針對全血的卵巢癌細胞檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了針對全血的卵巢癌細胞檢測試劑盒。所述試劑盒主要包含能夠特異性識別卵巢癌細胞人附睪蛋白（HE4）抗原的HE4山羊多克隆抗體及生物素化的牛血清蛋白（BSA）-葉酸（FA），鏈霉親和素化的納米磁珠（SA-IO）、鏈霉親和素化的QDs（SA-QDs）、生物素化抗HE4兔抗羊IgG以及連接試劑等。所述試劑盒可利用免疫磁珠的可富集特性高效分離卵巢癌患者全血中的癌細胞，并通過SA-QDs與生物素化的HE4抗原抗體復合物特異性結合靶向卵巢癌細胞，實現多重信號協同放大。該試劑具有較強的靈敏性和特異性，在卵巢癌的早期檢測中具有極廣闊的應用前景。
【專利說明】針對全血的卵巢癌細胞檢測試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術與生物醫學領域。具體地，本發明提供了一種檢測卵巢癌的 試劑盒。
【背景技術】
[0002] 卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤，其發病率位于女性生殖系統腫瘤中第三位，病死率 卻居于首位。大多數卵巢癌被確診時已是晚期，其5年生存率僅為30%，早期診斷和治療卵 巢癌是改善患者預后，提高其生存率的重要因素。目前，臨床上卵巢癌常見的篩選方法有2 種：1)經陰道超聲檢查；2)血清CA125檢測。二者都存在其局限性。研究表明，腫瘤患者外 周血中循環腫瘤細胞（CTCs)的出現早于可見實體瘤，因此，尋找一種高特異性富集人體外 周血中CTCs的方法是目前研究的熱點。
[0003] 免疫磁分離技術是CTCs快速分離富集技術的重要組成部分之一，該技術涉及的 免疫磁珠既可以結合活性蛋白質或配體又可以被磁鐵吸引，經過一些處理，抗體或配體與 磁珠結合后，可特異性地與靶抗原結合形成磁珠-抗體(配體）-抗原復合物，然后在外加 磁場的作用下將含有靶抗原的目的細胞與其他細胞分離，從而達到分離純化目的細胞的作 用。該技術已廣泛應用于各種腫瘤的診斷、治療及預后研究，但在卵巢癌早期檢測中卻鮮少 研究。由于葉酸受體（FR)在大多數正常組織中表達水平極低，而在卵巢癌細胞表面表達高 為95%，FA與FR的結合親和力為0· 19 nM，因此，本發明將FA連接到Fe2O3及Fe3O4復合納 米晶體表面，使磁珠具有靶向識別和磁性分離雙重功能，從而實現卵巢癌細胞的富集，有效 提高檢測靈敏度實現早期檢測卵巢癌。
[0004] 人附睪蛋白4 (HE4)是一種乳清酸性4-二硫化中心（WFDC)蛋白，此蛋白大概為 2(T25Kd。HE4在卵巢癌細胞質內表達量高為93%。一項對卵巢癌相關的大量生物標志物 的評價研究表明HE4檢測在早期診斷卵巢癌中具有最高的靈敏度，其敏感度是82. 7%而 CA125卻僅有45. 9%。因此，HE4作為一種新的腫瘤標志物，能夠幫助進行卵巢癌的早期檢 測及風險評估。
[0005] 量子點（QDs)作為一種新型熒光納米晶，具有一些獨特的熒光性能，如量子產率 高、光化學穩定性高好，不易光解等。目前將QDs與抗體結合制備熒光免疫探針的報道很 多，但是QDs免疫熒光探針在對非常微量的物質進行檢測時仍存在信號低、檢測靈敏度低 等問題。生物素-親和素系統是一種新型信號放大標記技術，利用親和素修飾QDs后，QDs 可以很容易的與生物素化的抗體結合，有效放大其熒光信號，從而實現超靈敏性卵巢癌細 胞檢測。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的關鍵技術問題在于針對目前尚無的全血中卵巢癌細胞快速檢 測試劑盒提供一種基于磁性分離和QDs免疫熒光標記檢測卵巢癌細胞的試劑盒。利用免疫 磁珠的可富集特性和QDs熒光信號強度變化，組建多重信號協同放大，具有超高靈敏度的 全血中快速檢測卵巢癌細胞的試劑盒。該試劑盒可以提高卵巢癌檢測的分辨率、靈敏度及 特異性，更為有效進行卵巢癌的早期檢測及風險評估。
[0007] 本發明公開的針對全血的卵巢癌細胞檢測試劑盒包括：HE4山羊多克隆抗體，生 物素化的牛血清蛋白（BSA)-葉酸（FA)，鏈霉親和素化的納米磁珠（SA-I0)，鏈霉親和素化 的QDs (SA-QDs )，生物素化兔抗羊（HE4) IgG。
