一種消除g試驗假陽性干擾的方法
【專利摘要】本發明涉及G試驗檢測【技術領域】，具體公開了一種消除G試驗假陽性干擾的方法，即配制含有二價可溶性金屬鹽與Tris的緩沖液，與含有干擾物質的病人血漿或血清混合來制備檢測樣品，對所述檢測樣品進行G試驗。采用上述方法在檢測含有非特異性鱟試劑反應物的病人血漿/血清時，可消除干擾作用，準確檢測病人血漿/血清中的β-G濃度，大大減少因臨床誤判給患者在身心及經濟造成的負擔。
【專利說明】一種消除G試驗假陽性干擾的方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及G試驗檢測【技術領域】，更具體地，涉及一種消除G試驗假陽性干擾的方法。
【背景技術】
[0002]真菌廣泛地存在于自然界，包括人體的口腔、鼻咽、腸道、女性生殖道等，然而這些正常菌群引起的深部真菌感染其臨床表現極不典型，難以與其他細菌等感染相鑒別，抗真菌治療若不及時，其預后又不良。因此臨床上力求尋找正確、快速判斷深部真菌的辦法，(1，3)-β-D葡聚糖(β-G)是某些真菌細胞壁的組分之一，如念珠菌和曲霉菌。當菌體新陳代謝時或死亡后，細胞壁中的β-G組分會釋放到環境中。檢測念珠菌或曲霉菌深部感染患者的血清或血漿，會發現β -G的含量明顯高于非感染人群，這表明β-G的檢測對念珠菌和曲霉菌的深部感染診斷有臨床意義。
[0003]鱟試劑是由海洋生物鱟的阿米巴細胞溶胞物制備而成，β -G可特異性激活鱟試劑中的G凝血因子形成凝固蛋白，引起反應溶液透光度的變化。使用β-G標準品與鱟試劑反應，建立β-G濃度與光度變化關系的標準曲線，定量地檢測臨床血清或血漿的β-G含量的試驗稱為G試驗。
[0004]這一試驗從日本開始已向世界各國推廣，成為早期診斷除結合菌(毛霉等)、隱球菌以外的深部真菌感染，包括念珠菌、曲霉等的主要方法。其敏感性與特異性約為60?90%。
[0005]但是某些病人，如1、注射過脂肪乳的病人；2、靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品的病人；3、服用過磺胺類藥物的病人的血漿/血清中含有非特異性的鱟試劑反應物，會導致反應過程中反應溶液透光度的降低。這種非特異性的鱟試劑反應物引起的光度變化會導致檢測結果出現假陽性結果，嚴重影響深部真菌感染的臨床診斷，而且通常需要病人停藥后重新采血進行檢測，貽誤診療。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是為了克服含有干擾物質的病人血清或血漿在用G試驗檢測時會出現假陽性的技術缺陷，提供一種消除G試驗假陽性干擾的方法。
[0007]本發明的第二個目的是提供一種消除G試驗假陽性干擾的緩沖液。
[0008]本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的:
一種消除G試驗假陽性干擾的緩沖液，所述緩沖液為包含二價可溶性金屬鹽與Tris的緩沖液。
優選地，所述的二價可溶性金屬鹽為硫酸鎂或氯化鈣。
[0009]更優選地，所述緩沖液中二價可溶性金屬鹽的終濃度為0.3?0.8 M，Tris的終濃度為0.05?0.2 Μ，緩沖液的pH值為6.0?8.0。
[0010]一種消除G試驗假陽性干擾的方法，即用上述緩沖液與含干擾物質的病人血漿或血清混合來制備檢測樣品，對所述檢測樣品進行G試驗檢測。
[0011]G試驗檢測的是真菌的細胞壁成分β -G,人體的吞噬細胞吞噬真菌后，能持續釋放該物質，使血液及體液中含量增高(淺部真菌感染無類似現象)。β -G可特異性激活鱟(Limulus)變形細胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，形成凝固蛋白，引起反應溶液透光度的變化。通過對反應溶液透光度的變化可以檢測是否感染真菌。
正如【背景技術】中所介紹的，某些病人如1、注射過脂肪乳的病人；2、靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品的病人；3、服用過磺胺類藥物的病人的血漿/血清中含有非特異性的鱟試劑反應物，這些干擾物質會影響G試劑反應產生顏色或濁度的變化，從而產生干擾作用。
