用于2,4,6-tnt檢測的生物納米傳感器制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于2,4,6-TNT檢測的生物納米傳感器制備方法，該方法采用標準化學合成方法合成2,4,6-三硝基甲苯（2,4,6-TNT）特異性敏感的巰基化多肽（WHWQRPLMPVSID-SH），并利用其巰基與納米金屬顆粒的共價連接將其固定于納米傳感器件表面；檢測時，目標分子2,4,6-三硝基甲苯與巰基化多肽的特異性結合引起納米傳感器表面的光學折射特性的改變，導致傳感器透過的透射光光譜的相應變化，實現對目標分子2,4,6-三硝基甲苯的檢測；較已有用于2,4,6-三硝基甲苯檢測的生物傳感器，本發明由于巰基化多肽修飾具有靈敏度高、生物結構穩定性好和成本低廉的優點。
【專利說明】用于2, 4, 6-TNT檢測的生物納米傳感器制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種生物傳感器的制備技術，尤其涉及一種用于爆炸物2，4，6-三硝基甲苯(2，4，6-TNT)檢測的生物納米傳感器的制備方法。
【背景技術】
[0002]爆炸物2，4，6-三硝基甲苯的快速敏感檢測技術在公共安全領域具有十分重要的需求。對其現場檢測，一般采用訓練動物如警犬進行檢查，或使用基于傳統物理化學方法的快速檢測儀器。但是，動物訓練成本非常高，并帶有很強的不可控制性。而完全的電子檢測裝置，其物理或化學傳感作用同發生在生物嗅覺系統的生物化學感受過程存在一定的差距，以致傳感器在敏感性、特異性等方面尚有所不足。多肽是一種能夠人工設計特異性、化學合成的蛋白小分子，其具有結構簡單、功能穩定和成本低廉的特點。它能夠與特定的目標分子特異性結合，作為生物敏感元件與納米傳感器相結合，構建用于2，4，6-三硝基甲苯檢測的生物納米傳感器。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種用于2，4，6-三硝基甲苯檢測的生物納米傳感器制備方法。
[0004]發明的目的是通過以下技術方案來實現的:一種用于2，4，6-三硝基甲苯檢測的生物納米傳感器制備方法，包括以下步驟:
(1)合成2，4，6-三硝基甲苯特異性敏感的多肽序列:采用標準Fmoc固相合成法從羧基端(C端)向氨基端(N端)依據多肽序列WHWQRPLMPVSID合成，以100 μ g/ml多肽溶液形式保存，溶劑為0.1M PBS緩沖液；
(2)特異性敏感多肽序列的巰基化:將5ml濃度為8mg/ml的EDC(1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)溶液和5ml濃度為12mg/ml的NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)溶液加入1ml濃度為100 μ g/ml的多肽溶液中，活化多肽序列C端羧基；EDC溶液和NHS溶液的溶劑均為0.1M MES緩沖液；20min后，加入NaHCO3溶液調節pH至7.2-7.4，再加入1ml濃度為lmg/ml的2-硫基乙胺水溶液，室溫下靜止2h，使得多肽序列C端羧基與2-硫基乙胺的氨基作用形成穩定的酰胺鍵，進而完成多肽序列巰基化，得到巰基化多肽(WHWQRPLMPVSID-SH)；
(3)固定巰基化多肽于傳感器表面:首先依次使用無水乙醇和超純水超聲清洗納米杯陣列傳感器各5min ;所述納米杯陣列傳感器具有在PET基底材料上構建的尺寸為納米級的杯狀結構，所述杯狀結構成陣列排布，并在其表面沉積納米金顆粒；將清洗后的納米杯陣列傳感器浸泡在100 μ g/ml的巰基化多肽溶液中，巰基化多肽溶液的溶劑為PBS緩沖液；納米杯陣列傳感器在4°C溫度下浸泡12h，巰基化多肽一端巰基與傳感器金表面形成金-硫鍵，然后，取出后用PBS緩沖液反復清洗，洗去納米結構表面的多余的巰基化多肽，用氮氣吹干，最終獲得用于2，4，6-三硝基甲苯檢測的生物納米傳感器，放在4°C條件下保存備用。
[0005]本發明的有益效果是，本發明采用標準生物合成方法合成對2，4，6-三硝基甲苯特異性敏感的巰基化多肽(WHWQRPLMPVSID-SH)，并利用納米金屬顆粒與巰基的共價連接將其固定于納米杯陣列傳感器表面；檢測時，目標分子2，4，6-三硝基甲苯與巰基化多肽的特異性結合引起納米杯陣列傳感器表面的光學折射特性的改變，導致傳感器透過的透射光光譜的相應變化，實現對目標分子2，4，6-三硝基甲苯的檢測；較已有用于爆炸物檢測的生物傳感器，本發明由于巰基化多肽修飾具有靈敏度高、生物結構穩定性好和成本低廉的優點。本發明所述的生物納米傳感器檢測下限為3.16X10_9M。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0006]圖1為本發明巰基化多肽質譜表征圖；