[0008] 所述的納米磁珠是Fe2O3及Fe3O 4復合物納米磁珠，粒徑為25nm，表面羧基功能化。 HE4山羊多克隆抗體及生物素化BSA-FA分別可特異性識別卵巢癌細胞質中HE4抗原及細胞 膜表面的FR，其中HE4為過表達于卵巢癌細胞質高爾基體上（93%)的抗原，其在正常組織中 表達量較低。FR在卵巢癌細胞表面的表達量高達95%，而在大多數正常組織中表達量極低。
[0009] 所述的SA-QDs，其制備方法如下：1)100 yL 8 ymol/L QDs溶于100 yL pH為 5. 5的BB，按照QD:EDC摩爾比1:1 000, QD:NHS摩爾比1:2 000加入EDC/NHS，室溫反應 5?10 min ;2)調整溶液pH到8?8. 5,加入SA L 056 mg，持續混勻2 h后，加入10 μ L含5% BSA的PBS封閉10 min終止反應；3) SA-QDs復合物10 000 r/min，離心5 min除去沉淀 后，使用2 mL pH為7的BB在100K超濾管中洗漆，最后重懸于0· I mL pH為7的BB中。
[0010] 所述的生物素化BSA-FA，其制備方法如下：1) FA-PEG-NH2的偶聯：FA 6 mg溶解 于600 μ L二甲基亞砜中，加入N, N-二環己基碳二亞胺（DCC) 3 mg、N, N-輕基琥拍酰亞胺 (NHSS) 3 mg及三乙胺60 μ L共同暗室反應4 h，加入雙氨基聚乙二醇30 mg暗室反應過 夜；反應完全后離心，使用_20°C丙酮沉淀，乙酸乙酯洗滌3次，置于通風柜中干燥并避光保 存；2)FA-PEG-BSA的偶聯=FA-PEG-NH 2 5 mg、1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽 酸鹽（EDC) 2. 5 mg、NHSS 2. 5 mg溶于500 μ L pH為7的硼酸緩沖液（BB)中共同室溫反 應10 min ;加入BSA 8. 35 mg，室溫反應2 h，透析純化3次后于4°C冰箱保存；3)生物素化 BSA-FA的制備：按長鏈生物素：FA-PEG-BSA摩爾比20:1混合后室溫孵育30 min，將混合 溶液于4°C超純水透析3 d，4°C保存備用。
[0011] 所述的生物素化BSA-FA主要是利用大分子BSA上豐富的氨基活性基團，將多量生 物素及FA富集在BSA上，從而增加 FA與細胞結合幾率及生物素與IO-SA結合數量實現放 大。
[0012] 所述的生物素化抗HE4兔抗羊IgG，其制備方法如下：1)取生物素15 mg、EDC 2. 4mg、NHSS 3. 6mg溶解于2 mL (λ 02 M pH為6. 5磷酸鹽緩沖液（PBS)中；2)加入抗HE4 兔抗羊IgG 5.3 mg，室溫置于混勻儀上攪拌30 min ;3)上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水 溶解，在PBS和去離子水中透析I d，-20°C儲存。
[0013] 所述SA-IO通過SA與IO經由共價鍵偶聯制備；其制備方法如下：1)400 μ L 5mg/ mL IO 溶于 400 μ L pH 為 5· 5 的 BB，按照 I0:EDC 摩爾比 1:1 000，I0:NHS 摩爾比 1:2 000 加入EDC/NHS，室溫反應5?10 min ;2)調整溶液pH到8?8. 5,加入SA 0. 08 mg，持續混勻2 h后，加入20 μ L含5% BSA的PBS封閉10 min終止反應；3)加入適量pH為7的BB混勻， 于1. 〇特斯拉磁分離器中分離純化IO-SA 1(T24 h，重復2次后重懸于I mL pH為7的BB 中，新制磁珠濃度為2 mg/mL。其中，5%BSA /PBS可通過BSA上的活性氨基與偶聯產物中IO 或QDs表面殘留的羧基結合，減少偶聯產物的非特異性吸附。
[0014] 所述試劑盒還包括固定液（4%多聚甲醛/三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（TBS) pH 7. 6)、滲透液（TBS+0. 1%吐溫-20 pH 7. 6)、封閉液（0. 1%酪蛋白+5%BSA+TBS pH 7. 6)，洗滌 液（TBS pH 7· 6)。
