一種通過三維熒光光譜優化超聲條件提取胞外聚合物的方法
【專利摘要】一種通過三維熒光光譜優化超聲條件提取胞外聚合物的方法屬于污水生物處理活性污泥組分分析領域。本發明通過三維熒光光譜圖分析活性污泥緊密附著型胞外聚合物的提取程度及細胞破裂程度，優化超聲條件。污泥在梯度離心提取黏液和松散附著型胞外聚合物后，超聲提取緊密附著型胞外聚合物，離心或超聲后的水樣經濾膜過濾稀釋后由三維熒光光譜儀分析。采用氙弧燈為激發光源，將掃描后得到的熒光強度減去水的空白熒光強度，得到樣品三維熒光光譜。將扣除空白后的激發波長260～280nm與發射波長360～375nm范圍內熒光數值進行平均，依靠可溶性微生物產物類蛋白物質的平均熒光強度變化，評價緊密附著型胞外聚合物提取程度和細胞破碎情況的方法。
【專利說明】一種通過三維熒光光譜優化超聲條件提取胞外聚合物的方 法
【技術領域】
[0001] 本專利屬于污水生物處理活性污泥組分分析領域，具體涉及一種用熒光分光光度 儀掃描超聲后提取活性污泥緊密胞外聚合物的過濾液，得到三維熒光光譜圖后，評價超聲 細胞破碎及胞外聚合物提取程度的方法，最終選擇優化后的超聲條件提取污泥緊密胞外聚 合物。
【背景技術】
[0002] 在廢水生化處理中，活性污泥的胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，EPS)是在特定廢水水質、處理工藝、反應裝置的運行條件下，微生物生長代謝 中分泌、吸附、溶解的包覆在細胞外部的多聚物，包括蛋白質、多糖、腐殖酸等。
[0003] EPS在污水處理中有重要作用：相互黏附，保持細胞的絮體結構或者生物膜的 聚集；提供活性污泥良好的保護屏障，抵御有毒物質及惡劣環境；保持菌膠團或者生物 膜的水分，影響污泥沉降、過濾與脫水性能；含有大量的酶，參與廢水中污染物質的吸 附與去除。所以，提取與分析活性污泥胞外聚合物的組成對指導污水生物處理有重要 意義。根據EPS與污泥細胞結合的程度，分為松散附著型胞外聚合物（Loosely Bound Extracellular Polymeric Substances, LB-EPS)及緊密附著型胞外聚合物（Tightly Bound Extracellular Polymeric Substances, TB-EPS)〇
[0004] 分層提取活性污泥胞外聚合物的方法有多種，包括樹脂提取法、熱與堿提取法、梯 度離心法和超聲提取法等。其中，離心與超聲提取無需加入其他化學試劑，操作簡單，經濟 易行，且提取的EPS不需透析等處理即可測定，因而得到廣泛應用。
[0005] 不同聲強、聲能密度、時間的超聲波作用于不同濃度的菌膠團活性污泥，可以破壞 絮體結構、分散細胞，使得粘在細胞表面的物質脫落，提取緊密附著型胞外聚合物，例如各 種酶（α -葡萄糖苷酶、α -淀粉酶、蛋白酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶等）。但是，超聲強度 與能量增大時，將破碎細菌，釋放細胞內的營養物質。因此，判斷超聲過程中緊密附著型胞 外聚合物是否提取完全及細胞是否破碎對分析活性污泥胞外聚合物十分關鍵。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是在離心提取LB-EPS后，通過三維熒光光譜評價不同超聲條件下 TB-EPS的提取情況。胞外聚合物中含有的物質不同，在不同激發和發射波長下有對應的熒 光反應。本發明的方法依靠某類蛋白質物質為可溶性微生物產物，其平均熒光強度變化的 特征，具有評價準確，分析快速的特點。
[0007] 為了實現超聲提取緊密附著型胞外聚合物的目的，本發明采用以下方案：
[0008] 取活性污泥混合液，在4°C以2000g的離心力離心15分鐘，得到細胞黏液Slime。 將Slime倒去，加入磷酸鹽緩沖液至活性污泥混合液的原體積，在4°C以4000g的離心力離 心15分鐘，上清液即為LB-EPS。再次加入PBS至原體積后，混合均勻，在不同強度和不同時 間下超聲。離心或超聲后的水樣經0. 45微米濾膜過濾稀釋后由三維熒光光譜儀分析測定。
