基于新型納米復合材料的葡萄糖安培檢測器的制備和使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種葡萄糖安培檢測器的制備和使用方法，該傳感器包括：碳納米管、鉑納米顆粒、聚合離子液體膜和葡萄糖氧化酶修飾的玻碳電極為工作電極，鉑絲為對電極，甘汞電極為參比電極的三電極體系。檢測時在該三電極體系下，使用電化學工作站，對葡萄糖含量進行測定。與傳統方法相比，具有更高靈敏度和特異性，檢測限低至1X10-7mol/L；同時，葡萄糖傳感器制備簡單、性能穩定且可重復利用、樣品檢測時間短，操作方便。
【專利說明】基于新型納米復合材料的葡萄糖安培檢測器的制備和使用 方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于鉑納米顆粒/離子液體聚合物膜-碳納米管的新型納米復合 材料的靈敏、快速、特異性的葡萄糖傳感器的制備和使用方法。
【背景技術】
[0002]糖尿病是目前全世界普遍存在的一類疾病，檢測人體血液中的葡萄糖含量對糖尿 病的診斷和控制非常重要。自從1%2年第一個葡萄糖酶電極成功構建，到現在已開發出各 種類型的葡萄糖電化學生物傳感器。其中，以檢測電化學反應產物雙氧水為原理的葡萄糖 安培檢測器由于具有較好的靈敏度，選擇性，穩定性，重現性，容易實現微型化等優點而受 到廣泛關注。在葡萄糖安培檢測器的電極制備材料方面，由于碳納米管（CNTs)電子導電性 好，面積/體積比高，以及對電子傳遞的獨特的促進作用，已經在電化學生物傳感器中得到 了很好的應用。CNTs修飾的電極可以催化兒茶酚，過氧化氫（H 202)，多巴胺，抗壞血酸，尿 酸，葡萄糖氧化酶（GOD)，等物質在電極上的電化學反應。酶與底物在氧氣的存在下反應會 產生H 202，而鉑納米顆粒（PtNPs)對H202具有出色的催化活性，因為PtNPs可以降低H 202的 氧化/還原過電位。，因此，PtNPs修飾的電極已經頻繁地用于構建安培酶生物傳感器。然 而，為了提高在Pt少量負載情況下的安培酶生物傳感器的性能，在CNT表面獲得高分散的 金屬顆粒仍然是個挑戰。
[0003] 另一方面，由有機陰離子和無機陽離子組成的室溫離子液體作為修飾物質已經在 生物傳感器的構造中廣泛使用。通常，離子液體單體是用物理方法混合至復合物中并固定 到電極上的，但由于它們在溶液中溶解性很好，所以很容易流失，本發明基于聚合離子液體 修飾的CNTs (PIL-CNTs)材料，得到了 一種在PIL-CNTs表面制備高分散，粒徑分布窄的Pt 納米顆粒的方法。采用這種新型納米復合材料，以葡萄糖氧化酶（GOD)為模型酶，構建了一 個具有優異性能的葡萄糖安培傳感器。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種靈敏、快速、特異性的葡糖糖傳感器的制備及使用方法。
[0005] 一種葡萄糖檢測傳感器，包括：碳納米管、鉑納米顆粒、離子液體聚合膜和葡糖糖 氧化酶修飾的玻碳電極為工作電極，鉬絲為對電極，甘汞電極為參比電極的三電極體系。
[0006] 所述的碳納米管、鉑納米顆粒、離子液體聚合膜和葡糖糖氧化酶修飾的玻碳電極 的制備方法如下： 將200 mg CNTs加入到含有1-乙烯基-3-乙基四氟硼酸鹽[VEIM]BF4(200-220 mg)和 偶氮二異丁腈AIBN(6-8 mg)的甲醇溶液中，超聲1〇_20分鐘后轉移至50 "^的圓底燒瓶內， 70-90 〇C且氮氣保護下回流攪拌16小時。然后將該混合物用二次蒸饋水稀釋，過濾，用丙 酮將一些物理吸附在CNTs表面的聚合物和[VEIM]BF 4單體洗去，干燥得到離子液體聚合物 膜包裹的碳納米管（PIL-CNTs)。