[0015] 所述的檢測樣品為全血。
[0016] 所述的QDs為CdSSe/ZnS，發射波長為550nm。
[0017] 本發明公開了上述試劑盒在全血中富集卵巢癌細胞的應用，并通過特異性抗體修 飾化的QDs進行熒光標記，通過倒置熒光顯微鏡觀察計數分離效率及熒光信號采集系統定 量分析獲得最終檢測結果。
[0018] 有益效果：卵巢癌在婦科惡性腫瘤中病死率高居第一位，建立簡便、快速的卵巢癌 細胞檢測方法不僅對腫瘤的早期發現，還對腫瘤患者化療藥物的快速評估、個體化治療（臨 床篩藥、耐藥性的檢測)、腫瘤復發的監測以及腫瘤新藥的開發具有重要指導意義。
[0019] 本發明將抗體分子與生物素偶聯，避免了常規方法中將抗體分子偶聯于QDs或磁 珠表面導致抗體活性降低和空間位阻大的缺點。
[0020] 本發明利用大分子BSA上豐富的氨基活性基團，將多量生物素及FA富集在BSA 上，從而增加 FA與細胞結合幾率及生物素與IO-SA結合數量實現放大。
[0021] 本發明根據熒光免疫的雙抗體夾心原理，利用免疫磁珠分離速度快、效率高、操作 簡便等優點，結合QDs光化學穩定性高，不易光解等優良的光學特性，分別以免疫磁珠和 QDs為載體連接生物素化的BSA-FA和抗HE4兔抗羊IgG，使得快速、準確地全血中癌細胞的 檢測得以實現。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1基于磁性分離的SK0V3細胞及A549細胞的分離效率圖，其中SK0V3-2為未加 入生物素化BSA-FA反應的單純IO-SA磁分離時SK0V3細胞的分離效率。
[0023] 圖2 SK0V3細胞和A549細胞的QDs免疫熒光標記染色結果。
【具體實施方式】
[0024] 通過以下實施例進一步說明本發明，但本發明的權利要求不僅限于實施例。
[0025] 下述實施例如無特殊說明所用方法均為常規方法。
[0026] 實施例中用到的磁性納米粒子SHP-05-25與QD550購自美國Ocean NanoTech公 司，生物素、SA購于上海華藍化學公司。HE4山羊多克隆抗體（C-12)購于圣克魯斯生物技 術公司，兔抗羊（HE4)IgG (BA1040)購于博士德生物技術公司，DCC，NHSS，NHS，EDC購買 于美國Sigma-Aldrich公司，BSA購自Biosharp公司，葉酸購自鄭州嵩椎商貿有限公司，倒 置熒光顯微鏡為日本Nikon公司產品，熒光信號采集系統定量分析為網上下載ImageJ 2x 軟件分析所得。
[0027] 納米磁珠是Fe2O3及Fe3O 4復合物納米磁珠，粒徑為25nm，表面羧基功能化。
[0028] 所述的QDs為CdSSe/ZnS，發射波長為550nm。
[0029] 實施例中簡寫： 量子點（QDs)、卵巢癌細胞人附睪蛋白（HE4)、牛血清蛋白（BSA)、葉酸（FA)、鏈霉親和 素化的納米磁珠（SA-I0)、鏈霉親和素化的QDs (SA-QDs)、葉酸受體（FR)。
[0030] 固定液（4%多聚甲醛/三羥基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（TBS) pH 7. 6)、滲透液 (丁85+0.1%吐溫-20?!17.6)、封閉液（0.1%酪蛋白+5%85六+了85?!17.6)，洗滌液（了85?!1 7· 6)。
[0031] 實施例1針對全血的卵巢癌細胞檢測試劑盒檢測卵巢癌SK0V3細胞 1制備生物素化BSA-FA I) FA-PEG-NH2的偶聯：FA 6 mg溶解于600 μ L二甲基亞砜中，加入DCC 3 mg、NHSS 3 mg及三乙胺60 μ L共同暗室反應4 h，加入雙氨基聚乙二醇30 mg暗室反應過夜；反應 完全后離心，使用-20°C丙酮沉淀，乙酸乙酯洗滌3次，置于通風柜中干燥并避光保存；2) FA-PEG-BSA 的偶聯：FA-PEG-NH2 5 mg、EDC 2. 5 mg、NHS 2. 5 mg 溶于 500 μ L pH 為 7 的 BB中共同室溫反應10 min ;加入BSA 8. 35 mg，室溫反應2 h，透析純化3次后于4°C冰箱 保存；3)生物素化BSA-FA的制備：按長鏈生物素：FA-PEG-BSA摩爾比20:1混合后室溫孵 育30 min，將混合溶液于4°C超純水透析3 d，4°C保存備用。
