副溶血性弧菌免疫膠體金快速檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種副溶血性弧菌免疫膠體金檢測試紙條，包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，在硝酸纖維素膜上設置有檢測線和質控線，由保藏號為CGMCC No.8003的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體3G9E9G3H7和膠體金結合后形成金標抗體，將所述的金標抗體噴涂于結合墊上形成金標墊，由保藏號為CGMCC No.9010的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體3G9F7D5C9作為檢測抗體，所述的檢測抗體噴涂于硝酸纖維素膜上形成檢測線。本發明還提供了上述的膠體金檢測試紙條在檢測食品副溶血性弧菌的應用。本發明的副溶血性弧菌免疫膠體金檢測試紙條具有檢測特異性和靈敏性均較高的優點。
CGMCC No.8003
2013.07.16
CGMCC No.9010
2014.04.10
【專利說明】副溶血性弧菌免疫膠體金快速檢測試紙條
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測領域，涉及一種免疫膠體金檢測試紙條，具體來說是一種副 溶血性弧菌免疫膠體金快速檢測試紙條。
【背景技術】
[0002] 在食品微生物檢測中，檢測副溶血性弧菌的含量是一個重要的食品安全指標。 2003?2004年的統計結果顯示，我國食物中毒致病因素依次為微生物性、化學性、有毒動 植物性病原。微生物性病原是導致食物中毒的主要因素，中毒人數最多。食源性致病菌快 速檢測一直是研究關注的焦點。
[0003] 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus)ATCC17802是一種革蘭陰性嗜鹽弧菌， 常存在于近海岸海水、海產品及鹽漬食品中（如墨魚、海魚、海蝦、海蟹、海蜇，咸菜、腌肉 等），當人們食用被副溶血性弧菌污染的食物后，極可能會引起以腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發 熱等為主要癥狀的急性腸胃炎。此外，重癥患者還可出現脫水、休克昏迷，甚至死亡。1950 年日本首次發生嚴重的該病菌的食物中毒事件，當時統計共有272名患者中毒，其中有20 名死亡。直到1963年日本國立預防衛生研究所（今日本國立傳染病研究所）的福見秀雄 和坂崎利一證明了此種細菌應屬于弧菌屬，將學名改定為副溶血性弧菌。在1971年美國由 海產品引發副溶血性弧菌食物中毒事件，發生于馬里蘭州，中毒人數達425人。我國在1962 年首次報道副溶血性弧菌，至今在上海、連云港、揚州、溫州、香港等沿海城市有發生副溶血 性弧菌中毒事件，中毒人數多，但是死亡率不高。由于中毒事件頻繁發生，必須要從源頭上 控制，目前市場上有多種產品用于檢測副溶血性弧菌ATCC17802,其中有一些是使用免疫膠 體金方法的試紙條，但是現有技術中的免疫膠體金試紙條所使用的抗體往往是使用單克隆 抗體作為金標抗體和多克隆抗體作為檢測抗體配合使用，因此存在著檢測精度低和交叉反 應高、試紙條有效期短等問題，對檢測的精度和準確度造成了一些影響。
【發明內容】
[0004] 為解決上述問題，本發明提供了一種副溶血性弧菌ATCC17802的免疫膠體金檢測 試紙條，包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述的樣品墊和所述的金標墊緊密 相連，所述的金標墊和所述的硝酸纖維素膜緊密相連，所述的硝酸纖維素膜和所述的吸水 墊緊密相連，在所述的硝酸纖維素膜上設置有檢測線，所述的檢測線接近所述的金標墊， 所述的檢測線遠離所述的金標墊的一側的硝酸纖維素膜上設置有質控線，其中，由保藏號 為CGMCC No. 8003的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體3G9E9G3H7和膠體金結合后形成金 標抗體，所述的金標抗體的pH范圍為7. 0-7. 5,在所述的金標抗體中，所述的抗體的濃度 彡15 μ g/mL，所述的金標抗體噴涂于結合墊上形成金標墊，由保藏號為CGMCC No. 9010的 雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體3G9F7D5C9作為檢測抗體，所述的檢測抗體噴涂于硝酸纖 維素膜上形成檢測線。
[0005] 進一步的，所述的質控線由羊抗鼠抗體或者金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)抗體構 成。
[0006] 進一步的，所述的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸收墊設置在一個底板上。
[0007] 另外，本發明還提供副溶血性弧菌ATCC17802的膠體金檢測試紙條在檢測食品副 溶血性弧菌ATCC17802中的應用。
[0008] 本發明各個方面的細節將在隨后的章節中得以詳盡描述。通過下文以及權利要求 的描述，本發明的特點、目的和優勢將更為明顯。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009] 圖1是本發明實施例中副溶血性弧菌ATCC17802的免疫膠體金檢測試紙條的單抗 的 SDS-PAGE 電泳圖，其中 Lanel :3G9F7D5C9, Lane2 :3G9E9G3H7。
[0010] 圖2是本發明自制膠體金溶液的可見光吸收峰。
[0011] 圖3是本發明自制膠體金溶液的zeta電位圖。
[0012] 圖4是本發明實施例中副溶血性弧菌ATCC17802的免疫膠體金檢測試紙條的各抗 體偶聯膠體金PH結果。