[0007] 20 mg PIL-CNTs 與 650-675 μ? H2PtCl6(38. 6 ηιΜ) -起混合在 20-30 mL 乙二醇 中，用1 Μ KOH將混合液的pH值調至8-9,超聲30 min，用微波（800 W) 110-130 °C下還原 30 min。將反應后的混合液用二次水稀釋，過濾，用二次水和丙酮交替洗滌數次后干燥得到 PtNPs/PIL-CNTs納米復合物。
[0008] 將玻碳電極依次在0· 5和0· 05 μπι的氧化鋁漿上打磨至光亮，然后用超純水沖洗 干凈，氮氣吹干。
[0009] 將Pt納米顆粒/聚合離子液體-碳納米管復合物（PtNPs/PIL-CNTs)分散在水中， 配成1 mg mL_1的溶液，將此溶液超聲振蕩至分散均勻，然后用移液槍取3-8 μ?的上述溶 液，滴到玻碳電極上，室溫下自然風千。然后在修飾了催化劑的電極上滴3-8 μ? G0D，4 °C 下干燥。最后用3-8 PL 1 wt.% Nafion乙醇溶液覆蓋電極表面，防止GOD流失，得到PtNPs/ PIL-CNTs/GC 電極。
[0010] 上述的葡萄糖檢測傳感器的使用方法： 用磷酸緩沖液配制葡萄糖樣品溶液；此后，再以碳納米管、鉑納米顆粒、離子液體聚合 膜和葡糖糖氧化酶修飾的玻碳電極為工作電極，鉑絲為對電極，甘汞電極為參比電極的三 電極體系下，使用電化學工作站，采用電流-時間相應工作方式，對不同標準濃度的葡萄糖 進行檢測，制作標準工作曲線，從而實現對葡萄糖的測定。
[0011] 上述使用方法中具體是將4mL?20mL、pH值為6-8、濃度為0· 03mol/L~0. 2〇 mol/ L的磷酸緩沖液與4mm〇l~20mm〇l的葡萄糖混合，制備濃度為lmol/L的葡萄糖樣品溶液；然 后每次取1 μ?上述制備好的1 mol/L的葡萄糖樣品溶液，連續添加到5 mL、pH值為7. 0、 濃度為0. lmol/L的磷酸緩沖液中進行測定；檢測時，在磁力攪拌速率150rmp條件下進行。 檢測條件為：運用電壓范圍為0. 6 V。
[0012] 本發明原理如下： 葡萄糖與葡萄糖氧化酶（G0D)發生酶催化反應，葡萄糖氧化成葡萄糖酸內酯，而G0D內 的活性中心FAD被還原成FADH2。然后GOD (FADH2)又被溶液中共存的氧氣氧化回GOD (FAD)， 同時生成過氧化氫（H202)。利用過氧化氫在電極上的電化學反應產生的電流信號來指示酶 催化反應中葡萄糖的含量，以此原理構建的傳感器也叫葡萄糖安培檢測器。
[0013] pH 6-8、濃度為0· 1 mol/L的磷酸緩沖液用作支持電解液。電流-時間曲線在磁力 攪拌速率150rmp下，電壓于0. 6V下檢測電位測定修飾電極對葡萄糖溶液的響應電流。圖 1 :連續加入ImM葡萄糖在Pt納米顆粒/聚合離子液體-碳納米管復合物-葡萄糖氧化酶 修飾電極上的電流響應圖，加入不同濃度的葡萄糖可引起圖譜上電流值發生改變。圖 2: 連續加入5. 6 mM葡萄糖、0· 1 mM抗壞血酸（AA)和〇· 5 mM尿酸（UA)(箭頭指示）的電流 響應曲線。干擾離子對本分方法檢測葡萄糖影響不大。
