內源性小分子物質在快速檢測肝毒性方面的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了基于代謝組學的內源性小分子物質在快速檢測肝毒性方面的應用。其中內源性小分子物質指12個肝毒性生物標記物L-丙氨酸、L-苯丙氨酸、L-肉堿、L-肉堿棕櫚酰、色氨酸、花生四烯酸、膽酸、溶血磷脂酰膽堿(14:0)、溶血磷脂酰膽堿(16:1)、溶血磷脂酰膽堿(18:2)、溶血磷脂酰膽堿(20:3)、溶血磷脂酰乙醇胺(18:2)；同時也指3個肝毒性專屬生物標記物L-肉堿、膽酸、溶血磷脂酰膽堿(14:0)。本發明篩選得到的肝毒性生物標記物使肝損傷的發現與診斷較現有生化檢測指標有所提前，能夠更好的用于肝臟毒性的預防、發現和治療，彌補現有指標的局限性，及時提供準確的檢測信息。
【專利說明】內源性小分子物質在快速檢測肝毒性方面的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及到使用代謝組學技術尋找肝毒性生物標記物，然后對其進行專屬性考 察，接著使用支持向量機（SVM)對它們進行驗證與優化。更具體地說是內源性小分子物質 在快速檢測肝毒性方面的應用。
【背景技術】
[0002] 肝臟在物質代謝的過程發揮著重要作用，因此它成為毒性物質損害的主要靶器 官。肝毒性是藥物開發中面臨的重大安全性問題，同時也是臨床前試驗失敗和藥物撤回的 常見原因。目前，血液天冬氨酸氨基轉移酶（AST)和谷丙轉氨酶(ALT)是常用于檢測肝功能 的兩項指標，但其由于缺乏特異性和敏感性而不能及時的發現肝損傷狀況。因此，目前亟需 我們建立一種能夠早期、準確的肝毒性評價方法，以彌補現有指標的局限性。代謝組學是系 統生物學的重要分支，它作為一種新興技術在毒性評價、藥物代謝分析、疾病診斷等方面取 得了突破性的進展。代謝組學作為一種理想的毒性評價手段，不僅能夠反映毒性物質本身 的代謝變化，同時還能夠有效的表現出毒性物質對機體代謝網絡的影響。代謝組學在毒性 評價上具有靈敏度高、分析簡便快捷的特點。如今，超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質 譜（UPLC/Q-T0F-MS)以其精確、靈敏、高通量等優點為代謝組學的更廣泛應用提供了強大的 技術支持，與此同時卻帶來了龐雜的數據處理過程。因此，我們需要尋找更為有效的數據處 理方法。機器學習能夠從數據里提取規則或模式來把數據轉換成信息，找到內在的相互依 賴關系，對未知數據進行預測和判斷。支持向量機作為機器學習的一種，其基于非線性計算 的統計學習理論，能夠彌補主成分分析（PCA)和偏最小二乘-判別分析（PLS-DA)無 法診斷 或區分以及提供量化的評估信息的缺點，能有效的對特征代謝物的聯合診斷進行評估，同 時在解決小樣本、非線性及高維模式識別數據上表現出特有的優勢。因此，將SVM與代謝組 學技術相結合，用于生物標志物的篩選、驗證與優化以及潛在生物標志物對疾病的預測方 面，能為代謝組學的進一步發展提供更廣闊的思路。
【發明內容】
[0003] 本發明通過代謝組學技術與SVM相結合發現肝毒性生物標記物使肝損傷的發現 與診斷較現有生化檢測指標有所提前，能夠更好的用于肝臟毒性的預防、發現和治療，彌補 現有指標的局限性。及時提供準確的檢測信息。
[0004] 為實現上述目的，本發明公開了如下的技術方案： 內源性小分子物質在快速檢測肝毒性方面的應用，特別是在快速判斷肝臟是否受 到損傷方面的應用。其中所述的內源性小分子物質指肝毒性生物標記物，它們是基于代 謝組學技術篩選出來的，包括L-丙氨酸（L-alanine)、L-肉堿（L-carnitine)、L-苯丙 氨酸（L-Phenylalanine)、色氨酸（Tryptophan)、花生四烯酸（Arachidonic acid)、左旋 肉堿棕櫚酰（L-Palmitoyl carnitine)、膽酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [Lys0PC(14:0)]、溶血磷脂酰膽堿（16:1) [Lys0PC(16:l)]、溶血磷脂酰膽堿（18:2)