[0032] 2制備生物素化抗HE4兔抗羊IgG 1)取生物素 15 mg、EDC 2. 4mg、NHSS 3. 6mg 溶解于 2 mL 0· 02 M pH 為 6. 5 PBS 中；2) 加入抗HE4兔抗羊IgG 5.3 mg，室溫置于混勻儀上攪拌30 min ;3)上述溶液減壓旋干溶劑， 去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析I d，-20°C儲存。
[0033] 3 制備 SA-IO 1)400 yLI0(濃度為 5mg/mL)溶于 400 yLpH 為 5.5 的 BB，按照 I0:EDC 摩爾比 1:1 000，I0:NHS摩爾比l:2 000 加入EDC/NHS，室溫反應5?10min;2)調整溶液pH到8?8·5， 加入SA 0· 08 mg，持續混勻2 h后，加入20 μ L含5% BSA的PBS封閉10 min終止反應； 3)加入適量pH為7的BB混勻，于I. 0特斯拉磁分離器中分離純化IO-SA 1(Γ24 h，重復2 次后重懸于I mL pH為7的BB中，新制磁珠濃度為2 mg/mL。
[0034] 4 制備 SA-QDs 1)100 μ L QDs(濃度為 8 μ M)溶于 100 μ L pH 為 5. 5 的 BB，按照 QD:EDC 摩爾比 1:1 000，QD:NHS摩爾比l:2 000 加入EDC/NHS，室溫反應5?10min。2)調整溶液pH到8?8·5， 加入SA 1. 056 mg，持續混勻2 h后，加入10 μ L含5% BSA的PBS封閉10 min終止反應。 3 )QD-SA復合物10 000 r/min，離心5 min除去沉淀后，使用2 mL pH為7的BB在100K超 濾管中洗滌，最后重懸于〇. I mL pH為7的BB中。
[0035] 5制備FA功能修飾的10 (IO-FA) I) FA-PEG-NH2的偶聯：FA 6 mg溶解于600 μ L二甲基亞砜中，加入DCC 3 mg、NHSS 3 mg及三乙胺60 μ L共同暗室反應4 h，加入雙氨基聚乙二醇30 mg暗室反應過夜，；2) IO 與 FA-PEG-NH2 的偶聯：200 μ L IO (濃度為 5mg/mL)溶于 200 μ L pH 為 5. 5 的 BB，按 照I0:EDC摩爾比1:1 000, I0:NHS摩爾比1:2 000加入EDC/NHS，室溫反應5?10 min。2) 加入500 μ L pH為8?8. 5 BB，加入FA-PEG-NH2 7 mg，持續混勻2 h后，加入10 μ L含5% BSA的PBS封閉10 min終止反應；3)加入適量pH為7的BB混勻，于I. 0特斯拉磁分離器 中分離純化IO-FA 1(Γ24 h，重復2次后重懸于500 μ L pH為7的BB中，新制磁珠濃度為 2 mg/mL〇
[0036] 6 SK0V3細胞的染色及計數 1)獲取對數生長期的卵巢癌SK0V3細胞4 mL，加入8 yL Hoechest核染料，置于37°C、 5% C02培養箱內孵育30 min;l 000 r/min，離心30 s后棄上清，加入PBS 10 mL清洗，1 000 r/min I min (重復清洗2次）；用4 mL 3%BSA /PBS重懸。2)用細胞計數板計數（25 大格*16小格)SK0V3細胞的數量，熒光顯微鏡下計數原則為：壓線細胞數左不數右、數上不 數下。
[0037] 7 IO-FA磁性納米粒子全血分離SK0V3細胞 1)按照1:1〇7 HiL將預染色的SK0V3細胞添加到I mL全血中，混勻儀上室溫充分混勻 I h后，按照IO-FA與FR摩爾比20:1加入IO-FA磁性納米粒子，持續混勻30 min，形成復 合物IO-FA-細胞；2)將IO-FA-細胞復合物置于I. OT磁分離器中磁分離I h，小心棄上清， 用50 μ L PBS重懸置于24孔細胞培養板內。