[0012]本發明通過大量研究發現，將含干擾物質的病人血漿或血清,用本發明特定配方組成的緩沖液稀釋處理I?3倍，就可以消除以上干擾因素的干擾作用；即消除假陽性。
[0013]更優選地，上述緩沖液與含干擾物質的病人血漿或血清的混合體積比為1:1。
[0014]優選地，所述含干擾物質的病人血漿或血清為注射過脂肪乳的病人血漿或血清、靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品的病人血漿或血清或服用過磺胺類藥物的病人血漿或血清。
[0015]優選地，含干擾物質的病人血漿或血清在與緩沖液混合之前先經過以下處理:用細菌內毒素檢查用水將含干擾物質的病人血漿/血清稀釋10倍，70~75°C加熱10~15分鐘，然后冷卻至室溫。
[0016]作為一種優選的技術方案，上述消除G試驗假陽性干擾的方法包括以下步驟:
51.取不含熱原的硫酸鎂或氯化鈣和Tris，用細菌內毒素檢查用水溶解，配置成硫酸鎂或氯化鈣與Tris的緩沖液，并調節pH值為6.0?8.0 ;
52.用細菌內毒素檢查用水稀釋含干擾物質的病人血漿或血清，70?75°C加熱10?15min，然后冷卻至室溫，制得含干擾物質的病人血漿或血清稀釋液；
53.用SI獲得的緩沖液將S2制備得到的含干擾物質的病人血漿或血清稀釋液再稀釋I?3倍，即可進行G試驗。
[0017]進一步地，上述優選技術方案中，SI中所述硫酸鎂或氯化鈣的終濃度為0.65M，Tris的終濃度為0.1M，最終調節緩沖液的pH值為7.0。
[0018]進一步地，上述優選技術方案中，S3中用SI獲得的緩沖液將S2制備得到的含干擾物質的病人血漿或血清稀釋液再稀釋I倍。
[0019]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
本發明首先提供一種特地配方的可以消除G試驗假陽性干擾的緩沖液，然后再提供消除G試驗假陽性干擾的方法，即配制含有二價可溶性金屬鹽與Tris的緩沖液，與經處理后的含干擾物質的人血漿或血清混合來制備檢測樣品，對所述檢測樣品進行G試驗。采用上述方法在檢測含有非特異性鱟試劑反應物的病人血漿/血清時，可消除干擾作用，準確檢測病人血漿/血清中的β -G濃度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1是正常人血漿/血清G試驗動力學曲線，呈平滑反s形，圖中兩條線代表平行兩管，該動力學曲線是由本領域常規G試驗檢測方法獲得； 圖2是含有非特異性鱟試劑反應物的人血漿/血清常規G試驗動力學曲線，圖中兩條線代表平行兩管，該動力學曲線是由本領域常規G試驗檢測方法獲得；
圖3是含有非特異性鱟試劑反應物的人血漿/血清應用本發明方法后的G試驗動力學曲線，圖中兩條線代表平行兩管。
【具體實施方式】
[0021]下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0022]實施例1 待測血樣準備:
血樣1:正常G試驗陽性人血漿/血清；
血樣2:注射過脂肪乳的病人的血漿/血清；
本實施例試驗材料如下:硫酸鎂(MgSO4);三羥甲基氨基甲烷(C4H11NO3);鹽酸(HCL);細菌內毒素檢查用水(W);待測樣品即供試品(S)。
[0023]試驗方法及步驟如下:
51.取少量不含熱原的硫酸鎂(MgSO4)和三羥甲基氨基甲烷(Tris，C4HnN03)，用細菌內毒素檢查用水溶解，配置成含0.3M MgSOjP 0.05M Tris的緩沖液，然后調節pH值為6.0 ；
52.用細菌內毒素檢查用水將本實施例上述2種人血漿/血清稀釋10倍，70°C加熱lOmin，然后冷卻至室溫，制備得人血漿/血清的10倍稀釋液；
53.用SI獲得的緩沖液將S2所述人血漿/血清的10倍稀釋液再稀釋2倍，制備得到人血漿/血清供試液；
54.對S3制備的2種人血漿/血清供試液分別進行G試驗檢測人血漿/血清中的β-G濃度。
