學發光適配體傳感器來檢測凝血酶。所述參比電極為Ag/AgCl電極，所述對電極為鉬絲電極。所述捕獲探針為5’ -SH- (CH2)「ΑΛΤ TGG AGT CAC CCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CT-3’，凝血酶適配體為5’-AAA AGT CCG TGG TAG GGC AGG TGG GGG TGA CT-(CH2) 6_3’。所述 NH2-DNAl 片段序列為 5，-NH2- (CH2) 6-AGT CAC CCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CTT GM ACA GTC CGT GGT AGGGCA GGT TGG GGT GAC TCC AAT T-(CH2) 6-NH2_3，，NH2_DNA2 片段序列為 5，-NH2-(CH2) 6_GTTTCA AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CTA ATT GGA GTC ACC CCA ACC TGC CCT ACCACG GAC T- (CH2) 6_ΝΗ2_3，。
[0010]本發明的電化學發光適配體傳感器的制備方法包括以下步驟:
a、合成Eu(In)-MWCNTs納米材料；
b、制備電化學發光適配體傳感器工作電極； d、制作電化學發光適配體傳感器工作曲線。
[0011]其中，步驟a的合成Eu(Iii)-MWCNTs納米材料，具體包括以下步驟:
①稀土配合物Eu(TTA)3的合成:將含有1.0 mo I/L KOH的乙醇溶液和五水硝酸銪混合，然后加入15 mL的乙醇和2-噻吩甲酰三氟丙酮(與五水硝酸銪的物質的量之比3:1)，混合溶液在攪拌下加熱至60 °C反應6 h。冷卻至室溫后加水繼續攪拌30 min，得到的固體用乙醇重結晶，經空氣中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物 Eu (TTA)3O
[0012]②Eu(III)-MWCNTs的合成:將羧基化的多壁碳納米管、無水二氯甲烷(DCM)和草酰氯(體積比為40:1)混合后在室溫下攪拌12 h，通過減壓蒸餾去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空干燥2 h。將上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超聲10 min,然后加入含有6，6- 二氨基-2，2-聯吡啶(與羧基化的多壁碳納米管的質量之比為3:1)的10 mL DCM,混合物在室溫下攪拌24 h，過濾，并用15 mL的DCM沖洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修飾的多壁碳納米管。稱取稀土配合物修飾的多壁碳納米管，上述步驟①制備的Eu(TAA)3 (質量之比為1:2)和10 mL DCM混合，在室溫下攪拌28 h后過濾，用150 mL DCM洗滌，真空干燥后得到Eu (III)-MWCNTs。
[0013]步驟b的制備電化學發光適配體傳感器工作電極的方法，具體包括以下步驟:
①將玻碳電極表面進行拋光處理使其表面光潔；
②配制濃度為Img/mL的金摻雜的石墨烯溶液。然后將金摻雜的石墨烯溶液滴到電極上，室溫晾干；
③將捕獲探針與凝血酶適配體混合溶液滴到電極表面，4V孵化12 h；
④再在電極表面修飾2mmol/L的MCH溶液以消除電極的非特異性活性位點。用pH為7.4的PBS溶液對電極進行清洗，晾干后，滴上一系列不同濃度的凝血酶(含0.15 U/μ LRecJf)溶液，放置 40 min ；
⑤將NH2-DNAl和NH2-DNA2的混合溶液修飾到電極上，放置Ih；
⑥EDC和NHS(50 mmol/L)加入到1.5 mg/mL Eu (III)-MWCNTs中得到混合溶液并將其滴到電極上，放置2 h，即得到電化學發光適配體傳感器的工作電極。
[0014]步驟c的制作電化學發光適配體傳感器工作曲線，步驟如下:
①將參比電極一Ag/AgCl電極、對電極一鉬絲電極和上述制備的工作電極，連接在化學發光檢測儀的暗盒中，將電化學工作站和化學發光檢測儀連接在一起，光電倍增光的高壓設置為800 V，掃描電壓設置為-2.0?O V ;
②pH7.4的PBS緩沖溶液(含0.10 mol/L的K2S2O8)作為底液，通過電化學發光法檢測不同濃度的凝血酶產生的電化學發光信號強度；根據所得的電化學發光強度與凝血酶濃度的線性關系，繪制工作曲線。
[0015]本發明的另一方面提供上述方法制備的電化學發光適配體傳感器在測定凝血酶中的用途。
[0016]本發明的有益成果:
(I)本發明的發明人首次將Eu (III) -MWCNTs作為新型發光材料引入到凝血酶的電化學發光適配體傳感器的制備當中，利用Eu(III)-MWCNTs具有高的量子產率、低毒性和長的發光壽命，使所制作的傳感器有更高的靈敏度。