[LysoPC (18:2)]、溶血磷脂酰膽堿（20:3) [LysoPC (20:3)]、溶血磷脂酰乙醇胺（18:2) [LysoPE (18:2)]，它們能夠快速檢測肝毒性。在肝毒性生物標記物的基礎上經過SVM驗 證與優化的內源性小分子物質指肝毒性專屬生物標記物，包括L-肉堿（L-carnitine)、膽 酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LysoPC(14:0)]，它們能夠快速判斷肝臟是否 受到損傷。由于體內內源性小分子物質在肝臟受到毒性或者損傷作用時代謝發生變化， 我們研究表明以L-肉堿（L-carnitine)、膽酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LysoPC (14:0)]專屬性最強。所以更具體地說是內源性小分子物質在快速檢測肝毒性以及 肝臟疾病方面的應用。
[0005] 本發明進一步公開了基于代謝組學技術結合SVM的肝毒性生物標志物的篩選方 法，包括樣品前處理、數據采集、數據處理(多元統計分析)、生物標記物的專屬性考察、專屬 生物標記物的驗證與優化等步驟。其特征在于：在數據采集中使用梯度洗脫的條件：〇_〇. 5 min，A: 99%-99%;0.5-2 min，A: 99%-50%;2-9 min，A: 50%-1%;9-10 min，A: 1%-1%; 10-10.5 min，A: 1%-99%;10.5-12 min，A: 99%-99%，其中流動相 A 指 0.1% 甲酸的水，流 動相B指0. 1%甲酸的乙腈；在專屬生物標記物的驗證與優化中使用MATLAB R2010a軟件 (USA)基于肝毒性生物標記物建立SVM預測模型，該過程如下：將生物標記物在生理鹽水 組和各個藥物組中的峰面積作為輸入變量，隨機選擇數據作為訓練集和測試集建立預測模 型，通過優化找到最優的懲罰參數（c)和核函數（g)，然后以逐一排除一個生物標志物為基 礎，利用SVM進行分類預測，得到相應的模型預測準確度，分析準確度，對其是否與肝毒性 密切相關進行區分。
[0006] 我們經過代謝組學技術篩選出肝毒性生物標記物，具體是L-丙氨酸 (L-alanine)、L-肉喊（L-carnitine)、L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine)、色氨酸 (Tryptophan)、花生四烯酸（Arachidonic acid)、左旋肉堿棕櫚酰（L-Palmitoyl carnitine)、膽酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LysoPC(14:0)]、溶血磷脂 酰膽堿（16:1) [Lys0PC(16:l)]、溶血磷脂酰膽堿（18:2) [Lys0PC(18:2)]、溶血磷脂酰 膽堿（20:3) [LysoPC(20:3)]、溶血磷脂酰乙醇胺（18:2) [LysoPE (18:2)]。肝毒性生物 標記物經過專屬性考察、驗證與和優化后得到肝毒性專屬生物標記物，具體是L-肉堿 (L-carnitine)、膽酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LysoPC(14:0)]。