[0038] 8基于生物素-SA及BAS介導的磁性納米粒子磁信號放大全血分離SK0V3細胞 1)按照1: 1〇7 mL將預染色的SK0V3細胞添加到I mL全血中，充分混勻后，按照生物 素化BSA-FA與FR摩爾比為5:1加入生物素化BSA-FA，混勻儀上室溫混勻I h，形成的復 合物為生物素化BSA-FA-細胞；2)按照IO-SA與生物素化BSA-FA摩爾比4:1加入I0-SA， 持續混勻30 min，形成的復合物為IO-SA-生物素化BSA-FA-細胞；3)將IO-SA-生物素化 BSA-FA-細胞復合物置于I. OT磁分離器中磁分離I h，小心棄上清，用50 μ L PBS重懸置 于24孔細胞培養板內。
[0039] 9 SK0V3細胞的量子點免疫熒光染色 1)采用固定液在常溫下固定細胞15min，立即用洗滌液漂洗3次；2)用滲透液常溫下 滲透細胞20min，洗滌液沖洗3次后用封閉液封閉細胞上的非特異性結合位點Ih ;3)除去 封閉液，加入適量HE4山羊多克隆抗體與細胞在常溫下共孵育2h。洗滌液沖洗3次(每次 5min)后，加入生物素化-抗HE4兔抗羊IgG復合物與細胞在常溫下共孵育Ih ;4)洗滌液 沖洗3次(每次5min)，加入適量SA-QDs復合物反應30min，沖洗3次脫去背景色后于倒置 熒光顯微鏡下觀察熒光信號并通過熒光信號采集系統進行定量分析及計算分離效率。
[0040] 10磁珠非特異性對照實驗 1)選用SK0V3細胞，步驟1-4同前；2)細胞計數同步驟6, SK0V3細胞全血磁分離過程 不加入生物素化BSA-FA，其余操作步驟同8、9。
[0041] 11 QDs非特異性對照實驗 1)選用SK0V3細胞，步驟1-8同前。2)全血磁分離后的SK0V3細胞的量子點免疫熒光 染色過程中不加入HE4山羊多克隆抗體及生物素化-抗HE4兔抗羊抗體復合物，其余步驟 同9。
[0042] 12同期對照組實驗 選用FR表達陰性及HE4低表達的肺癌A549細胞，其余操作步驟同前1-9。
[0043] (上述步驟7、8、10、12為同等條件下同時進行的實驗，且實驗次數不少于3次；步 驟9和11為同時進行的鑒定實驗） 11結果： I) Hoechst核染料可充分定位卵巢癌SK0V3細胞，經由生物素化-BSA-FA/I0-SA和 IO-FA免疫磁分離及QDs-生物素化-抗HE4兔抗羊抗體-抗原復合物標記的SK0V3,細胞 數目均較多，其中，生物素化BSA-FA/I0-SA對SK0V3細胞的分離效率經多次實驗可高達 87. 1%，而IO-FA的分離效率最高為43%，同等反應條件下A549細胞捕獲數目稀少，其捕獲效 率僅有23. 3%及23. 1%。此外，磁珠的非特異性實驗表明，在沒有FA參與的情況下，IO-SA 的分離效率均不高，其對SK0V3細胞的分離效率約為8. 7%左右。而對A549細胞的分離效 率也在8. 6%左右（圖1)。結果表明，FA可特異性識別卵巢癌SK0V3細胞，經生物素-SA及 BAS介導的磁性納米粒子磁信號放大系統可明顯提高細胞捕獲效率，提高細胞檢測靈敏性。 (圖1) 2) 經由生物素化-BSA-FA/IO-SA和IO-FA免疫磁分離及QDs-生物素化-抗HE4兔抗 羊抗體-抗原復合物標記的SK0V3細胞，細胞質內均可見明顯的綠色熒光，而磁分離捕獲的 A549細胞經標記后未見明顯綠色熒光，不加入HE4山羊多克隆抗體及生物素化-抗HE4兔 抗羊抗體復合物由SA-QDs非特異性標記的SK0V3細胞，細胞質內未見明顯綠色熒光。（圖 2) 3) 臨床實際樣本中，20例卵巢癌患者外周血和100例健康女性外周血使用該試劑盒檢 測后表明，16例卵巢癌患者外周血中發現循環腫瘤細胞，而在健康女性外周血中未發現循 環腫瘤細胞。（表1) 表1
【權利要求】
1. 針對全血的卵巢癌細胞檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括I) HE4山羊多克 隆抗體；2)生物素化的BSA-FA ;3)鏈霉親和素化的納米磁珠SA-IO ;4)鏈霉親和素化的QDs 即SA-QDs ;5)生物素化抗HE4兔抗羊IgG ;所述的SA-QDs，其制備方法如下：1) 100 ii L 8 iimol/LQDs 溶于 100 iiLpH 為 5.5 的 BB，按照 QD:EDC 摩爾比 1:1 000，QD:NHS 摩爾比 1:2 000加入EDC/NHS，室溫反應5?10 min ;2)調整溶液pH到8?8. 5,加入SA 1.056 mg，持 續混勻2 h后，加入10 ii L含5% BSA的PBS封閉10 min終止反應；3) SA-QDs復合物10 000 r/min，離心5 min除去沉淀后，使用2 mL pH為7的BB在100K超濾管中洗滌，最后重 懸于0? I mL pH為7的BB中。