[0017](2)在本發明的制備方法中，利用核酸外切酶RecJf選擇性地剪切目標物凝血酶特異性結合的適配體，從而釋放出來凝血酶，釋放出的凝血酶將繼續和其適配體結合，這樣可使一個待測目標物凝血酶產生多個信號單元，放大了檢測信號，提高了傳感器的靈敏度。
[0018](3)NH2-DNA1和NH2_DNA2片段序列在電極表面通過堿基互補配對進行雜交鏈式反應形成一條長的雙鏈DNA，利用氨基和羧基的作用，從而引入更多的Eu(III) - MWCNTs發光材料，因此進一步增強了 ECL的信號。
[0019](4)該傳感器集成了適配體和電化學發光傳感器兩方面的優勢，因此本發明的電化學發光適配體傳感器表現出了優良的準確性、穩定性、重現性與高的靈敏度，對推廣適配體傳感器在疾病預防、疾病診斷和藥物篩選中的實際應用具有重要的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]下面結合【專利附圖】
【附圖說明】和具體實施例對本發明做進一步詳細描述。
[0021]圖1為本發明的(a)不存在凝血酶和核酸外切酶RecJf, (b)存在凝血酶(濃度為5.0X 10_9 mol/L)而不存在核酸外切酶RecJf, (c)存在凝血酶(濃度為5.0X 10_9 mol/U和核酸外切酶RecJf時的光強-電位圖。
[0022]為了考察核酸外切酶RecJf是否具有放大ECL信號的作用，本實驗對比研究了有無核酸外切酶RecJf存在時的光強-電位曲線圖。從圖1中可以看出，無目標物凝血酶存在時，ECL的強度較低(曲線a)。當有凝血酶存在而無核酸外切酶RecJf時發光信號有所增強(曲線b)。當在凝血酶中加上核酸外切酶RecJf后發光信號明顯增強(曲線c)，表明核酸外切酶RecJf確實具有放大發光信號的作用。
【具體實施方式】
[0023]本發明使用的凝血酶購自Sigma公司，捕獲探針、凝血酶適配體、NH2-DNAl片段序列和NH2-DNA2片段序列均購自上海生工生物工程有限公司，羧基化的多壁碳納米管購自南京先豐納米材料科技有限公司，核酸外切酶RecJf購自美國NEB公司，K2S2O8購自上海愛建設試劑廠有限公司，巰基己醇購自阿拉丁試劑有限公司，無水乙醇(分析純)購自天津市福寧精細化工有限公司，鐵氰化鉀購于國藥集團化學試劑有限公司，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)U-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)購自上海思域化工有限公司，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均購于天津市廣成化學試劑有限公司，除了玻碳電極用超純水清洗外，整個實驗過程用的均是二次水。
[0024]CHI760D電化學工作站購自上海辰華儀器有限公司，MP1-F流動注射化學發光檢測儀購自西安瑞邁分析儀器有限公司。
[0025]實施例1制備電化學發光適配體傳感器
(I)合成Eu(In)-MWCNTs納米材料
稀土配合物Eu(TTA)3的合成:將9mL含有1.0 mo I/L KOH的乙醇溶液和1.28 g (3mmol)的五水硝酸銪混合,然后加入15 mL的乙醇和2 g 2-噻吩甲酰三氟丙酮(9 mmol),混合溶液在攪拌下加熱至60 °C反應6 h。冷卻至室溫后加水繼續攪拌30 min，得到的固體用乙醇重結晶，經空氣中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物 Eu (TTA)3；
Eu(III)-MWCNTs的合成:在50 mL的圓底燒瓶中將100 mg的羧基化的多壁碳納米管、20 mL的無水二氯甲烷(DCM)和0.5 mL的草酰氯混合后在室溫下攪拌12 h，通過減壓蒸餾去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空中干燥2 h。將上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超聲10 min，然后加入含有300 mg的6，6-二氨基-2，2-聯吡啶的10 mL DCM,混合物在室溫下攪拌24 h，過濾，并用15 mL的DCM沖洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修飾的多壁碳納米管。稱取50 mg稀土配合物修飾的多壁碳納米管、100 mg上述步驟①制備的Eu(TAA)3和10 mL DCM混合，在室溫下攪拌28 h后將所得物過濾，用150 mL DCM洗滌，真空干燥后得到Eu (III)-MWCNTs。
[0026](2)制備電化學發光適配體傳感器工作電極
①將直徑為4mm的玻碳電極用1.0、0.3、0.05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2?0.6 V掃描，使峰電位差小于110 mV，用超純水清洗電極表面，吹干；