[0007] 本發明更加詳細的技術方案如下： 1、樣品前處理：樣品處理前將血漿在室溫下解凍。然后，將300 μ L乙腈加入到100 μ L 血漿中，并渦旋混合1分鐘。接著將混合物在冰水浴中超聲10分鐘，然后以13000轉在4°C 下離心15分鐘。收集上清液用于UPLC/Q-T0F-MS分析。
[0008] 2、數據采集：使用UPLC/Q-T0F-MS系統(美國Waters公司）對大鼠血漿樣品進行 信息采集。色譜柱用 ACQUITY UPLC HSS C18 (2.1X100 mm，L7ym，美國 Waters 公司）， 柱溫為40°C，流速為0. 3mL/min，進樣量為5 μ L。UPLC分離系統包括二元溶劑系統，用流 動相A (0.1%甲酸的水）和流動相Β (0.1%甲酸的乙腈)。采用梯度洗脫，具體洗脫條 件：0-0· 5 min，A: 99%-99% ;0· 5-2 min，A: 99%-50% ;2-9 min，A: 50%-1% ;9-10 min，A: 1%-1%;10-10.5 min，A: 1%-99%;10.5-12 min，A: 99%-99%。質譜采用電噴霧電離（ESI) 源，在正離子電離模式下進行質譜分析。MS參數如下：干燥氣流速為10mL/min，干燥氣體溫 度為325°C，霧化氣氣壓為350 psi，脫溶劑氣流量600L/h，毛細管電離電壓3. 5 kV，四極桿 掃描范圍m/z50-1000。蒸發氣體和輔助氣體是高純度氮。用（[M+H]+= 556. 2771，[M-H]_ =554. 26)作為參考離子來確保光譜采集過程中的精度。為了確保代謝組學數據采集的可 靠性，我們從每個樣品中吸取等量的血漿混合成為QC樣品，用它們對儀器的穩定性、方法 精密度進行監控，直到整個系統在一個良好穩定的狀態下才能開始樣品信息采集。同時在 24小時之內，QC樣品每4個小時檢測一次，用來監測整個采集過程中樣品與系統的穩定性。
[0009] 3、數據處理：本研究采用UPLC-Q-T0F-MS技術對大鼠的血漿樣本信息進行無靶向 分析。具體的數據處理過程如下：原始數據經工作站中的Masslynx (Waters, USA)軟件采 集后，由Makerlynx software (Version 4.1)數據處理系統對采集得到的譜圖進行離子對 的提取、峰對齊、峰匹配和峰強度校正等操作。然后將80%修約后的數據（Excel格式)導入 SIMCA-P12. 0統計軟件(瑞典Umetrics公司)進行多元統計分析。在UV模式下進行PLS-DA 分析，并驗證模型的可靠性，進而將篩選得到的對分類有顯著貢獻的化合物（VIP>1)作為候 選標記物。接著我們使用SPSS軟件對獲得潛在變量進行T檢驗，將P〈0. 05的物質作為顯 著性差異的標記物。然后我們將它們進行整合化分析，篩選出四氯化碳組和柴胡組共有的 生物標記物，利用維恩圖譜（http: //bioinfogp. cnb. csic. es/tools/venny/index. html) 直觀地反映它們之間的關系。此外，與非肝毒性組數據進行比較，初步確定肝毒性專屬標 記物。接著，我們隨機選取數據(肝毒性組和非肝毒性組中生物標志物的峰面積）作為訓 練集和預測集，通過采用MATLAB R2010a ( USA)對其建立SVM模型，將模型預測準確性高 的物質最終視為肝毒性的專屬性生物標志物。繼而利用標記物的質量數（m/z值）在HMDB (http://www. hmdb. ca/)數據庫和 KEGG (http://www. genome, jp/kegg/)數據庫中查找可 能的物質。最后，通過比較標準品和樣品之間的指紋圖譜來鑒定物質。如果沒有標準品，我 們分析它們的MS/MS信息以及參考文獻等信息來確認候選的生物標記物。最后對專屬標記 物利用 MetPA (http://metpa. metabolomics. ca. /MetPA/faces/Home. jsp)數據庫進行代 謝通路分析。