2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的納米磁珠是Fe2O3及Fe3O 4復合 物納米磁珠，粒徑為25nm，磁珠表面為羧基功能化。
3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的生物素化BSA-FA，其制備方法如 下：I) FA-PEG-NH2的偶聯：FA 6 mg溶解于600 ii L二甲基亞砜中，加入N，N-二環己基碳 二亞胺（DCC)3 mg、N，N-羥基琥珀酰亞胺（NHSS)3 mg及三乙胺60 ii L共同暗室反應4 h， 加入雙氨基聚乙二醇30 mg暗室反應過夜；反應完全后離心，使用-20°C丙酮沉淀，乙酸乙 酯洗滌3次，置于通風柜中干燥并避光保存；2)FA-PEG-BSA的偶聯=FA-PEG-NH 2 5 mg、l-乙 基-3_[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)2.5 mg、NHSS 2.5 mg溶于500 iiL pH 為7的硼酸緩沖液（BB)中共同室溫反應10 min ;加入BSA 8. 35 mg，室溫反應2 h，透析純 化3次后于4°C冰箱保存；3)生物素化BSA-FA的制備：按長鏈生物素：FA-PEG-BSA摩爾比 20:1混合后室溫孵育30 min,將混合溶液于4°C超純水透析3 d,4°C保存備用。
4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的生物素化抗HE4兔抗羊IgG,其 制備方法如下：1)取生物素15 mg、EDC 2. 4mg、NHSS 3. 6mg溶解于2 mL 0. 02 M pH為6. 5 磷酸鹽緩沖液（PBS)中；2)加入抗HE4兔抗羊IgG 5. 3 mg，室溫置于混勻儀上攪拌30 min ; 3)上述溶液減壓旋干溶劑，去離子水溶解，在PBS和去離子水中透析I d，-20°C儲存。
5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述SA-IO通過SA與IO經由共價鍵偶 聯制備；其制備方法如下：1)400 UL 5mg/mL IO溶于400 iiL pH為5.5的88，按照1050〇 摩爾比1:1 000，I0:NHS摩爾比1:2 000加入EDC/NHS，室溫反應5?10 min;2)調整溶液pH 到8?8. 5,加入SA 0? 08 mg，持續混勻2 h后，加入20 ii L含5% BSA的PBS封閉10 min終 止反應；3)加入適量pH為7的BB混勻，于I. 0特斯拉磁分離器中分離純化IO-SA KT24 h，重復2次后重懸于I mL pH為7的BB中，新制磁珠濃度為2 mg/mL。
6. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括固定液、滲透液、封 閉液，洗滌液。
7. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的檢測樣品為全血。
8. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的QDs為CdSSe/ZnS，發射波長為 550nm〇
【文檔編號】G01N33/574GK104316683SQ201410538494
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月14日 優先權日:2014年10月14日
【發明者】許恒毅, 傅芬, 聶麗菊, 葉稱連, 張婉怡, 李福來 申請人:南昌大學