②配制濃度為Img/mL的金摻雜的石墨烯溶液。然后取6 KL金摻雜的石墨烯溶液滴到電極上，室溫晾干； ③將10yL 2 μ mol/L的捕獲探針與凝血酶適配體混合溶液滴到電極表面，4 V孵化 12 h ;
④再在電極表面修飾5μ L 2 mmol/L的MCH溶液以消除電極的非特異性活性位點。用PH為7.4的PBS溶液對電極進行清洗，晾干后，滴上10 μ L—系列不同濃度的凝血酶(含0.15 U/μ L RecJf)溶液，放置 40 min ；
⑤將10μ L I μ mol/L的NH2-DNAl和NH2_DNA2的混合溶液修飾到電極上，放置Ih ；
⑥EDC和NHS(50 mmol/L)加入到1.5 mg/mL Eu (III)-MWCNTs中得到混合溶液，取其6 PL滴到電極上，放置2 h，即得到電化學發光適配體傳感器的工作電極。
[0027](3)制作電化學發光適配體傳感器工作曲線
將參比電極一Ag/AgCl電極、對電極一鉬絲電極和上述制備的工作電極，連接在化學發光檢測儀的暗盒中，將電化學工作站和化學發光檢測儀連接在一起，光電倍增光的高壓設置為800 V，掃描電壓設置為-2.0?O V ;
PH 7.4的PBS緩沖溶液(含0.10 mol/L的K2S2O8)作為底液，通過電化學發光法檢測不同濃度的凝血酶產生的電化學發光信號強度；根據所得的電化學發光強度與凝血酶濃度的線性關系，繪制工作曲線。
[0028]實施例2凝血酶的檢測
按照實施例1所述的步驟制備電化學發光適配體傳感器用于凝血酶的檢測。凝血酶的線性范圍為 5 ΧΙΟ—9 ?1.0 ΧΙΟ—12 mol/L，檢出限為 0.23 pmol/L。
[0029]將實施例2得到的結果和文獻進行了對比。通過對比可以發現，本發明的電化學發光適配體傳感器的檢出限較低，線性范圍較寬，具有較高的靈敏度，這為凝血酶的實際測定奠定了基礎。
[0030]實施例3人血清中凝血酶的檢測
對人血清中的凝血酶進行了測定和加標回收實驗，根據實施例2所得工作曲線，計算血清中凝血酶的含量。三次測定結果表明，人體血樣的三次測定結果分別為0.589,0.618、0.603 nmol/L，平均凝血酶含量為0.603 nmol/L。同時采用標準加入法，其凝血酶的加入量為0.500 nmol/L,得到的平均回收率為96.8%，相對標準偏差為2.4%。說明本發明的制備方法得到的電化學發光適配體傳感器具有較高的準確度和精密度。
【權利要求】
1.一種電化學發光適配體傳感器的制備方法,所述電化學發光適配體傳感器包括:工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾金摻雜的石墨烯、捕獲探針與凝血酶適配體的混合溶液、巰基己醇(MCH)、含0.15 U/μ L RecJf的凝血酶、NH2-DNAl和NH2-DNA2的混合溶液和Eu(III)-多壁碳納米管(MWCNTs)，所述參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為鉬絲電極，所述捕獲探針為5’-SH-(CH2)6-AAT TGG AGT CACCCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CT-3’，凝血酶適配體為 5’ -AAA AGT CCG TGG TAG GGC AGGTGG GGG TGA CT-(CH2) 6_3’，所述 NH2-DNAl 片段序列為 5’-NH2-(CH2) 6_AGT CAC CCC AACCTG CCC TAC CAC GGA CTT GAA ACA GTC CGT GGT AGG GCA GGT TGG GGT GAC TCC AATT-(CH2) 6-NH2-3’，NH2-DNA2 片段序列為 5’-NH2-(CH2)6-GTT TCA AGT CCG TGG TAG GGC AGGTTG GGG TGA CTA ATT GGA GTC ACC CCA ACC TGC CCT ACC ACG GAC T-(CH2) 6_NH2_3’ ； 其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: a、合成Eu(In)-MWCNTs納米材料； b、制備電化學發光適配體傳感器工作電極； C、制作電化學發光適配體傳感器工作曲線； 其中，步驟a合成Eu(III)-MWCNTs納米材料的具體步驟如下: ①稀土配合物Eu(TTA)3的合成:將含有1.0 mo I/L KOH的乙醇溶液和五水硝酸銪混合，然后加入15 mL的乙醇和2-噻吩甲酰三氟丙酮(與五水硝酸銪的物質的量之比3:1)，混合溶液在攪拌下加熱至60 °C反應6 h，冷卻至室溫后加水繼續攪拌30 min，得到的固體用乙醇重結晶，經空氣中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物 Eu (TTA)3； ②Eu(III)-MWCNTs的合成:將羧基化的多壁碳納米管、無水二氯甲烷(DCM)和草酰氯(體積比為40:1)混合后在室溫下攪拌12 