[0010] 本發明的有益效果在于： 當肝臟的肝細胞膜受損或細胞壞死時，血液中的酶才會發生變化，且ALT并非肝損傷 發生時所特有的，因此傳統的血清免疫檢測會存在時效性差和特異性低的缺點。本發明篩 選出的肝毒性生物標志物具有較強的靈敏性和特異性。它們可以在肝臟組織病理尚未出現 明顯損傷的情況下表現出顯著性差異，即毒性發現時間較現有生化檢測指標有所提前，能 夠更好的用于肝臟毒性的預防、發現和治療，彌補現有指標的局限性。這也是我們利用代謝 組學技術發現肝毒性專屬生物標記物的目的所在。
[0011]
【專利附圖】
【附圖說明】： 圖1 :肝毒性各藥物組多元統計分析的PLS-DA得分圖； 圖2 :用維恩圖顯示整合化分析篩選得到48個共同的碎片離子； 圖3 :篩選得到的14個肝毒性共有的且含量變化趨勢相同的碎片離子信息； 圖4 :支持向量機模型的預測準確率； 圖5 :3個肝毒性專屬生物標記物在肝毒性組和非肝毒性組中的PLS-DA模型得分圖； 圖6 :各個組的肝毒性生化指標AST和ALT含量變化。
[0012]
【具體實施方式】： 下面結合說明書和【具體實施方式】對做進一步說明。但本實施例并不用于限制本發明， 凡是采用本發明的相似變化，均應列入本發明的保護范圍。本發明所用到的試劑、藥品均有 市售。
[0013] 實施例1 1、試劑：乙腈購自Oceanpak (瑞典哥德堡)，甲酸購自R0E (美國)，均為分析純。純凈水 購自娃哈哈公司（中國杭州)。生理鹽水購自齊都藥業有限公司（中國山東)。慶大霉素，依替 米星，異丙腎上腺素，5-氟尿嘧啶，柴胡和四氯化碳購自士蘭科技有限公司（中國天津)。藥 品分別用生理鹽水配置后給予動物。
[0014] 2、動物實驗：動物實驗在中國醫學科學院生物醫學工程研究所（中國天津）進行。 70只雄性Wistar大鼠（200±20克）保持在SPF級實驗室。大鼠購入后置12小時晝夜更 替，環境溫度為25± 1 °C，環境濕度為50±5%的控制環境條件下飼養。經過一周的適應后， 將大鼠隨機分為7組，分別為空白組、慶大霉素組、依替米星組、異丙腎上腺素組、5-氟尿嘧 啶組、柴胡組和四氯化碳組。
[0015] 3、樣品收集：樣品收集之前，所有動物禁食12小時。大鼠輕微麻醉后從腹主動脈 搜集血液。一部分血樣置肝素化試管中，3500轉離心15分鐘，分離血漿，置-80°C冰箱中儲 存，用于代謝組學研究。另一部分血樣置于普通炮彈管中，500轉離心15分鐘，分離血清， 置-80°C冰箱中儲存，用于臨床生化檢測。
[0016] 4、我們將上述血漿樣品按照本發明的技術方案進行分析研究。多元統計分析中， 首先進行PLS-DA分析，結果表明給藥組和對照組之間呈現出很好的區分，說明了藥物引起 了體內內源性代謝物的改變，且表明兩組在代謝水平上有明顯的區分，見圖1。在此基礎 上，我們進一步挖掘數據潛在信息，將VIP>1的變量認為是潛在標記物。繼而通過T-test 檢驗，進一步的篩選肝毒性生物標記物。其中，四氯化碳組共篩選得到74個碎片離子，柴胡 組篩選得到135個碎片離子。繼而采用維恩圖譜對找到的碎片離子進行整合化分析，發現 48個共同的碎片離子，見圖2。最終得到14個共有的且含量變化趨勢相同的碎片離子，我 們認為這些離子為肝毒性共有的生物標記物，見圖3。為了進一步確定14個碎片離子的專 屬性和準確性，我們應用支持向量機對生物標志物的專屬性進行進一步評估。在用于SVM 優化的數據中以76個作為訓練集、以30個作為測試集建立模型，最終獲得預測準確率為 96.00%。然后，逐一刪除這14個標記物，可得到相應的模型準確率，見圖4。結果表明當分 別剔除左旋肉堿（L-carnitine)，膽酸（cholic acid)和LysoPC(14:0)后，模型預測準確率 都不同程度的下降，說明左旋肉堿，膽酸和LPC (14:0)這三個物質對模型具有貢獻度，可見 與藥物肝毒性具有較高的專屬性。最后，我們在肝毒性組和非肝毒性組中基于這3個物質 建立PLS-DA模型，見圖5,結果顯示這三個物質的肝毒性組與非肝毒性組分布在不同區域。
