一種檢測水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心酶聯免疫法

一種檢測水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心酶聯免疫法
【專利摘要】一種檢測水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心酶聯免疫法，屬于免疫分析【技術領域】。本發明用水稻細菌性條斑病菌免疫小鼠，得7株水稻細菌性條斑病菌單抗。分別標記辣根過氧化物酶并以水稻細菌性條斑病菌菌體兩兩配對。以3D7（單克隆細胞株J號）作為包被抗體，4H6（單克隆細胞株K號）作為酶標抗體，以水稻細菌性條斑病菌菌體為標準品建立水稻細菌性條斑病菌的夾心ELISA法。本發明采用理化性質高度均一、特異性好、可大量制備的單抗，建立的夾心法靈敏度高，成本低，與丁香假單胞桿菌斑點致病變種，水稻白葉枯病菌，水稻細菌性谷枯病菌，玉米細菌性枯萎病菌，丁香假單胞菌丁香致病變種無交叉反應，為水稻種子中細菌性條斑病菌的檢測提供了快速高效的分析手段。
CGMCC NO9310
2014.05.28

CGMCC NO9311
2014.05.28
【專利說明】一種檢測水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心酶聯免疫法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心酶聯免疫法，屬于免疫分 析【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 水稻細菌性條斑病菌，學名英文名 AacieriaJ 7ea/ o/rice，屬于黃單胞菌目，黃單胞菌科，黃單胞菌屬。水稻細菌 性條斑病于1918年首次發現于菲律賓，目前在東南亞各國和非洲中部都有發生，我國主要 發生在南方水稻產區。水稻細菌性條斑病菌主要危害水稻葉片，在秧苗期即可出現典型的 條斑型癥狀，其發生具有流行性、爆發性和毀滅性的特點。水稻細菌性條斑病菌通過侵染種 子，借種子調運而遠距離傳播。因此很多國家和地區已將其列為檢疫性細菌，并限制從疫區 進口水稻種子。我國也將其作為水稻上的檢疫性病害之一。
[0003] 對水稻細菌性條斑病菌的傳統檢測技術包括產地檢疫、育苗生長觀察法、分離法、 噬菌體檢測等，耗時長，且檢測結果存在不可靠性。PCR檢測方法快速、準確、靈敏，但是技術 條件高，設備昂貴，普及推廣受到很大限制。血清學檢測技術靈敏、快速，如果獲得高質量的 抗血清或抗體，對于大批量樣品的粗篩檢測十分適宜。
[0004] 由于對水稻細菌性條斑病菌目前在農業生產上還沒有有效的防治方法，并且種子 帶菌是該病重要的初侵染來源和傳播途徑，因此，及早檢測發現種子上的病原菌對于預防 該病并采取相應防治措施，指導生產和減少經濟損失有重要意義。所以，建立水稻細菌性條 斑病菌的有效而且便捷快速的檢測方法有利于水稻病害的檢疫，對出入境和國內病源地區 水稻種子的檢疫工作顯得尤為重要。而ELISA方法憑借其靈敏、快速、特異性好、易于推廣 的特點成為致病菌的常規檢測方法。抗體的親和力、交叉反應、穩定性對于ELISA方法的靈 敏度和特異性有著關鍵性的決定作用。
[0005] 因此，本發明制備了高靈敏的水稻細菌性條斑病菌的單克隆抗體并以此為基礎建 立了雙抗體夾心ELISA法，為水稻種子中水稻細菌性條斑病菌的大批量、快速、準確的檢測 奠定基礎。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于建立一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、操作 方法簡單的酶聯免疫吸附檢測方法，用于水稻種子中水稻細菌性條斑病菌的大批量、快速、 準確檢測。
[0007] 本發明的技術方案，本發明建立了一種食品中水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心 檢測方法，該方法包括對檢測方法的優化。