h，通過減壓蒸餾去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空干燥2 h，將上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超聲10 min，然后加入含有6，6-二氨基-2，2-聯吡啶(與羧基化的多壁碳納米管的質量之比為3:1)的1mL DCM,混合物在室溫下攪拌24 h，過濾，并用15 mL的DCM沖洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修飾的多壁碳納米管，稱取稀土配合物修飾的多壁碳納米管，上述步驟①制備的Eu (TAA)3 (質量之比為1:2)和10 mL DCM混合，在室溫下攪拌28 h后過濾，用150 mL DCM洗滌，真空干燥后得到Eu (III)-MWCNTs ； 步驟b制備電化學發光適配體傳感器工作電極的具體步驟如下: ①將玻碳電極表面進行拋光處理使其表面光潔； ②配制濃度為Img/mL的金摻雜的石墨烯溶液,然后將金摻雜的石墨烯溶液滴到電極上，室溫晾干； ③將捕獲探針與凝血酶適配體混合溶液滴到電極表面，4V孵化12 h； ④再在電極表面修飾2mmol/L的MCH溶液以消除電極的非特異性活性位點，用pH為7.4的PBS溶液對電極進行清洗，晾干后，滴上一系列不同濃度的凝血酶(含0.15 U/μ LRecJf)溶液，放置 40 min ； ⑤將NH2-DNAl和NH2-DNA2的混合溶液修飾到電極上，放置Ih； ⑥EDC和NHS(50 mmol/L)加入到1.5 mg/mL Eu (III)-MWCNTs中得到混合溶液并將其滴到電極上，放置2 h，即得到電化學發光適配體傳感器的工作電極； 步驟C制作電化學發光適配體傳感器工作曲線的具體步驟如下: ①將參比電極一Ag/AgCl電極、對電極一鉬絲電極和上述制備的工作電極，連接在化學發光檢測儀的暗盒中，將電化學工作站和化學發光檢測儀連接在一起，光電倍增光的高壓設置為800 V，掃描電壓設置為-2.0?O V ; ②pH7.4的PBS緩沖溶液(含0.10 mol/L的K2S2O8)作為底液，通過電化學發光法檢測不同濃度的凝血酶產生的電化學發光信號強度；根據所得的電化學發光強度與凝血酶濃度的線性關系，繪制工作曲線。
2.如權利要求1所述的電化學發光適配體傳感器在測定凝血酶中的用途。
【文檔編號】G01N21/76GK104374765SQ201410647639
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】吳丹, 魏琴, 胡麗華, 龐雪輝, 馬洪敏 申請人:濟南大學
【專利摘要】本發明涉及一種電化學發光適配體傳感器、其制備方法及其用途，更具體而言，本發明涉及一種基于Eu(III)-MWCNTs作為發光材料構建的電化學發光適配體傳感器、其制備方法，以及由該方法制備的電化學發光適配體傳感器在測定凝血酶中的用途。本發明的電化學發光適配體傳感器表現出優良的準確性、穩定性、重現性與高的靈敏度，對推廣適配體傳感器在疾病預防、疾病診斷和藥物篩選中的實際應用具有重要的意義。
【專利說明】一種電化學發光適配體傳感器、其制備方法及其用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種電化學發光適配體傳感器、其制備方法及其用途，更具體而言，本發明涉及一種基于Eu (III)-多壁碳納米管(MWCNTs)作為發光材料構建的電化學發光適配體傳感器、其制備方法，以及由該方法制備的電化學發光適配體傳感器在測定凝血酶中的用途。
【背景技術】
[0002]凝血酶是由凝血酶原活化變成的絲氨酸蛋白質水解酶。它在炎癥、血液凝固和創傷愈合等方面發揮著極其重要的作用，常用于毛細血管出血的局部止血和外科手術后組織的愈合。凝血酶的濃度及活性作為衡量凝血機制的重要指標之一，對早期診斷、療效及愈后判斷具有十分重要的意義。因此建立準確、快速、高靈敏檢測凝血酶濃度的方法是十分必要的。在傳統檢測方法中，凝血酶的檢測主要是利用抗體與抗原之間的特異作用，然而由于抗體在制備、保存等方面存在缺點，因此在一定程度上限制了它的發展。適配體與抗體類似，除了可以與很多目標分子高親和力、高特異性地結合，而且還具有許多抗體無法比擬的優點，例如:(I)目標分子范圍廣泛；(2)體外篩選、化學合成；(3)分子量小；(4)性質穩定。這對提高傳感器的使用壽命、穩定性、再生性等非常有利。由于適配體具有以上提及的許多優點，將適體一配體識別技術與其他分析方法結合而發展形成了各種形式的適配體傳感器，主要有熒光適配體傳感器、電化學適配體傳感器以及電化學發光(ECL)適配體傳感器等。其中電化學發光適配體傳感器集成了電化學發光傳感器和適配體兩方面的優勢，既具有電化學發光傳感器的高靈敏度、儀器簡單、可進行原位發光分析等優點，又具有適配體的高選擇性和特異性，從而提高了傳感器的靈敏度、選擇性和穩定性，在凝血酶檢測方面具有廣闊的應用前景。