[0017] 5、我們經過物質鑒定得到的12個肝毒性生物標志物的生物學意義： (1)肝臟的主要功能是脂類的吸收與合成和中性脂肪、磷脂、蛋白質的分解。在正常的 生理狀態下，肝臟能夠維持脂質新陳代謝的動態平衡，但當肝臟受到損害時，出現大量肝細 胞壞死，超出了肝臟的代償能力，導致脂質代謝發生障礙。磷脂酰膽堿類（PC)是細胞膜的重 要組成部分，PC在磷脂酶A2 (PLA2)或卵磷脂膽固醇酰基轉移酶（LCAT)的作用下水解生成 LPC。目前，LPC類物質已經作為一類可靠的生物標志物被廣泛報道。LPCs是一類具有生物 活性的脂類物質，具有調節多種細胞的功能。LPCs與炎癥反應和自身免疫有關。LPC含量 的升高顯示機體已經發生了炎癥反應。同時，血液中LPCs水平還反映出機體的免疫抑制功 能，LPCs含量的升高使受損的肝臟難以進行自我修復。因此，血漿中LPCs含量的升高提示 炎癥反應和免疫力降低已經發生。
[0018] (2)膽汁酸作為膽汁的重要成分，主要存在于腸肝循環系統并通過再循環起一定 的保護作用，同時也在脂肪代謝中起著重要作用。而膽酸是是膽汁酸中含量最豐富的一類 固醇成分，膽酸含量的下降，可能會導致脂類代謝的異常，脂質代謝的異常會擾亂正常的生 理功能，例如花生四烯酸主要來源于質膜的磷脂，是不同炎癥因子的前體物質。花生四烯酸 代謝主要發生在肝臟，我們認為引起花生四烯酸含量下降的原因一方面可能是由于脂質氧 化引起了花生四烯酸的消耗加快，另一方面可能抑制了肝臟中亞油酸代謝成花生四烯酸。 并且有文獻報道稱脂質中肝細胞的過氧化作用增強會加重肝臟損傷。因此我們推斷花生四 烯酸含量的下降可能與肝損傷有關。
[0019] (3)左旋肉堿屬于脂肪酸的β氧化代謝通路。在脂肪酸氧化（FA0)過程中，左旋 肉堿的主要功能是攜帶、轉運活化的脂肪酸，特別是與長鏈飽和及不飽和脂肪酸結合，穿越 線粒體膜，進入線粒體內，進行β氧化和三羧酸循環反應，為機體的代謝活動提供能量。左 旋肉堿的消耗，可能是肝臟損傷導致能量代謝發生異常。
[0020] (4)苯丙氨酸和色氨酸是機體中的必需氨基酸。苯丙氨酸作為一個具有生理活性 的芳香族氨基酸，是由葡萄糖和脂肪酸代謝生成。苯丙氨酸代謝生成酪氨酸主要是在肝臟 中進行的。色氨酸作為蛋白質合成的原料物質，絕大部分代謝發生在肝臟。因此，苯丙氨酸 和色氨酸發生變化可能是肝臟發生損傷后，影響的相應的代謝酶，導致氨基酸代謝收到干 擾。
[0021] 實施例2 基于代謝組學技術結合SVM的肝毒性生物標志物的篩選方法，包括：樣品前處理、數據 采集、數據處理(多元統計分析)、生物標記物的專屬性考察、專屬生物標記物的驗證與優化 等步驟。其特征在于：在數據采集中使用梯度洗脫的條件：0-0. 5 min，Α: 99%-99% ;0. 5-2 min，A: 99%-50%;2-9 min，A: 50%-1%;9-10 min，A: 1%-1%;10-10.5 min，A: 1%-99%; 10. 5-12 min，A: 99%-99%，其中流動相A指0. 1%甲酸的水，流動相B指0. 1%甲酸的乙腈； 在專屬生物標記物的驗證與優化中使用MATLAB R2010a軟件（USA)基于肝毒性生物標記物 建立SVM預測模型，該過程如下：將生物標記物在生理鹽水組和各個藥物組中的峰面積作 為輸入變量，隨機選擇數據作為訓練集和測試集建立預測模型，通過優化找到最優的懲罰 參數（c)和核函數（g)，然后以逐一排除一個生物標志物為基礎，利用SVM進行分類預測，得 到相應的模型預測準確度，分析準確度，對其是否與肝毒性密切相關進行區分。