[0008] -種檢測水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心酶聯免疫法，步驟為： (1)水稻細菌性條斑病菌單克隆抗體的制備： 以水稻細菌性條斑病菌NCPPB 1150菌體(來自湖南省進出口檢驗檢疫局） 做為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠；免疫程序如下：第一周進行首免，IX IO8Cfu 水稻細菌性條斑病菌菌體/只，弗氏完全佐劑乳化后皮下多點注射；第四周進行二免， I X IO7Cfu水稻細菌性條斑病菌菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射；第六周進 行三免，IX IO7 cfu水稻細菌性條斑病菌菌體/只，弗氏不完全佐劑乳化后皮下多點注射； 第七周尾部采血測效價，分別挑選對水稻細菌性條斑病菌菌體效價最高的老鼠；第九 周進行沖刺免疫，IX IO7Cfu水稻細菌性條斑病菌菌體/只，生理鹽水溶解，腹腔注射；沖刺 免疫3天后分別眼眶采血后進行融合、篩選，共篩選到7個細胞株； (2) 單克隆抗體的配對篩選： 將純化后的7株單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標記成功后進 行夾心法配對；配對參數如下：包被抗體2 μ g/mL ;包被液為0. 01M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖 液；標品濃度I X 108cfu/mL ;標品稀釋液0. 01M、pH7. 2的PBS ;酶標抗體稀釋500倍使用； 在此條件下，實驗成功得到了 6對P/N值>5的配對； (3) 夾心法的建立：選擇檢測限穩定、靈敏的配對，即以3D7 (單克隆細胞株J號）為包 被抗體，4H6 (單克隆細胞株K號）作為酶標抗體建立夾心法；具體參數如下： 包被抗體濃度：2 μ g/mL ;包被液：0. 01M、pH9. 6碳酸鹽緩沖液；標品稀釋液：0. 01M、 pH7. 2 PBS+0. 2%Tween ;酶標抗體濃度：2· 5 μ g/mL ; 反應時間：包被抗體：封閉37°C，反應2h ;標準品：37°C，反應Ih ;酶標抗體37°C，反應 Ih ;顯色時間lOmin，即可。
[0009] 其中，單克隆抗體是采用水稻細菌性條斑病菌菌體經過特定免疫程序免疫BALB/c 小鼠，經雜交瘤技術融合、篩選得到的。用于配對的抗體是通過優化參數下夾心法配對，并 通過多次試驗篩選確定的，具有穩定性好、靈敏度高的特點。建立的夾心法優化了包被抗體 的濃度，包被液，封閉液，標準品稀釋液，酶標抗體稀釋液，酶標抗體稀釋濃度。LOD達到了 5. IXlO4 cfu/mL〇
[0010] 本發明方法的檢測分析原理是：酶標板上包被了捕獲抗體3D7,合適的濃度下可 以最大限度捕獲水稻細菌性條斑病菌；洗板3次，洗去未結合的抗體，加入封閉液220 μ L封 閉板孔上多余結合位點；洗板3次，加入樣品和對照，37°C孵育Ih ;洗板3次，加入酶標抗體 4H6-HRP，37°C孵育Ih ;洗板4次，加入顯色液顯色12min。如果樣品有足夠的水稻細菌性條 斑病菌，那么水稻細菌性條斑病菌被捕獲抗體3D7捕獲并與酶標抗體4H6-HRP結合，并催化 底物在450nm產生吸收值（P/N > 2. 1)，并被判定為陽性；如果樣品水稻細菌性條斑病菌濃 度太低（P/N< 2. 1)那么樣品不被捕獲或者捕獲數量太小不足以引起足夠的信號，被判定 為陰性。
[0011] 生物材料樣品保藏：水稻細菌性條斑病菌NCPPB 1150,來自湖南省進出口檢驗檢 疫局。細胞株J號，分類命名單克隆細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號 CGMCC NO. 9310,保藏日期2014年5月28日。細胞株K號，分類命名單克隆細胞株，保藏于 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC NO. 9311，保藏日期2014年5月28日。
[0012] 本發明的有益效果：本發明提供的水稻細菌性條斑病菌雙抗體夾心檢測方法采用 了理化性質高度均一、特異性好、可以大量制備的水稻細菌性條斑病菌單克隆抗體，建立的 夾心法靈敏度高，穩定性好、成本低，樣品的前處理過程簡單，能同時檢測大量樣品，適合食 品行業大規模、高通量、快速、靈敏的檢測要求，具有推廣和應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1水稻細菌性條斑病菌雙抗體夾心法的標準曲線。