圖2為本發明生物納米傳感器的制備圖；
圖3為本發明生物納米傳感器結構示意圖；
圖4為本發明納米杯陣列傳感器固定巰基化多肽前后電化學表征結果圖；
圖5為本發明生物納米傳感器件光學檢測方法示意圖；
圖6為本發明生物納米傳感器對空白對照無水甲醇和2，4，6-三硝基甲苯標準樣品溶液的光譜掃描結果圖；
圖7為本發明生物納米傳感器分別檢測不同濃度的2，4，6-三硝基甲苯標準樣品溶液后，離子共振峰偏移波長與2，4，6-三硝基甲苯濃度的對數之間的線性關系圖。
【具體實施方式】
[0007]以下結合附圖及具體實施例對本發明作詳細描述，但并不是限制本發明。
[0008]本發明用于2，4，6-三硝基甲苯檢測的生物納米傳感器制備方法，包括以下步驟:
1、合成2，4，6-三硝基甲苯特異性敏感的多肽序列:采用標準Fmoc固相合成法從羧基端(C端)向氨基端(N端)依據多肽序列WHWQRPLMPVSID重復脫保護、活化、偶聯3步循環添加氨基酸，純化提取為100 μ g/ml多肽溶液保存(溶劑為0.1M PBS緩沖液，pH=7.2,0.1M指的是PBS緩沖液中磷酸鹽的摩爾濃度，本發明中使用的PBS緩沖液均是指0.1 M，pH=7.2的PBS緩沖液)。
[0009]2、通過縮合作用的特異性敏感多肽序列的巰基化修飾:將5ml濃度為8mg/ml的EDC (1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)溶液和5ml濃度為12mg/ml的NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)溶液加入1ml濃度為100 μ g/ml多肽溶液中，活化多肽序列C端羧基。EDC溶液和NHS溶液的溶劑均為0.1M MES緩沖液(含0.1M KC1，pH=6，0.1M MES指的是MES緩沖液中2-嗎啉乙磺酸的摩爾濃度，0.1M KCl是指MES緩沖溶液氯化鉀的摩爾濃度，本發明中使用的MES緩沖液均是指0.1 M，pH=6的MES緩沖液)。20min后，加入NaHCO3溶液調節pH至7.2-7.4，再加入1ml濃度為lmg/ml 2-硫基乙胺，室溫下靜止2h，使得多肽序列C端羧基與2-硫基乙胺的氨基作用形成穩定的酰胺鍵，進而完成多肽序列巰基化，得到巰基化多肽I (WHWQRPLMPVSID-SH)，分離提純以凍干粉形式保存，其質譜表征如圖1所示。
[0010]3、固定巰基化多肽I于傳感器表面:如圖2所示，首先，依次使用無水乙醇和超純水超聲清洗納米杯陣列傳感器2各5min。所述納米杯陣列傳感器2具有在聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)基底材料上構建的尺寸為納米級的杯狀結構，所述杯狀結構成陣列排布，并在其表面沉積直徑為1nm的納米金顆粒。將清洗后的納米杯陣列傳感器2浸泡在100 μ g/ml的巰基化多肽I溶液中，巰基化多肽I溶液的溶劑為PBS緩沖液。納米杯陣列傳感器2在4°C溫度下浸泡12h，巰基化多肽I 一端巰基與傳感器金表面形成金-硫鍵。然后，取出后用PBS緩沖液反復清洗，洗去納米結構表面的多余的巰基化多肽1，用氮氣吹干，獲得所述的用于2，4，6-三硝基甲苯檢測檢測的生物納米傳感器，如圖3所示，放在4°C條件下保存備用，其固定前后特性的表征采用交流阻抗方法掃描，得到表征其傳感器表面阻抗的能奎斯特圖，如圖4所示，傳感器表面阻抗明顯增大，說明納米杯陣列傳感器2表面已成功地固定了巰基化多肽I。
[0011]本發明的方法制備的生物納米傳感器可用于檢測爆炸物2，4，6-三硝基甲苯，該應用具體如下:
(I)配制待測2，4，6-三硝基甲苯標準樣品溶液:采用濃度為0.1M待測的2，4，6-三硝基甲苯的標準貯備溶液稀釋配制5種濃度梯度為10_8M、10_7M、10_6M、10_5M和10_4M的標準樣品溶液；稀釋液為無水甲醇。