[0009] 三維熒光光譜掃描測定條件：采用氙弧燈為激發光源，激發波長200?450nm，發 射掃描波長220?600nm，激發和發射狹縫寬度為5?15nm，激發波長掃描間隔為0. 5? 10nm，掃描速度為 900 ?1500nm/min。
[0010] 超聲樣品后的三維熒光光譜圖合成：用Wolfram Mathematica*軟件將樣品的熒光 強度減去同條件下蒸餾水的三維熒光值，合成3D-EEM圖。
[0011] 優化不同超聲條件提取TB-EPS :將扣除空白后的激發波長260?280nm與發射波 長360?375nm范圍內熒光數據進行平均，得到類蛋白質可溶性微生物產物平均熒光強度。 以超聲強度和超聲時間為平面二維坐標，平均熒光強度為縱坐標，繪制三維立體關系圖。平 均熒光強度突變時對應的超聲條件為提取TB-EPS最佳條件。
[0012] 本發明的優點是：
[0013] 1、評價方式簡單易行，不需要復雜的操作過程測定化學組分，僅依靠過濾后樣品 的三維熒光光譜分析與計算過程。
[0014] 2、靈敏度高，適用于不同超聲儀器和超聲條件下對污泥胞外聚合物提取程度及細 胞破碎情況的評價。
[0015] 3、超聲及判斷過程中樣品不添加其他物質，可以進行后續分析檢測，例如：測定蛋 白質總量及沉淀后再溶解進行蛋白質雙向電泳，研究EPS蛋白質組學與污水處理工藝之間 的聯系。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016] 圖1活性污泥分層提取EPS
[0017] 圖2緊密附著型胞外聚合物的熒光光譜圖
[0018] 圖3超聲時間、超聲強度與平均熒光強度的關系
【具體實施方式】
[0019] 本發明的目的在于提供一種通過三維熒光光譜優化超聲提取胞外聚合物的方法， 判斷提取程度及細胞破碎情況的方法。
[0020] 取活性污泥混合液，在冷凍離心機中4 °C以2000g離心力工作15分鐘，得到 Slime。將Slime傾去，加入等體積憐酸鹽緩沖液PBS(137mmol/L NaCl，8. 10mmol/L Na2HPO4 · 7H20,2. 68mmol/L KC1，I. 47mmol/L KH2P04, pH 為 7. 3)，使細胞重新懸浮之后，保 持4°C以4000g離心15分鐘，上清液即為LB-EPS。再次加入PBS后混合均勻，在不同強度 下超聲2. 5-30分鐘。離心或超聲后的水樣經0. 45微米濾膜過濾，所有樣品經相同倍數稀 釋后由三維熒光光譜儀分析檢測。采用氙弧燈為激發光源，激發波長200?450nm，發射掃 描波長220?600nm，激發和發射狹縫寬度為5?15nm，激發波長掃描間隔為0· 5?10nm， 掃描速度為900?1500nm/min。
[0021] 將掃描后得到的熒光強度用減去水的空白熒光強度，合成矩陣，輸出超聲后的水 樣三維熒光光譜圖。將扣除空白后的激發波長260?280nm與發射波長360?375nm范圍 內熒光數據進行平均，得到可溶性微生物產物的類蛋白物質平均熒光強度。
[0022] 以超聲強度和超聲時間為平面二維坐標，平均熒光強度為縱坐標，繪制關系圖。平 均熒光強度突變時對應的超聲條件為提取TB-EPS最佳條件。
[0023] 實例 1
[0024] 試驗污泥取自實驗室連續流運行的分段進水MUCT工藝。處理水質處理 北京工業大學家屬區實際生活污水，溶解性COD為85. 00-213. OOmg · I71，氨氮濃度 57. 00-74. OOmg噸4,正磷酸鹽濃度為5. 00-6. 50mg噸' 工藝裝置的運行條件如下：水力停 留時間9小時，容積負荷0. 52KgAm3 ·(!)，污泥齡18天，污泥回流比100%，內回流比75%。 超聲處理活性污泥樣品時，反應器全程硝化反硝化穩定運行150天以上，氨氮平均去除率 為 90. 8%。