[0003]目前，常見的電化學發光物質主要有釕聯吡啶及其衍生物、魯米諾及其衍生物、發光納米材料。近期，通過對發光納米粒子在生物體內循環和安全性的研究，人們發現除了含毒性元素的納米粒子(如CdSe量子點)在生物體內具有毒副作用外，其他生物相容性好的納米材料(如ZnO、S12, Au等)也表現出了毒性，而且交叉學科的研究證實了在同樣尺寸下發光納米材料中的碳納米材料在生物體內毒性表現最低，所以目前發光碳納米材料被認為是一種非常理想的具有應用前景的檢測材料，備受人們的廣泛關注。發光功能化碳納米材料不僅在化學穩定性、生物相容性、低毒性等方面都具有明顯的優勢，此外還具有光學性能穩定、水溶性好、易功能化等優點。因此開發既具有載體功能又具有發光功能的碳納米材料在生命科學和材料科學研究中具有重要意義，而Eu (III)-MWCNTs作為發光材料用于構建檢測凝血酶的電化學發光適配體傳感器尚未見報道。
[0004]本發明將金摻雜的石墨烯滴涂到玻碳電極表面，用于固定捕獲探針，Eu(III)-MWCNTs作為發光材料，利用雜交鏈式反應信號放大和基于核酸外切酶RecJf的目標物循環信號放大策略，制備了檢測凝血酶的電化學發光適配體傳感器，測試結果顯示，上述方法制備的電化學發光適配體傳感器的靈敏度、選擇性和穩定性高，基于上述發現，發明人完成了本發明。
【發明內容】
[0005]本發明的一個目的是提供一種電化學發光適配體傳感器，所述電化學發光適配體傳感器包括:工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾金摻雜的石墨烯、捕獲探針與凝血酶適配體的混合溶液、巰基己醇(MCH)、含0.15U/μ L RecJf 的凝血酶、NH2-DNAl 和 NH2_DNA2 的混合溶液和 Eu (III) -MWCNTs。
[0006]本發明的再一個目的在于提供一種電化學發光適配體傳感器的制備方法，所述方法制備的傳感器靈敏度高、重現性好。
[0007]本發明的另一目的是提供所述電化學發光適配體傳感器在測定凝血酶中的用途。
[0008]為了解決上述技術問題，本發明是通過以下措施來實現的。
[0009]本發明的電化學發光適配傳感器包括:工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾金摻雜的石墨烯、捕獲探針與凝血酶適配體的混合溶液、巰基己醇、含0.15 U/μ L RecJf的凝血酶、NH2-DNAl和NH2_DNA2的混合溶液和Eu (III) -MWCNTs0所述工作電極與參比電極、對電極組成電化學發光適配體傳感器來檢測凝血酶。所述參比電極為Ag/AgCl電極，所述對電極為鉬絲電極。所述捕獲探針為5’ -SH- (CH2)「ΑΛΤ TGG AGT CAC CCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CT-3’，凝血酶適配體為5’-AAA AGT CCG TGG TAG GGC AGG TGG GGG TGA CT-(CH2) 6_3’。所述 NH2-DNAl 片段序列為 5，-NH2- (CH2) 6-AGT CAC CCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CTT GM ACA GTC CGT GGT AGGGCA GGT TGG GGT GAC TCC AAT T-(CH2) 6-NH2_3，，NH2_DNA2 片段序列為 5，-NH2-(CH2) 6_GTTTCA AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CTA ATT GGA GTC ACC CCA ACC TGC CCT ACCACG GAC T- (CH2) 6_ΝΗ2_3，。
[0010]本發明的電化學發光適配體傳感器的制備方法包括以下步驟:
a、合成Eu(In)-MWCNTs納米材料；
b、制備電化學發光適配體傳感器工作電極； d、制作電化學發光適配體傳感器工作曲線。
[0011]其中，步驟a的合成Eu(Iii)-MWCNTs納米材料，具體包括以下步驟:
①稀土配合物Eu(TTA)3的合成:將含有1.0 mo I/L KOH的乙醇溶液和五水硝酸銪混合，然后加入15 mL的乙醇和2-噻吩甲酰三氟丙酮(與五水硝酸銪的物質的量之比3:1)，混合溶液在攪拌下加熱至60 °C反應6 h。冷卻至室溫后加水繼續攪拌30 min，得到的固體用乙醇重結晶，經空氣中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物 Eu (TTA)3O