[0024]同時利用本領域常規G試驗方法檢測血樣2，即血樣2不用本發明所述緩沖液稀釋，直接進行常規G試驗方法檢測。
[0025]檢測結果圖1?3所示，由圖1?3可以看出:本發明可以消除假陽性。
[0026]實施例2 待測血樣準備:
血樣1:正常G試驗陽性人血漿/血清；
血樣2:靜脈輸注免疫球蛋白的病人的血漿/血清；
本實施例試驗材料如下:硫酸鎂(MgSO4);三羥甲基氨基甲烷(C4H11NO3);鹽酸(HCL);細菌內毒素檢查用水(W);待測樣品即供試品(S)。
[0027]試驗方法及步驟如下:
51.取少量不含熱原的硫酸鎂(MgSO4)和三羥甲基氨基甲烷(Tris，C4HnN03)，用細菌內毒素檢查用水溶解，配置成含0.5M MgSOjP 0.15M Tris的緩沖液，然后調節PH值為7.0 ；
52.用細菌內毒素檢查用水將上述2種人血漿/血清分別稀釋10倍，73°C加熱12min，然后冷卻至室溫，制備得人血漿/血清的10倍稀釋液； 53.用SI獲得的緩沖液將S2所述人血漿/血清的10倍稀釋液再稀釋2.5倍，制備得到人血漿/血清供試液；
54.對S3制備的2種人血漿/血清供試液進行G試驗檢測人血漿/血清中的β-G濃度。
[0028]同時利用本領域常規G試驗方法檢測血樣2，即血樣2不用本發明所述緩沖液稀釋，直接進行常規G試驗方法檢測。
[0029]檢測結果圖1?3所示，圖1的曲線代表陰性，圖2的曲線代表陽性，圖3的曲線代表陰性，這說明本發明可以消除假陽性。
[0030]實施例3 待測血樣準備:
血樣1:正常G試驗陽性人血漿/血清；
血樣2:服用過磺胺類藥物的病人的血漿/血清；
本實施例試驗材料如下:硫酸鎂(MgSO4);三羥甲基氨基甲烷(C4H11NO3);鹽酸(HCL);細菌內毒素檢查用水(W);待測樣品即供試品(S)。
[0031]試驗方法及步驟如下:
51.取少量不含熱原的硫酸鎂(MgSO4)和三羥甲基氨基甲烷(Tris，C4HnN03)，用細菌內毒素檢查用水溶解，配置成含0.8M MgSOjP 0.2M Tris的緩沖液，然后調節PH值為8.0 ；
52.用細菌內毒素檢查用水將上述2種人血漿/血清稀釋10倍，75°C加熱15min，然后冷卻至室溫，制備得人血漿/血清的10倍稀釋液；
53.用SI獲得的緩沖液將S2所述人血漿/血清的10倍稀釋液再稀釋3倍，制備得到人血漿/血清供試液；
54.對S3制備的人血漿/血清供試液進行G試驗檢測人血漿/血清中的β-G濃度。
[0032]同時利用本領域常規G試驗方法檢測血樣2，即血樣2不用本發明所述緩沖液稀釋，直接進行常規G試驗方法檢測。
[0033]檢測結果圖1?3所示，圖1的曲線代表陰性，圖2的曲線代表陽性，圖3的曲線代表陰性，這說明本發明可以消除假陽性。
[0034]實施例4 待測血樣準備:
血樣1:正常G試驗陽性人血漿/血清；
血樣2:注射過脂肪乳的病人血漿/血清；
本實施例試驗材料如下:氯化鈣(CaCl2);三羥甲基氨基甲烷(C4H11NO3);鹽酸(HCL);細菌內毒素檢查用水(W);待測樣品即供試品(S)。
[0035]試驗方法及步驟如下:
51.取少量不含熱原的氯化鈣(CaCl2)和三羥甲基氨基甲烷(Tri^C4H11NO3),用細菌內毒素檢查用水溶解，配置成含0.4Μ CaClJP 0.1M Tris的緩沖液，然后調節pH值為6.0 ；
52.用細菌內毒素檢查用水將上述2種人血漿/血清稀釋10倍，70°C加熱lOmin，然后冷卻至室溫，制備得人血漿/血清的10倍稀釋液；
53.用SI獲得的緩沖液將S2所述人血漿/血清的10倍稀釋液再稀釋2倍，制備得到人血漿/血清供試液；S4.對S3制備的人血漿/血清供試液進行G試驗檢測人血漿/血清中的β -G濃度。
[0036]同時利用本領域常規G試驗方法檢測血樣2，即血樣2不用本發明所述緩沖液稀釋，直接進行常規G試驗方法檢測。
[0037]檢測結果圖1?3所示，圖1的曲線代表陰性，圖2的曲線代表陽性，圖3的曲線代表陰性，這說明本發明可以消除假陽性。
[0038]實施例5 待測血樣準備:
血樣1:正常G試驗陽性人血漿/血清；
血樣2:靜脈輸注白蛋白的病人的血漿/血清；