[0025] 取沉淀后的新鮮污泥10毫升，固體濃度15000mg/L。經2000g在4°C離心15min 后，得到上清液為經0. 45微米濾膜過濾，得到黏液Slime。在沉淀物中加入PBS補充到原體 積后，4°C以4000g的離心力離心15min，上清液經0· 45微米濾膜過濾為LB-EPS。沉淀物中 再次加入PBS至10毫升后超聲處理。采用美國SONICS超聲破碎儀（130W，20kHz)，探頭直 徑2謹。分別在不同強度（20%、25%、30%、35%、40%、60%、80%、100%)下各超聲2.5、 5、7. 5、10、20、30分鐘，記錄超聲結束時，儀器所顯示的能量值。超聲后的樣品經0. 45微米 濾膜過濾后分析測定。預處理活性污泥的方法參見圖1，之后進行三維熒光光譜分析。
[0026] 采用脈沖氙燈作為三維熒光光譜儀的激發光源，分析過濾后經相同稀釋倍數后的 水樣，激發波長200?400nm，發射掃描波長290?550nm，激發和發射狹縫寬度為10nm，激 發波長掃描間隔為5nm，掃描速度為1200nm/min。掃描過程添加290nm濾光片，去除二級瑞 麗散射。
[0027] 將儀器保存的不同激發和發射波長下的熒光值在進行矩陣合成，同時減去 Milli -Q水作為空白的熒光強度，得到不同超聲強度和超聲時間下的3D -EEM圖，可以發現 在不同超聲時間和超聲強度下，可溶性微生物產物的類蛋白物質有峰值（如圖2)。
[0028] 在Wen Chen等人發表的〈〈Fluorescence Excitation-Emission Matrix Regional Integration to Quantify Spectra for Dissolved Organic Matter〉〉文章中，Peak A 附 近屬于可溶性微生物產物的類蛋白物質。所以，將扣除空白后的激發波長260?280nm與 發射波長360?375nm范圍內熒光數據進行平均，得到可溶性微生物產物的類蛋白物質平 均熒光強度。
[0029] 以操作的不同超聲時間、超聲強度與類蛋白質平均熒光強度做圖可知（如圖2)， 當超聲時間小于10分鐘與超聲強度小于40%的時候，可溶性微生物產物平均熒光強度基 本穩定。延長超聲時間或增大超聲強度都會使得可溶性微生物產物的類蛋白物質平均熒光 強度增大。當超聲強度超過80%，熒光強度急劇增加，表示污泥有較大程度的破裂。
[0030] 最終得出在超聲強度在40%時，超聲時間為10分鐘，此時超聲提取實例1使用的 活性污泥提取TB - EPS充分且細胞保持相對完整。
【權利要求】
1. 一種通過三維熒光光譜優化超聲條件提取胞外聚合物的方法，其特征在于，包括以 下步驟： 取活性污泥混合液，在4°C以2000g的離心力離心15分鐘，得到細胞黏液Slime ;將 Slime倒去，加入磷酸鹽緩沖液至活性污泥混合液的原體積，在4°C以4000g的離心力離心 15分鐘，上清液即為LB-EPS ;再次加入PBS至原體積后，混合均勻，在不同強度和不同時間 下超聲；離心或超聲后的水樣經〇. 45微米濾膜過濾稀釋后由三維熒光光譜儀分析測定； 三維熒光光譜掃描測定條件：采用氙弧燈為激發光源，激發波長200?450nm，發射掃 描波長220?600nm，激發和發射狹縫寬度為5?15nm，激發波長掃描間隔為0? 5?10nm， 掃描速度為900?1500nm/min ; 將樣品的熒光強度減去同條件下蒸餾水的三維熒光值，合成三維熒光光譜圖； 優化不同超聲條件提取TB-EPS :將扣除空白后的激發波長260?280nm與發射波長 360?375nm范圍內熒光數據進行平均，得到類蛋白質可溶性微生物產物平均熒光強度；以 超聲強度和超聲時間為平面二維坐標，平均熒光強度為縱坐標，繪制三維立體關系圖；平均 熒光強度突變時對應的超聲條件為提取TB-EPS最佳條件。
【文檔編號】G01N21/64GK104316502SQ201410559720
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月18日 優先權日:2014年10月18日
【發明者】李夕耀, 彭永臻, 何岳蘭, 張瓊, 賈方旭 申請人:北京工業大學