[0012]②Eu(III)-MWCNTs的合成:將羧基化的多壁碳納米管、無水二氯甲烷(DCM)和草酰氯(體積比為40:1)混合后在室溫下攪拌12 h，通過減壓蒸餾去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空干燥2 h。將上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超聲10 min,然后加入含有6，6- 二氨基-2，2-聯吡啶(與羧基化的多壁碳納米管的質量之比為3:1)的10 mL DCM,混合物在室溫下攪拌24 h，過濾，并用15 mL的DCM沖洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修飾的多壁碳納米管。稱取稀土配合物修飾的多壁碳納米管，上述步驟①制備的Eu(TAA)3 (質量之比為1:2)和10 mL DCM混合，在室溫下攪拌28 h后過濾，用150 mL DCM洗滌，真空干燥后得到Eu (III)-MWCNTs。
[0013]步驟b的制備電化學發光適配體傳感器工作電極的方法，具體包括以下步驟:
①將玻碳電極表面進行拋光處理使其表面光潔；
②配制濃度為Img/mL的金摻雜的石墨烯溶液。然后將金摻雜的石墨烯溶液滴到電極上，室溫晾干；
③將捕獲探針與凝血酶適配體混合溶液滴到電極表面，4V孵化12 h；
④再在電極表面修飾2mmol/L的MCH溶液以消除電極的非特異性活性位點。用pH為7.4的PBS溶液對電極進行清洗，晾干后，滴上一系列不同濃度的凝血酶(含0.15 U/μ LRecJf)溶液，放置 40 min ；
⑤將NH2-DNAl和NH2-DNA2的混合溶液修飾到電極上，放置Ih；
⑥EDC和NHS(50 mmol/L)加入到1.5 mg/mL Eu (III)-MWCNTs中得到混合溶液并將其滴到電極上，放置2 h，即得到電化學發光適配體傳感器的工作電極。
[0014]步驟c的制作電化學發光適配體傳感器工作曲線，步驟如下:
①將參比電極一Ag/AgCl電極、對電極一鉬絲電極和上述制備的工作電極，連接在化學發光檢測儀的暗盒中，將電化學工作站和化學發光檢測儀連接在一起，光電倍增光的高壓設置為800 V，掃描電壓設置為-2.0?O V ;
②pH7.4的PBS緩沖溶液(含0.10 mol/L的K2S2O8)作為底液，通過電化學發光法檢測不同濃度的凝血酶產生的電化學發光信號強度；根據所得的電化學發光強度與凝血酶濃度的線性關系，繪制工作曲線。
[0015]本發明的另一方面提供上述方法制備的電化學發光適配體傳感器在測定凝血酶中的用途。
[0016]本發明的有益成果:
(I)本發明的發明人首次將Eu (III) -MWCNTs作為新型發光材料引入到凝血酶的電化學發光適配體傳感器的制備當中，利用Eu(III)-MWCNTs具有高的量子產率、低毒性和長的發光壽命，使所制作的傳感器有更高的靈敏度。
[0017](2)在本發明的制備方法中，利用核酸外切酶RecJf選擇性地剪切目標物凝血酶特異性結合的適配體，從而釋放出來凝血酶，釋放出的凝血酶將繼續和其適配體結合，這樣可使一個待測目標物凝血酶產生多個信號單元，放大了檢測信號，提高了傳感器的靈敏度。
[0018](3)NH2-DNA1和NH2_DNA2片段序列在電極表面通過堿基互補配對進行雜交鏈式反應形成一條長的雙鏈DNA，利用氨基和羧基的作用，從而引入更多的Eu(III) - MWCNTs發光材料，因此進一步增強了 ECL的信號。
[0019](4)該傳感器集成了適配體和電化學發光傳感器兩方面的優勢，因此本發明的電化學發光適配體傳感器表現出了優良的準確性、穩定性、重現性與高的靈敏度，對推廣適配體傳感器在疾病預防、疾病診斷和藥物篩選中的實際應用具有重要的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]下面結合【專利附圖】
【附圖說明】和具體實施例對本發明做進一步詳細描述。
[0021]圖1為本發明的(a)不存在凝血酶和核酸外切酶RecJf, (b)存在凝血酶(濃度為5.0X 10_9 mol/L)而不存在核酸外切酶RecJf, (c)存在凝血酶(濃度為5.0X 10_9 mol/U和核酸外切酶RecJf時的光強-電位圖。
[0022]為了考察核酸外切酶RecJf是否具有放大ECL信號的作用，本實驗對比研究了有無核酸外切酶RecJf存在時的光強-電位曲線圖。從圖1中可以看出，無目標物凝血酶存在時，ECL的強度較低(曲線a)。當有凝血酶存在而無核酸外切酶RecJf時發光信號有所增強(曲線b)。當在凝血酶中加上核酸外切酶RecJf后發光信號明顯增強(曲線c)，表明核酸外切酶RecJf確實具有放大發光信號的作用。
【具體實施方式】
[0023]本發明使用的凝血酶購自Sigma公司，捕獲探針、凝血酶適配體、NH2-DNAl片段序列和NH2-DNA2片段序列均購自上海生工生物工程有限公司，羧基化的多壁碳納米管購自南京先豐納米材料科技有限公司，核酸外切酶RecJf購自美國NEB公司，K2S2O8購自上海愛建設試劑廠有限公司，巰基己醇購自阿拉丁試劑有限公司，無水乙醇(分析純)購自天津市福寧精細化工有限公司，鐵氰化鉀購于國藥集團化學試劑有限公司，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)U-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)購自上海思域化工有限公司，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉均購于天津市廣成化學試劑有限公司，除了玻碳電極用超純水清洗外，整個實驗過程用的均是二次水。