[0014] 本發明中合成的Pt納米顆粒/聚合離子液體-碳納米管復合物-葡萄糖氧化酶 結構穩定，檢測信號重現性好，電化學性能突出。PIL的正電荷和GOD (FAD)的負電荷之間的 靜電作用保持了 G0D的活性，也減緩了 G0D的流失。
[0015] 通過本發明，我們實現了對血清樣中的葡萄糖濃度特異性、快速檢測。與傳統方法 相比，具有更高的靈敏度和特異性，檢測限低至1 X 1(Γ7 mol/L;同時，葡萄糖傳感器制備簡 單、性能穩定且可重復利用、樣品檢測時間短、操作方便。綜上，說明本發明方法是一種靈 敏、快速、特異性的檢測葡糖糖的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1 :連續加入ImM葡萄糖及不同濃度葡萄糖的電流響應曲線； 圖2 :連續加入5. 6 mM葡萄糖、〇. 1碰抗壞血酸（AA)和0· 5 mM尿酸（UA)(箭頭指示） 的電流響應曲線。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例進一步說明本發明，而非限制本發明。
[0018] 利用本發明我們實現了對某醫院提供的血清樣品中葡萄糖濃度的簡便、快速、特 異性檢測。
[0019] 制備本發明的葡萄糖傳感器： 將200 mg CNTs加入到含有1-乙烯基-3-乙基四氟硼酸鹽[VEnflBF4(210 mg)和偶氮 二異丁腈AIBN(6. 9 mg)的甲醇溶液中，超聲15分鐘后轉移至50 mL的圓底燒瓶內，80 °C 且氮氣保護下回流攪拌16小時。然后將該混合物用二次蒸餾水稀釋，過濾，用丙酮將一些 物理吸附在CNTs表面的聚合物和[VEM]BF 4單體洗去，干燥得到離子液體聚合物膜包裹的 碳納米管（PIL-CNTs)。
[0020] 20 mg PIL-CNTs 與 665 μ? H2PtCl6(38.6 mM)-起混合在 25 mL 乙二醇中，用 1 Μ Κ0Η將混合液的pH值調至8-9,超聲30 min，用微波（800 W) 120 °C下還原30 min。將反應后 的混合液用二次水稀釋，過濾，用二次水和丙酮交替洗滌數次后干燥得到PtNPs/PIL-CNTs 納米復合物。
[0021] 將玻碳電極依次在0. 5和0. 05 μηι的氧化鋁漿上打磨至光亮，然后用超純水沖洗 干凈，氮氣吹干。
[0022] 將Pt納米顆粒/聚合離子液體-碳納米管復合物（PtNPs/PIL-CNTs)分散在水 中，配成1 mg mL/1的溶液，將此溶液超聲振蕩至分散均勻，然后用移液槍取5 μ?的上述溶 液，滴到玻碳電極上，室溫下自然風千。然后在修飾了催化劑的電極上滴5 ML GOD,4 °C 下干燥。最后用4 ML 1 wt.% Nafion乙醇溶液覆蓋電極表面，防止GOD流失，得到PtNPs/ PIL-CNTs/GC 電極。
[0023] 檢測血清中的葡萄糖含量時以碳納米管、鉑納米顆粒、離子液體聚合膜和葡糖糖 氧化酶修飾的玻碳電極為工作電極，鉑絲為對電極，甘汞電極為參比電極的三電極體系下， 使用電化學工作站，采用電流-時間相應工作方式，對不同標準濃度的葡萄糖進行檢測，制 作標準工作曲線。將0. 5 mL血清加入到10 mL PBS (0· 1 M，pH 7· 0)中，檢測電位為〇· 6 V， 記錄響應電流，通過之前繪制的標準曲線算出對應的葡萄糖濃度，結果顯示在表1中。可以 發現，由本章中所制備的電極檢測的血糖濃度與醫院提供的結果基本一致。 表丨人體龜清樣a中11菌叇含1的檢S