[0012](2)檢測2，4，6-三硝基甲苯標準樣品溶液，得到2，4，6_三硝基甲苯標準樣品溶液作用下生物納米傳感器的透射光譜圖和等離子共振峰偏移波長:采用光學透射的模式對生物納米傳感器進行檢測，如圖5所示，電荷耦合元件(CCD)鏡頭3、納米杯陣列傳感器件2與氙燈光源6被依次從上到下置于一條直線上。光束由氙燈光源6透過納米杯陣列傳感器2發生改變，最終由CCD鏡頭3采集接收，檢測時，首先在生物納米傳感器表面添加50 μ I無水甲醇溶液，而后在傳感器表面上覆蓋2cmX 2cm大小的蓋玻片4在生物納米傳感器表面形成薄層液體5以減少液體本身對光學透射的影響，所述CCD鏡頭3采用美國海洋光學USB2000+采集模塊，所述氙燈光源6采用美國海洋光學PX-02光源；CCD鏡頭3和氙燈光源6通過光纖連接，從而實現對生物納米傳感器的光譜掃描，得到透射光譜圖和等離子共振峰偏移波長。具體測試參數為:光譜掃描范圍為320nm-1000nm，掃描步進為lnm。測量結束后吸出傳感器表面上測量殘留的溶液，然后加滿0.1M PBS緩沖液，靜置5min后緩慢吸出PBS緩沖液，用于清洗生物納米傳感器，再進行2，4，6-三硝基甲苯標準樣品溶液的光學透射譜測量，在傳感器表面加入2，4，6-三硝基甲苯標準樣品溶液，進行透射光譜的測量，得到濃度為10_8M的2，4，6-三硝基甲苯標準樣品溶液對應的透射光譜圖和等離子共振峰偏移波長，如圖6所示，插圖中顯示透射光譜在550nm左右的透射峰會向左發生明顯偏移，測量結束后吸除傳感器表面上次測量殘留的全部溶液，然后加滿0.1M PBS緩沖液，靜置15min后緩慢吸出PBS緩沖液，用于清洗生物納米傳感器表面。
[0013](3)建立2，4，6-三硝基甲苯標準樣品溶液濃度-偏移波長的標準曲線:重復上述步驟2中空白對照無水甲醇溶液和2，4，6-三硝基甲苯標準樣品溶液的透射光譜的測量過程，直至完成5種濃度梯度分別為10_8M、10_7M、10_6M、10_5M和1-4M的2，4，6-三硝基甲苯標準樣品溶液的測量，得到不同濃度下的透射光譜圖，每個濃度重復測量10次，計算等離子共振峰偏移波長(標準樣品溶液與空白對照無水甲醇溶液透射峰波長位置差值)，得到2，4，6-三硝基甲苯標準樣品溶液濃度與共振峰偏移波長的關系曲線y=l.0181og(x)+9.459，如圖7所示，其中，X為2，4，6-三硝基甲苯標準樣品溶液濃度，y為共振峰偏移波長，實現對2，4，6-三硝基甲苯的檢測，其具有超靈敏的特點，經計算檢測下
?ΤΧ9Τ.ε S
罔寸A f ? S V Suo寸寸οι Zo
【權利要求】
1.一種用于2，4，6-TNT檢測的生物納米傳感器制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)合成2，4，6-三硝基甲苯(2，4，6-TNT)特異性敏感的多肽序列:采用標準Fmoc固相合成法從羧基端(C端)向氨基端(N端)依據多肽序列WHWQRPLMPVSID合成，以100 μ g/ml多肽溶液形式保存，溶劑為0.1M PBS (磷酸)緩沖液； (2)特異性敏感多肽序列的巰基化:將5ml濃度為8mg/ml的EDC(1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)溶液和5ml濃度為12mg/ml的NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)溶液加入1ml濃度為100 μ g/ml的多肽溶液中，活化多肽序列C端羧基；EDC溶液和NHS溶液的溶劑均為0.1M MES (2- (N-嗎啡啉)乙磺酸)緩沖液；20min后，加入NaHCO3溶液調節pH至7.2-7.4，再加入1ml濃度為lmg/ml的2-硫基乙胺水溶液，室溫下靜止2h，使得多肽序列C端羧基與2-硫基乙胺的氨基作用形成穩定的酰胺鍵，進而完成多肽序列巰基化，得到巰基化多肽(WHWQRPLMPVSID-SH)； (3)固定巰基化多肽于傳感器表面:首先依次使用無水乙醇和超純水超聲清洗納米杯陣列傳感器各5min ;所述納米杯陣列傳感器具有在PET基底材料上構建的尺寸為納米級的杯狀結構，所述杯狀結構成陣列排布，并在其表面沉積納米金顆粒；將清洗后的納米杯陣列傳感器浸泡在100 μ g/ml的巰基化多肽溶液中，巰基化多肽溶液的溶劑為PBS緩沖液；納米杯陣列傳感器在4°C溫度下浸泡12h，巰基化多肽一端巰基與傳感器金表面形成金-硫鍵，然后，取出后用PBS緩沖液反復清洗，洗去納米結構表面的多余的巰基化多肽，用氮氣吹干，最終獲得用于2，4，6-三硝基甲苯檢測的生物納米傳感器，放在4°C條件下保存備用。
【文檔編號】G01N21/25GK104407150SQ201410635214
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月12日 優先權日:2014年11月12日
【發明者】劉清君, 張迪鳴, 盧妍利, 張倩, 姚瑤, 李爽 申請人:浙江大學