[0013] 圖5是本發明實施例中副溶血性弧菌ATCC17802的免疫膠體金檢測試紙條的各抗 體偶聯膠體金結合量結果。
[0014] 圖6是本發明實施例中副溶血性弧菌ATCC17802的免疫膠體金檢測試紙條的結構 示意圖。
[0015] 圖7是本發明實施例中副溶血性弧菌ATCC17802的免疫膠體金檢測試紙條的膠體 金試紙條靈敏度結果。
[0016] 圖8是本發明實施例中副溶血性弧菌ATCC17802的免疫膠體金檢測試紙條的膠體 金試紙條交叉反應結果。
【具體實施方式】
[0017] 本發明人的研究表明，以副溶血性弧菌作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，分離純 化得到兩株抗副溶血性弧菌單克隆抗體3G9E9G3H7和3G9F7D5C9，其抗體效價可達到 1:100000,其能夠特異性、高效地與副溶血性弧菌結合，與單增李斯特、豬霍亂沙門、鼠傷寒 沙門、腸炎沙門、福氏志賀、宋內氏志賀、鮑氏志賀、大腸桿菌0157: H7、阪崎腸桿菌、小腸耶 爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等共計77種病原細菌均無交叉反應。
[0018] 抗體
[0019] 本發明的抗副溶血性弧菌單克隆抗體可以利用小鼠雜交瘤細胞系 3G9E9G3H7(CGMCC No.8003)或 3G9F7D5C9(CGMCC No.9010)分泌產生。
[0020] 本發明包括具有抗副溶血性弧菌單克隆抗體3G9E9G3H7和3G9F7D5C9的相應氨基 酸序列的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物。具 體地，本發明包括具有含超變區（互補決定區，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質或蛋白質 偶聯物及融合表達產物（即免疫偶聯物及融合表達產物），只要該超變區與本發明的輕鏈 和重鏈的超變區相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性。如本領域技術人員所 知，免疫偶聯物及融合表達產物包括：藥物、毒素、細胞因子（cytokine)、放射性核素、酶和 其他診斷或治療分子與抗副溶血性弧菌單克隆抗體或其片段結合的而形成的偶聯物。本發 明還包括與抗副溶血性弧菌單克隆抗體或其片段結合的細胞表面標記物或抗原。
[0021] 對于本發明的抗副溶血性弧菌單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規方 法測定。抗副溶血性弧菌單克隆抗體V鏈的超變區或互補決定區（complementarity determining region,⑶R)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結合抗原。因此，本 發明包括那些具有帶⑶R的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其⑶R與抗副溶血 性弧菌單克隆抗體⑶R具有90%以上（較佳地95%以上）的同源性。本發明不僅包括完 整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或（Fab ')2片段；抗體重鏈；抗 體輕鏈。
[0022] 本發明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以 用常規技術，利用雜交瘤細胞系3G9E9G3H7(CGMCC No. 8003)或3G9F7D5C9(CGMCC No. 9010) 獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
[0023] -旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
[0024] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通 過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0025] 目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中己知的各種現有的DNA分子（或如載 體）和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
[0026] 本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這 些載體可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
[0027] 宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。
[0028] 用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原 核生物如出血性大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl 2法 處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電 穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可運用如下的DNA轉染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規 機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質體包裝等。