[0014] 圖2水稻細菌性條斑病菌雙抗體夾心ELISA特異性。
[0015] 1、丁香假單胞桿菌斑點致病變種；2、水稻白葉枯病菌；3、水稻細菌性谷枯病菌； 4、水稻細菌性條斑病菌；5、玉米細菌性枯萎病菌；6、丁香假單胞菌丁香致病變種。

【具體實施方式】
[0016] 以下通過實施例進一步說明本發明。
[0017] 儀器：TGL-40B臺式低速離心機，上海安亭科學儀器廠；KFLOW純水機，凱佛隆 公司；ZD-9556水平搖床，太倉科教器材廠；96孔8X12可拆酶標板，廈門怡佳美實驗器 材有限公司；MuLtiska Mks酶標儀，Thermo Labsystems公司；可調試移液器，Thermo Labsystems公司；渦旋混合器，上海滬西儀器分析廠。
[0018] 試劑：四甲基聯苯胺（TMB)，上海晶純實業有限公司；其他試劑均為分析純試劑。
[0019] 具體步驟如下： (1)單抗制備： a、 實驗動物：選5只，8周齡的BALB/c小鼠進行免疫； b、 抗原配置：將免疫原用生理鹽水稀釋，配成IXlO8 cfu/mL的溶液； c、 乳化：將上述溶液與等量完全或不完全福氏佐劑用混合攪拌法將其乳化，乳化完全 后皮下多點注射小鼠； d、 免疫方法：按照特定免疫流程免疫小鼠，三免后用間接競爭法測定效價，效價達到要 求后，進行沖刺免疫；沖免3天后眼眶采血后進行融合； e、 采血：第三次免疫后1周進行斷尾采血，采用間接非競爭酶聯免疫法測定抗血清效 價； f、 融合、篩選：采用雜交瘤技術進行融合，采用間接Elisa篩選陽性細胞孔，采用有限 稀釋法對陽性孔進行亞克隆； g、 抗體的純化和保存：采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水，透析后得到單克隆抗體，采 用微量紫外方法測定其濃度后分裝后放入-20°C保存。
[0020] (2) ELISA 反應過程： 抗體效價測定步驟：將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標板，100 μ L/孔， 于4°C冰箱過夜。次日取出酶標板回至室溫，每孔注入200 μ L PBST溶液，搖床上振蕩3min， 用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍干，繼續洗滌2次。以下洗滌方法相同； 充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標板，220 μ L/孔，于37°C溫育箱內溫育2 h后取 出烘干待用。將陽性血清系列稀釋對應加入到酶標板的前7行列，第8行加入陰性血清， 100 μ L/孔，37°C孵育Ih后洗滌、拍干； 每孔加入100uL，l : 3000稀釋的HRP標記的羊抗鼠 IgG，37°C孵育Ih后洗滌、拍干。 每孔加入1〇〇以1^顯色液〇1?與底物液比例為1:5)，暗處371：反應151^11，取出后每孔 加入50 μ L終止液（2mol/L的硫酸），用酶標儀測定吸光值A45(i。
[0021] (3)水稻細菌性條斑病菌雙抗體夾心法測定步驟： a、 包被：用2 μ g/mL的3D7包被酶標板，100 μ L /孔，4°C過夜； b、 洗滌：用PBST洗滌反應板三次，每次3min，200 μ L/孔，然后甩干反應板； c、 封閉：含0· 2%明膠的CBS，220 μ L/孔，37°C封閉2h ; d、 洗漆：同b ; e、 樣品：用PBST將水稻細菌性條斑病菌稀釋成LOX IO9、3.33X IO8、1. IlXlO8、 3.70X 107、1.23X 107、4.11X106、1.37X 106、4.57X 105、1.52X 105 cfu/mL 系列濃 度，另設一個PBST空白對照。每孔加入100 μ L樣品，于37°C溫育Ih ; f、 洗漆：同b ; g、 加酶標抗體（4H6-HRP，2. 5 μ g/mL)，100 μ L / 孔，37°C反應 lh。
[0022] 11、洗滌：同13; i、 顯色：加底物TMB IOOyL /孔，顯色IOmin ; j、 終止：加終止液50yL /孔； k、 測定：用酶標儀檢測0D45(lnm。