【權利要求】
1. 一種葡萄糖安培檢測器，其特征在于，包括：碳納米管、鉬納米顆粒、聚合離子液體 膜和葡萄糖氧化酶修飾的玻碳電極為工作電極，鉬絲為對電極，甘汞電極為參比電極的三 電極體系。
2. 根據權利要求1所述的葡萄糖安培檢測器，其特征在于，所述的碳納米管、鉬納米顆 粒、聚合離子液體膜和葡萄糖氧化酶修飾的玻碳電極的制備方法如下：將200 mg CNTs加 入到含有1-乙烯基-3-乙基四氟硼酸鹽[VEM]BF4(210. 1 mg)和偶氮二異丁腈AIBN(6. 9 mg)的甲醇溶液中，超聲15分鐘后轉移至50 mL的圓底燒瓶內，80 °C且氮氣保護下回流攪 拌16小時；然后將該混合物用二次蒸餾水稀釋，過濾，用丙酮將一些物理吸附在CNTs表面 的聚合物和[呢頂扣匕單體洗去，干燥得到離子液體聚合物膜包裹的碳納米管（PIL-CNTs); 20 mg PIL-CNTs 與 665 μ? H2PtCl6(38. 6 mM) -起混合在 25 mL 乙二醇中，用 1 Μ KOH 將 混合液的pH值調至8-9,超聲30 min，用微波（800 W) 120 °C下還原30 min ;將反應后的 混合液用二次水稀釋，過濾，用二次水和丙酮交替洗滌數次后干燥得到PtNPs/PIL-CNTs納 米復合物。
3. 根據權利要求2所述的葡萄糖安培檢測器，其特征在于：玻碳電極依次在0.5和 0. 05 Mm的氧化鋁漿上打磨至光亮，然后用超純水沖洗干凈，氮氣吹干；將Pt納米顆粒/聚 合離子液體-碳納米管復合物（PtNPs/PIL-CNTs)分散在水中，配成1 mg ml/1的溶液，將此 溶液超聲振蕩至分散均勻，然后用移液槍取5 μ?的上述溶液，滴到玻碳電極上，室溫下自然 風干；然后在修飾了催化劑的電極上滴5 PL G0D，4 °C下干燥；最后用4 μ? 1 wt.% Nafion 乙醇溶液覆蓋電極表面，防止GOD流失，得到碳納米管、鉬納米顆粒、聚合離子液體膜和葡 萄糖氧化酶修飾的玻碳電極。
4. 權利要求1-3任一項所述的葡萄糖安培檢測器的使用方法，其特征在于，用磷酸緩 沖液制備葡萄糖樣品溶液；此后再以碳納米管、鉬納米顆粒、聚合離子液體膜和葡萄糖氧化 酶修飾的玻碳電極為工作電極，鉬絲為對電極，甘汞電極為參比電極的三電極體系下，使用 電化學工作站；采用電流-時間響應工作方式，對不同標準濃度的葡萄糖進行檢測，制定標 準工作曲線，從而實現對葡萄糖的測定。
5. 根據權利要求4所述的使用方法，其特征在于，將4mL~20mL、pH值為7. 0、濃度為 0· 03mol/L?0· 20 mol/L的磷酸緩沖液與4mmol?20mmol的葡萄糖混合，制備濃度為lmol/L 的葡萄糖樣品溶液；然后每次取1 KL上述制備好的1 mol/L的葡萄糖樣品溶液，連續添加 到5 mL、pH值為7. 0、濃度為0. lmol/L的磷酸緩沖液中進行測定。
6. 根據權利要求4所述的使用方法，其特征在于，檢測時，在磁力攪拌速率150rmp條件 下進行。
7. 根據權利要求4所述的使用方法，其特征在于，檢測條件為：運用電壓范圍為0.6 V。
【文檔編號】G01N27/26GK104297310SQ201410601264
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年11月1日 優先權日:2014年11月1日
【發明者】吳玲 申請人:吳玲