[0029] 獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用 的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下 進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法（如溫度轉換或化學誘導） 誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
[0030] 在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規的復性處理、 用蛋白沉淀劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析（凝膠過 濾）、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法 的結合。
[0031] 本發明的抗副溶血性弧菌單克隆抗體3G9E9G3H7和3G9F7D5C9,其效價高（可以達 到1:100000)，能夠特異性地、高效地檢測副溶血性弧菌，與單增李斯特、豬霍亂沙門、鼠傷 寒沙門、腸炎沙門、福氏志賀、宋內氏志賀、鮑氏志賀、大腸桿菌0157:H7、阪崎腸桿菌、小腸 耶爾森氏菌、肺炎鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌等共計77種病原細菌均無交叉反應，此為本發明 的最大創新點。上述單克隆抗體3G9E9G3H7可以用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、納米金 顆粒標記，專一性地作為檢測抗體使用。上述單克隆抗體3G9F7D5C9在各種檢測運用中，可 專一性地作為捕捉抗體使用。
[0032] 免疫膠體金檢測試紙條
[0033] 本發明還提供了一種副溶血性弧菌ATCC17802的免疫膠體金檢測試紙條，包括樣 品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸收墊，所述的樣品墊和所述的金標墊緊密相連，所述的金 標墊和所述的硝酸纖維素膜緊密相連，所述的硝酸纖維素膜和所述的吸水墊緊密相連，在 所述的硝酸纖維素膜上設置有檢測線，所述的檢測線接近所述的金標墊，所述的檢測線遠 離所述的金標墊的一側的硝酸纖維素膜上設置有質控線，其中，由保藏號為CGMCC No. 8003 的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體3G9E9G3H7和膠體金結合后形成金標抗體，所述的金標 抗體的pH范圍為7. 0-7. 5,在所述的金標抗體中，所述的抗體的濃度> 15 μ g/mL，所述的金 標抗體噴涂于結合墊上形成金標墊，由保藏號為CGMCC No. 9010的雜交瘤細胞株產生的單 克隆抗體3G9F7D5C9作為檢測抗體，所述的檢測抗體噴涂于硝酸纖維素膜上形成檢測線。
[0034] 較優選地，所述的質控線由羊抗鼠抗體或者金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)抗體構 成。
[0035] 較優選地，所述的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸收墊設置在一個底板上。
[0036] 另外，本發明還提供副溶血性弧菌ATCC17802的膠體金檢測試紙條在檢測食品副 溶血性弧菌ATCC17802中的應用。
[0037] 本發明的副溶血性弧菌ATCC17802的免疫膠體金檢測試紙條由于采用了新篩選 的配對單克隆抗體分別噴涂金標墊和檢測線，實驗結果證實其對副溶血性弧菌ATCC17802 的檢測特異性和靈敏性均較高。
[0038] 本發明的檢測原理與結果判斷過程為：若樣本中有待測細菌，測定時樣品處理液 加在樣品墊上，樣品處理液按樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊的方向移動，流經金標 墊時，使金標墊上的金標抗體復溶，并帶動其向硝酸纖維素膜、吸水墊移動，金標抗體可與 樣品中的細菌結合，形成免疫復合物，此免疫復合物流至檢測線時，即被檢測線的特異性固 相抗體所捕獲，形成細菌+金標抗體+抗體的復合體，在硝酸纖維素膜上的檢測線位置顯出 紅色檢測線條；此免疫復合物流經質控線時，即被質控線的固相抗體或SPA所捕獲，在硝酸 纖維素膜上的質控線位置顯出紅色質控線條。
[0039] 陽性標本既顯示檢測線，又顯示質控線；陰性標本沒有檢測線，僅顯示質控線。
[0040] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如 Sambrook 等人，分子克隆：實驗室指南（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數按重量計算。
[0041] 除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0042] 主要試劑
[0043] 弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、PEG、TWEEN-20Sigma ;BSA上海世澤生物科技 有限公司；膠體金溶液本實驗室自制；硝酸纖維素膜（NC膜）135S Millipore ;羊抗鼠、 HRP-羊抗鼠、羊抗兔生工生物工程股份有限公司。
[0044] 主要儀器
[0045] 酶標儀 SpectraMax M2 購自 Molecular Devices ;Nanodrop 2000C 購自 Thermo Scientific ;點樣儀AD6010購自BIO-DOT ;掃描儀Phantom V9購自MICROTEK ;恒溫培養搖 床SPH-100B購自上海世平；蛋白純化儀BioLogic? LP 358BR5057購自BI0-RAD;單人凈化 工作臺SW-SJ-2D型購自蘇州凈化。