[0022] 實施例3 實際應用： 我們將收集起來的血清在室溫下解凍，用于檢測血清中的天冬氨酸氨基轉移酶(AST) 和谷丙轉氨酶（ALT)。結果顯示與對照組相比，柴胡組和四氯化碳組中的生化指標均出現顯 著性變化（P〈〇. 05)，但是非肝毒性ISO組的ALT值也出現升高的情況，見圖6。出現這種狀 況是由于ALT并非肝臟所特有的物質，它同時也存在于心臟組織中，因此當心臟組織受損 時，表現出ALT值升高。由此可見，ALT對于肝臟的檢測不具有專屬性。相比較之下，我們通 過代謝組學結合SVM發現的肝毒性專屬生物標記物具有較強的靈敏性和專屬性。能夠更好 的用于肝臟毒性的預防、發現和治療，彌補現有指標的局限性，及時提供準確的檢測信息。
[0023] 具體的數據比較如下：
【權利要求】
1. 內源性小分子物質在快速檢測肝毒性方面的應用；其中所述的內源性小分子 物質指12個肝毒性生物標記物，它們是基于代謝組學技術篩選出來的，包括L-丙 氨酸（L-alanine)、L-肉喊（L-carnitine)、L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine)、色氨 酸（Tryptophan)、花生四烯酸（Arachidonic acid)、左旋肉堿棕櫚酰（L-Palmitoyl carnitine)、膽酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LysoPC(14:0)]、溶血磷脂酰 膽堿（16:1)[1^8〇?0(16 :1)]、溶血磷脂酰膽堿（18:2)[1^8〇?0(18:2)]、溶血磷脂酰膽堿 (20:3) [LysoPC (20:3)]、溶血磷脂酰乙醇胺（18:2) [LysoPE (18:2)]。
2. 內源性小分子物質在快速判斷肝臟是否受到損傷方面的應用；其中所述的內源性 小分子物質指的是3個肝毒性專屬生物標記物，它們是在肝毒性生物標記物的基礎上經過 專屬性考察和SVM驗證與與優化篩選出來的，包括L-肉堿（L-carnitine)、膽酸（cholic acid)、溶血磷脂酰膽堿（14:0) [LysoPC (14:0)]。
3. 權利要求1-2任一項所述的應用，其中基于代謝組學技術結合SVM的肝毒性生物標 志物的篩選方法，包括樣品前處理、數據采集、數據處理(多元統計分析)、生物標記物的專 屬性考察、專屬生物標記物的驗證與優化步驟，其特征在于：在數據采集中使用梯度洗脫的 條件：0-0.5 min，A: 99%-99%;0· 5-2 min，A: 99%-50%;2-9 min，A: 50%-1%;9-10 min，A: 1%-1% ;10-10· 5 min，Α: 1%-99% ;10· 5-12 min，A: 99%-99%，其中流動相 A 指 0· 1% 甲酸的 水，流動相B指0. 1 %甲酸的乙腈；在專屬生物標記物的驗證與優化中使用MATLAB R2010a 軟件（USA)基于肝毒性生物標記物建立SVM預測模型，該過程如下：將生物標記物在生理鹽 水組和各個藥物組中的峰面積作為輸入變量，隨機選擇數據作為訓練集和測試集建立預測 模型，通過優化找到最優的懲罰參數（c)和核函數（g)，然后以逐一排除一個生物標志物為 基礎，利用SVM進行分類預測，得到相應的模型預測準確度，分析準確度，對其是否與肝毒 性密切相關進行區分。
【文檔編號】G01N30/02GK104280477SQ201410607892
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】李遇伯, 張艷軍, 王磊 申請人:天津中醫藥大學