[0024]CHI760D電化學工作站購自上海辰華儀器有限公司，MP1-F流動注射化學發光檢測儀購自西安瑞邁分析儀器有限公司。
[0025]實施例1制備電化學發光適配體傳感器
(I)合成Eu(In)-MWCNTs納米材料
稀土配合物Eu(TTA)3的合成:將9mL含有1.0 mo I/L KOH的乙醇溶液和1.28 g (3mmol)的五水硝酸銪混合,然后加入15 mL的乙醇和2 g 2-噻吩甲酰三氟丙酮(9 mmol),混合溶液在攪拌下加熱至60 °C反應6 h。冷卻至室溫后加水繼續攪拌30 min，得到的固體用乙醇重結晶，經空氣中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物 Eu (TTA)3；
Eu(III)-MWCNTs的合成:在50 mL的圓底燒瓶中將100 mg的羧基化的多壁碳納米管、20 mL的無水二氯甲烷(DCM)和0.5 mL的草酰氯混合后在室溫下攪拌12 h，通過減壓蒸餾去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空中干燥2 h。將上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超聲10 min，然后加入含有300 mg的6，6-二氨基-2，2-聯吡啶的10 mL DCM,混合物在室溫下攪拌24 h，過濾，并用15 mL的DCM沖洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修飾的多壁碳納米管。稱取50 mg稀土配合物修飾的多壁碳納米管、100 mg上述步驟①制備的Eu(TAA)3和10 mL DCM混合，在室溫下攪拌28 h后將所得物過濾，用150 mL DCM洗滌，真空干燥后得到Eu (III)-MWCNTs。
[0026](2)制備電化學發光適配體傳感器工作電極
①將直徑為4mm的玻碳電極用1.0、0.3、0.05 mm的三氧化二鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈，然后將電極置于5 mmol/L鐵氰化鉀溶液中，在-0.2?0.6 V掃描，使峰電位差小于110 mV，用超純水清洗電極表面，吹干；
②配制濃度為Img/mL的金摻雜的石墨烯溶液。然后取6 KL金摻雜的石墨烯溶液滴到電極上，室溫晾干； ③將10yL 2 μ mol/L的捕獲探針與凝血酶適配體混合溶液滴到電極表面，4 V孵化 12 h ;
④再在電極表面修飾5μ L 2 mmol/L的MCH溶液以消除電極的非特異性活性位點。用PH為7.4的PBS溶液對電極進行清洗，晾干后，滴上10 μ L—系列不同濃度的凝血酶(含0.15 U/μ L RecJf)溶液，放置 40 min ；
⑤將10μ L I μ mol/L的NH2-DNAl和NH2_DNA2的混合溶液修飾到電極上，放置Ih ；
⑥EDC和NHS(50 mmol/L)加入到1.5 mg/mL Eu (III)-MWCNTs中得到混合溶液，取其6 PL滴到電極上，放置2 h，即得到電化學發光適配體傳感器的工作電極。
[0027](3)制作電化學發光適配體傳感器工作曲線
將參比電極一Ag/AgCl電極、對電極一鉬絲電極和上述制備的工作電極，連接在化學發光檢測儀的暗盒中，將電化學工作站和化學發光檢測儀連接在一起，光電倍增光的高壓設置為800 V，掃描電壓設置為-2.0?O V ;
PH 7.4的PBS緩沖溶液(含0.10 mol/L的K2S2O8)作為底液，通過電化學發光法檢測不同濃度的凝血酶產生的電化學發光信號強度；根據所得的電化學發光強度與凝血酶濃度的線性關系，繪制工作曲線。
[0028]實施例2凝血酶的檢測
按照實施例1所述的步驟制備電化學發光適配體傳感器用于凝血酶的檢測。凝血酶的線性范圍為 5 ΧΙΟ—9 ?1.0 ΧΙΟ—12 mol/L，檢出限為 0.23 pmol/L。
[0029]將實施例2得到的結果和文獻進行了對比。通過對比可以發現，本發明的電化學發光適配體傳感器的檢出限較低，線性范圍較寬，具有較高的靈敏度，這為凝血酶的實際測定奠定了基礎。
[0030]實施例3人血清中凝血酶的檢測
對人血清中的凝血酶進行了測定和加標回收實驗，根據實施例2所得工作曲線，計算血清中凝血酶的含量。三次測定結果表明，人體血樣的三次測定結果分別為0.589,0.618、0.603 nmol/L，平均凝血酶含量為0.603 nmol/L。同時采用標準加入法，其凝血酶的加入量為0.500 nmol/L,得到的平均回收率為96.8%，相對標準偏差為2.4%。說明本發明的制備方法得到的電化學發光適配體傳感器具有較高的準確度和精密度。
【權利要求】