[0046] 實施例1抗副溶血性弧菌單克隆抗體3G9E9G3H7和3G9F7D5C9的制備
[0047] 一、免疫原和陽性標準品的準備
[0048] 副溶血性弧菌（ATCC No. 17802)接種于3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW)，37°C、 150r/min振蕩培養17h，計數，加入0. 3%甲醛溶液室溫滅活1天。用生理鹽水調整副溶血 性弧菌（ATCC No. 17802)濃度至5 X 109cfu/ml作為免疫原；用生理鹽水調整濃度為IO8Cfu/ ml作為陽性對照標準品，3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW)為陰性對照標準品。
[0049] 二、單克隆抗體的制備
[0050] 1)實驗動物：選3只8周齡，體重20g左右、雌性Balb/c小鼠為實驗動物。
[0051] 2)免疫方法：每只小鼠腹腔注射0. 2ml免疫原，每間隔2周用同樣劑量加強注射 一次。
[0052] 3)米血：3次加強免疫后從尾部靜脈米血，米用間接非競爭酶聯免疫法測定抗血 清效價。待效價不再上升，腹腔注射同樣量免疫原，3天后按照常規方法進行細胞融合。
[0053] 4)細胞融合：取免疫小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50%PEG作用下常規融 合，分別接種于96孔培養板，置于37°C、5% CO2培養箱培養。
[0054] 5)雜交瘤細胞篩選：采用間接非競爭酶聯免疫法，篩選強陽性孔的雜交瘤細胞， 將其轉移至24孔培養板。
[0055] 6)克隆培養及抗體制備：用有限稀釋法進行克隆化培養。當細胞生長至鋪滿孔 底1/10時，再用同樣方法檢測，將強陽性孔再克隆，如此反復3 - 4次，直至陽性率達到 100 %。將雜交瘤細胞擴大培養，注射于經石蠟油預處理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6個 雜交瘤細胞，7?10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水中 純化抗體。
[0056] 三、單克隆抗體的效價測定
[0057] 副溶血性弧菌培養基如下：國標：GB/T 4789. 7-2008
[0058] 3 %氯化鈉堿性蛋白胨水（APW)
[0059] 成分：蛋白胨10. 0g，氯化鈉30. 0g，蒸餾水1000. OmL
[0060] 制法：將上述成分混合，調節pH8. 5±0. 2,121°C高壓滅菌10min。
[0061] 單克隆抗體效價測定的步驟如下：
[0062] (1)將飽和培養細菌抗原連同培養基在對應的孔中加入100 μ 1，4°C過夜（約包板 36h)。
[0063] (2)倒空液體并拍干殘留液體，用250 μ 1洗滌液清洗3次。
[0064] (3)每個孔中加 100μ 11% BSA，37°C封閉 lh。
[0065] (4)倒空液體并拍干殘留液體，用250 μ 1洗滌液清洗3次。
[0066] (5)每個孔中加100μ 1血清，37°C孵育lh。
[0067] (6)倒空液體并拍干殘留液體，每個孔中加250 μ IPBST洗滌液洗滌3次。
[0068] (7)每個孔中50 μ 1的HRP標記的二抗（sigma)，室溫孵育lh。
[0069] (8)用洗滌液浸泡5min，倒空液體并拍干殘留液體，每個孔中加250 μ IPBST洗滌 液洗滌3次。
[0070] (9)每個孔中加100 μ 1底物，顯色30min，加終止液100 μ 1并立即在OD45tl讀數。
[0071] 表L兩株單克隆抗體效價測定結果（OD45tl)
[0072]
【權利要求】
1. 一種副溶血性弧菌免疫膠體金檢測試紙條，包括樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和 吸收墊，所述的樣品墊和所述的金標墊緊密相連，所述的金標墊和所述的硝酸纖維素膜緊 密相連，所述的硝酸纖維素膜和所述的吸水墊緊密相連，在所述的硝酸纖維素膜上設置有 檢測線，所述的檢測線接近所述的金標墊，所述的檢測線遠離所述的金標墊的一側的硝酸 纖維素膜上設置有質控線，其特征在于：由保藏號為CGMCC No. 8003的雜交瘤細胞株產 生的單克隆抗體3G9E9G3H7和膠體金結合后形成金標抗體，所述的金標抗體的pH范圍 為7. 0-7. 5,在所述的金標抗體中，所述的抗體的濃度> 15 ii g/mL，所述的金標抗體噴涂 于結合墊上形成金標墊，由保藏號為CGMCC No. 9010的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體 3G9F7D5C9作為檢測抗體，所述的檢測抗體噴涂于硝酸纖維素膜上形成檢測線。
2. 如權利要求1所述的一種副溶血性弧菌免疫膠體金檢測試紙條，其特征在于：所述 的質控線由羊抗鼠抗體或者金黃色葡萄球菌蛋白A構成。
3. 如權利要求1所述的一種副溶血性弧菌免疫膠體金檢測試紙條，其特征在于：所述 的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸收墊設置在一個底板上。
4. 權利要求1所述的副溶血性弧菌膠體金檢測試紙條在檢測食品副溶血性弧菌 ATCC17802中的應用。
【文檔編號】G01N33/577GK104316690SQ201410610331
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】劉箐, 李建武 申請人:上海理工大學