本實施例試驗材料如下:氯化鈣(CaCl2);三羥甲基氨基甲烷(C4H11NO3);鹽酸(HCL);細菌內毒素檢查用水(W);待測樣品即供試品(S)。
[0039]試驗方法及步驟如下:
51.取少量不含熱原的氯化鈣(CaCl2)和三羥甲基氨基甲烷(Tri^C4H11NO3),用細菌內毒素檢查用水溶解，配置成含0.6Μ CaClJP 0.1M Tris的緩沖液，然后調節pH值為7.0 ；
52.用細菌內毒素檢查用水將上述2種人血漿/血清稀釋10倍，73°C加熱12min，然后冷卻至室溫，制備得人血漿/血清的10倍稀釋液；
53.用SI獲得的緩沖液將S2所述人血漿/血清的10倍稀釋液再稀釋I倍，制備得到人血漿/血清供試液；
54.對S3制備的人血漿/血清供試液進行G試驗檢測人血漿/血清中的β-G濃度。
[0040]同時利用本領域常規G試驗方法檢測血樣2，即血樣2不用本發明所述緩沖液稀釋，直接進行常規G試驗方法檢測。
[0041]檢測結果圖1?3所示，圖1的曲線代表陰性，圖2的曲線代表陽性，圖3的曲線代表陰性，這說明本發明可以消除假陽性。
[0042]實施例6
待測血樣準備:血樣1:正常G試驗陽性人血漿/血清；
血樣2:靜脈輸注凝血因子的病人的血漿/血清；
本實施例試驗材料如下:氯化鈣(CaCl2);三羥甲基氨基甲烷(C4H11NO3);鹽酸(HCL);細菌內毒素檢查用水(W);待測樣品即供試品(S)。
[0043]試驗方法及步驟如下:
51.取少量不含熱原的氯化鈣(CaCl2)和三羥甲基氨基甲烷(Tri^C4H11NO3),用細菌內毒素檢查用水溶解，配置成含0.7Μ CaClJP 0.2Μ Tris的緩沖液，然后調節pH值為8.0 ；
52.用細菌內毒素檢查用水將上述2種人血漿/血清稀釋10倍，75°C加熱15min，然后冷卻至室溫，制備得人血漿/血清的10倍稀釋液；
53.用SI獲得的緩沖液將S2所述人血漿/血清的10倍稀釋液再稀釋3倍，制備得到人血漿/血清供試液；
54.對S3制備的人血漿/血清供試液進行G試驗檢測人血漿/血清中的β-G濃度。
[0044]同時利用本領域常規G試驗方法檢測血樣2，即血樣2不用本發明所述緩沖液稀釋，直接進行常規G試驗方法檢測。
[0045]檢測結果圖1?3所示，圖1的曲線代表陰性，圖2的曲線代表陽性，圖3的曲線代表陰性，這說明本發明可以消除假陽性。
【權利要求】
1.一種消除G試驗假陽性干擾的緩沖液，其特征在于，所述緩沖液為含有二價可溶性金屬鹽和Tris的緩沖液。
2.根據權利要求1所述的緩沖液，其特征在于，所述的二價可溶性金屬鹽為硫酸鎂或氯化鈣。
3.根據權利要求2所述的緩沖液，其特征在于，所述緩沖液中二價可溶性金屬鹽的終濃度為0.3?0.8 M, Tris的終濃度為0.05?0.2 M,緩沖液的pH值為6.0?8.0。
4.一種消除G試驗假陽性干擾的方法，其特征在于，用權利要求1至3任一項所述的緩沖液與含干擾物質的病人血漿或血清混合來制備檢測樣品，對所述檢測樣品進行G試驗檢測。
5.根據權利要求4所述消除G試驗假陽性干擾的方法，其特征在于，所述緩沖液與含干擾物質的病人血漿或血清的混合體積比為I?3:1。
6.根據權利要求4所述消除G試驗假陽性干擾的方法，其特征在于，所述含干擾物質的病人血漿或血清為注射過脂肪乳的病人血漿或血清、靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品的病人血漿或血清或服用過磺胺類藥物的病人血漿或血清。
7.根據權利要求4所述消除G試驗假陽性干擾的方法，其特征在于，含干擾物質的病人血漿或血清在與緩沖液混合之前先經過以下處理:用細菌內毒素檢查用水將含干擾物質的病人血漿/血清稀釋10倍，70~75°C加熱10~15分鐘，然后冷卻至室溫。
【文檔編號】G01N33/96GK104483495SQ201410639046
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月13日 優先權日:2014年11月13日
【發明者】熊向黨, 李樹馀 申請人:湛江安度斯生物有限公司