[0023] (4)交叉率的測定：將丁香假單胞桿菌斑點致病變種，水稻白葉枯病菌，水稻細菌 性谷枯病菌，玉米細菌性枯萎病菌，丁香假單胞菌丁香致病變種精確稀釋成I X IO8 cfu/ mL，在建立的水稻細菌性條斑病菌雙抗體夾心法體系中檢測吸光值，并設空白孔和水稻細 菌性條斑病菌陽性對照，每個濃度做6次測定平均值，做3次重復實驗。
[0024] (5)水稻種子實際樣品的檢測：水稻種子先用蒸餾水沖洗以除去殘片和表面的污 染雜菌，清洗后稱取IOg種子放入0.001 %吐溫-磷酸緩沖溶液中低溫（5?15°C)浸泡 4?6h，均質器打碎，制備樣品提取液。樣品提取液置于22?25°C中4?6h，渦旋混勻5min，使 用國標免疫分離方法驗證懸液為陰性樣品，即取用的水稻種子未被水稻細菌性條斑病菌感 染。在懸液中添加不同濃度水稻細菌性條斑病菌（IX 1〇6, 5X 106, 1 X 107cfu/mL)作為陽性 質控，使用懸液作為陰性質控，每個濃度做3個重復。
[0025] 試驗結果如下： l、 標準曲線：本發明所獲得的抗原檢測的檢測范圍為4.57X 105~1. llX108cfu/mL，具 體請見說明書附圖1。
[0026] 2、LOD :L0D是空白的平均吸收值加3倍的空白吸收值的標準偏差對應的抗原濃 度，水稻細菌性條斑病菌雙抗體夾心法LOD為5. I X IO4 cfu/mL。
[0027] 3、交叉反應率（CR%) 結果：水稻細菌性條斑病菌正常顯色，而IX IO8 cfu/mL濃度下的其它測試菌株均不顯 色（P/N〈2. 1)。說明建立的水稻細菌性條斑病菌夾心法與丁香假單胞桿菌斑點致病變種，水 稻白葉枯病菌，水稻細菌性谷枯病菌，玉米細菌性枯萎病菌，丁香假單胞菌丁香致病變種無 交叉反應，具體如圖2所示。
[0028] 4、水稻種子實際樣品的檢測 結果：在水稻種子樣品的檢測中，水稻細菌性條斑病菌回收率為88. 69Γ95. 2%，相對標 準偏差低于5. 0%。顯示出所建立的雙抗體夾心ELISA方法在實際樣品檢測中具有較好的準 確性與穩定性，具體如表1所示。
[0029] 表1雙抗體夾心ELISA對水稻種子中水稻細菌性條斑病菌的檢測結果（n=3)

【權利要求】
1. 一種檢測水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心酶聯免疫法，其特征在于步驟為： (1) 水稻細菌性條斑病菌單克隆抗體的制備： 以水稻細菌性條斑病菌NCPPB 1150菌體做為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠；經雜 交瘤技術融合、篩選得到； (2) 單克隆抗體的配對篩選： 將純化后的7株單克隆抗體分別標記辣根過氧化物酶HRP，直接法鑒定標記成功后進 行夾心法配對；配對參數如下：包被抗體2 ii g/mL ;包被液為0. 01M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖 液；標品濃度I X 108Cfu/mL ;標品稀釋液0. 01M、pH7. 2的PBS ;酶標抗體稀釋500倍使用； 在此條件下，實驗成功得到了 6對P/N值>5的配對； (3) 夾心法的建立：選擇檢測限穩定、靈敏的配對，即以3D7單克隆細胞株J號為包被 抗體，4H6單克隆細胞株K號作為酶標抗體建立夾心法；具體參數如下： 包被抗體濃度：2 y g/mL ; 包被液：〇. 01M、pH9. 6碳酸鹽緩沖液； 標品稀釋液：〇? 01M、pH7. 2 PBS+0. 2% Tween ; 酶標抗體濃度：2. 5 ii g/mL ; 反應時間：包被抗體：封閉37°C，反應2h ;標準品：37°C，反應Ih ;酶標抗體37°C，反應 Ih ;顯色時間IOmin。
2. 根據權利要求1檢測水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心酶聯免疫法,其特征在于： 所述檢測水稻細菌性條斑病菌的雙抗體夾心酶聯免疫法的LOD為5. IX IO4 cfu/mL。
【文檔編號】G01N33/531GK104316688SQ201410546445
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】匡華, 孔德昭, 胥傳來, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學