1.一種電化學發光適配體傳感器的制備方法,所述電化學發光適配體傳感器包括:工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾金摻雜的石墨烯、捕獲探針與凝血酶適配體的混合溶液、巰基己醇(MCH)、含0.15 U/μ L RecJf的凝血酶、NH2-DNAl和NH2-DNA2的混合溶液和Eu(III)-多壁碳納米管(MWCNTs)，所述參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為鉬絲電極，所述捕獲探針為5’-SH-(CH2)6-AAT TGG AGT CACCCC AAC CTG CCC TAC CAC GGA CT-3’，凝血酶適配體為 5’ -AAA AGT CCG TGG TAG GGC AGGTGG GGG TGA CT-(CH2) 6_3’，所述 NH2-DNAl 片段序列為 5’-NH2-(CH2) 6_AGT CAC CCC AACCTG CCC TAC CAC GGA CTT GAA ACA GTC CGT GGT AGG GCA GGT TGG GGT GAC TCC AATT-(CH2) 6-NH2-3’，NH2-DNA2 片段序列為 5’-NH2-(CH2)6-GTT TCA AGT CCG TGG TAG GGC AGGTTG GGG TGA CTA ATT GGA GTC ACC CCA ACC TGC CCT ACC ACG GAC T-(CH2) 6_NH2_3’ ； 其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: a、合成Eu(In)-MWCNTs納米材料； b、制備電化學發光適配體傳感器工作電極； C、制作電化學發光適配體傳感器工作曲線； 其中，步驟a合成Eu(III)-MWCNTs納米材料的具體步驟如下: ①稀土配合物Eu(TTA)3的合成:將含有1.0 mo I/L KOH的乙醇溶液和五水硝酸銪混合，然后加入15 mL的乙醇和2-噻吩甲酰三氟丙酮(與五水硝酸銪的物質的量之比3:1)，混合溶液在攪拌下加熱至60 °C反應6 h，冷卻至室溫后加水繼續攪拌30 min，得到的固體用乙醇重結晶，經空氣中干燥后放于五氧化二磷干燥器中干燥24 h即得到白色的稀土配合物 Eu (TTA)3； ②Eu(III)-MWCNTs的合成:將羧基化的多壁碳納米管、無水二氯甲烷(DCM)和草酰氯(體積比為40:1)混合后在室溫下攪拌12 h，通過減壓蒸餾去除DCM后得到酰氯功能化的MWCNTs并真空干燥2 h，將上述得到的酰氯功能化的MWCNTs重新分散在20 mL DCM中，超聲10 min，然后加入含有6，6-二氨基-2，2-聯吡啶(與羧基化的多壁碳納米管的質量之比為3:1)的1mL DCM,混合物在室溫下攪拌24 h，過濾，并用15 mL的DCM沖洗3次，真空干燥后得到稀土配合物修飾的多壁碳納米管，稱取稀土配合物修飾的多壁碳納米管，上述步驟①制備的Eu (TAA)3 (質量之比為1:2)和10 mL DCM混合，在室溫下攪拌28 h后過濾，用150 mL DCM洗滌，真空干燥后得到Eu (III)-MWCNTs ； 步驟b制備電化學發光適配體傳感器工作電極的具體步驟如下: ①將玻碳電極表面進行拋光處理使其表面光潔； ②配制濃度為Img/mL的金摻雜的石墨烯溶液,然后將金摻雜的石墨烯溶液滴到電極上，室溫晾干； ③將捕獲探針與凝血酶適配體混合溶液滴到電極表面，4V孵化12 h； ④再在電極表面修飾2mmol/L的MCH溶液以消除電極的非特異性活性位點，用pH為7.4的PBS溶液對電極進行清洗，晾干后，滴上一系列不同濃度的凝血酶(含0.15 U/μ LRecJf)溶液，放置 40 min ； ⑤將NH2-DNAl和NH2-DNA2的混合溶液修飾到電極上，放置Ih； ⑥EDC和NHS(50 mmol/L)加入到1.5 mg/mL Eu (III)-MWCNTs中得到混合溶液并將其滴到電極上，放置2 h，即得到電化學發光適配體傳感器的工作電極； 步驟C制作電化學發光適配體傳感器工作曲線的具體步驟如下: ①將參比電極一Ag/AgCl電極、對電極一鉬絲電極和上述制備的工作電極，連接在化學發光檢測儀的暗盒中，將電化學工作站和化學發光檢測儀連接在一起，光電倍增光的高壓設置為800 V，掃描電壓設置為-2.0?O V ; ②pH7.4的PBS緩沖溶液(含0.10 mol/L的K2S2O8)作為底液，通過電化學發光法檢測不同濃度的凝血酶產生的電化學發光信號強度；根據所得的電化學發光強度與凝血酶濃度的線性關系，繪制工作曲線。
2.如權利要求1所述的電化學發光適配體傳感器在測定凝血酶中的用途。
【文檔編號】G01N21/76GK104374765SQ201410647639
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】吳丹, 魏琴, 胡麗華, 龐雪輝, 馬洪敏 申請人:濟南大學
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