檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性抗體IgG的方法。方法步驟為：1）豬流行性腹瀉病毒抗原的制備和96孔聚苯乙烯反應板包被；2）采集待測豬只的血液，處理后獲得血清一抗；3）將血清一抗稀釋后，按編號加入抗原包被的反應板上，37℃飽和濕度反應1小時，洗滌；4）將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體稀釋后，按順序加入到反應板上，37℃飽和濕度避光反應2小時，洗滌；5）將TMB顯色劑，按順序加入到反應板上，避光反應25分鐘，加入終止液；6）放入酶標儀中，讀取OD650數據，判定結果。本發明適用于豬群大面積的豬流行性腹瀉IgG抗體調查。
【專利說明】檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法【背景技術】。
【背景技術】
[0002]豬流行性腹灣是由豬流行性腹灣病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的豬的一種急性腸道傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征。其病理特征表現為腸管擴張，內容物稀薄，呈黃色、泡沫狀，腸壁弛緩，缺乏彈性，變薄有透明感，腸粘膜絨毛嚴重萎縮，胃底粘膜潮紅充血或斑點狀出血，胃內容物呈鮮黃色并混有大量乳白色凝乳塊(或絮狀小片)，對養豬業危害極大。
[0003]豬流行性腹瀉病毒經口和鼻感染后進入小腸，可在豬群中持續存在，各種年齡的豬都易感。哺乳仔豬、架子豬和育肥豬的發病率可達100%，尤其以哺乳仔豬最為嚴重且預后不良，多數不能耐過而死亡。育肥豬盡管發病率較高，但死亡率較低。母豬的發病率在15%?90%。本病主要在冬季多發，夏季也可發生。該病具有傳染性強，發病迅速、仔豬死亡率高等特點。1973年首次在我國上海發生。2006先后多次在我國多地爆發流行，給養豬業造成了重大經濟損失。
[0004]豬流行性腹瀉，僅憑臨床癥狀難以做出診斷，波及所有年齡豬(包括哺乳仔豬)的急性PED在臨診上不能與TGE相區分。實驗室內通過直接顯示PEDV或其抗原或抗體的檢測可做出病原學診斷。直接IF和免疫組化技術用于哺乳仔豬小腸切片中PEDV的檢測，但僅適于急性腹瀉初期，尤其是發病3天內捕殺的患病仔豬小腸切片檢測。對于自然死亡的仔豬由于其小腸絨毛嚴重萎縮，故對其檢測結果不可靠。對腹瀉仔豬糞便進行直接電鏡觀察可見PEDV粒子，但若病毒纖突喪失或不清晰，直接電鏡檢查較為困難。ELISA方法用于檢測血樣中的特異性抗體,既敏感、有可靠,且可檢測大量樣本，同時也適于母豬奶中免疫球蛋白的檢測。
[0005]目前，疫苗免疫依然是我國豬流行性腹瀉防控的最主要手段。采集免疫后豬血液樣本，分離血清，并檢測特異性的血清抗體，也是目前監控豬流行性腹瀉主要的手段，對豬流行性腹瀉疫苗免疫效果評價、免疫程序制定、流行狀態監測均具有重要意義。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法。
[0007]—種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法，包括如下步驟:
1)豬流行性腹瀉病毒抗原的制備和抗原包被96孔聚苯乙烯反應板；
2)將待測動物保定，從其前腔靜脈處取血，將采集到的血液處理后獲得血清一抗，保存備用;
3)將血清一抗，以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液1:50稀釋后，按編號加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加100ul，37°C飽和濕度反應I小時，以PBST洗滌備用；
4)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液1:10000稀釋后,按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加10ul，37°C飽和濕度反應2小時，以PBST洗滌備用；
5)將TMB顯色劑按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加10ul，避光反應25分鐘，隨后每個反應孔加入10ul IM濃硫酸，終止反應；
6)放入酶標儀中，讀取0D650數據，判定結果。
[0008]所述的步驟I)為:以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋豬流行性腹瀉病毒純化抗原至16 TCID50/ml,以10ul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板，并以質量百分比濃度5%的脫脂奶粉的PBST溶液封閉，獲得ELISA反應的抗原基質，置于4°C備用。
[0009]所述的步驟3)為:以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液將待測豬血清中所含豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體1:50稀釋后，按編號以10ul/孔的濃度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，37°C飽和濕度反應I小時，以PBST洗滌備用；
所述的步驟4)為:以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體1:10000稀釋后，按順序以10ul/孔的濃度加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，37°C飽和濕度反應2小時，以PBST洗滌備用；
所述的步驟6)為:將終止后的96孔聚苯乙烯反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的0D650數值，并根據以下公式判定結果:已知陰性樣品的OD值< 0.4，而且已知陽性樣品的OD值> 1.0 ;在上述條件成立的情況下，如果待檢血清或初乳樣品與已知陽性樣品OD值的比值S/P彡0.5，則判為陽性；否則判為陰性。
[0010]本發明提供的豬流行性腹瀉病毒血液IgG抗體采集和檢測方法，相對于傳統的豬流行性腹瀉病毒檢測方法，具有以下優點:1)可以對整個豬群實行大面積采樣，避免豬群的屠宰采樣；2)血液樣品對溫度、環境、污染物的抵抗力更強，運輸和保存更方便；3)豬流行性腹瀉病毒血液IgG抗體檢測比抗原檢測更快速、敏感、可靠；4)量化豬群的豬流行性腹瀉免疫水平，所得數據更準確客觀全面；5)可監控豬群的豬流行性腹瀉免疫動態，預知豬群的免疫動向及管理。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1是檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒IgG特異性抗體的方法的過程示意圖。
【具體實施方式】
[0012]檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法包括如下步驟:
1)豬流行性腹瀉病毒抗原的制備和抗原包被96孔聚苯乙烯反應板；
2)將待測動物保定，從其前腔靜脈處取血，將采集到的血液處理后獲得血清一抗，保存備用;
3)將血清一抗，以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液1:50稀釋后，按編號加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加100ul，37°C飽和濕度反應I小時，以PBST洗滌備用； 4)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液1:10000稀釋后,按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加10ul，37°C飽和濕度反應2小時，以PBST洗滌備用；
5)將TMB顯色劑按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加10ul，避光反應25分鐘，隨后每個反應孔加入10ul IM濃硫酸，終止反應；
6)放入酶標儀中，讀取0D650數據，判定結果。
[0013]所述的步驟I)為:以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋豬流行性腹瀉病毒純化抗原至16 TCID50/ml,以10ul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板，并以質量百分比濃度5%的脫脂奶粉的PBST溶液封閉，獲得ELISA反應的抗原基質，置于4°C備用。
[0014]所述的步驟3)為:以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液將待測豬血清中所含豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體1:50稀釋后，按編號以10ul/孔的濃度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，37°C飽和濕度反應I小時，以PBST洗滌備用；
所述的步驟4)為:以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體1:10000稀釋后，按順序以10ul/孔的濃度加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，37°C飽和濕度反應2小時，以PBST洗滌備用；
所述的步驟6)為:將終止后的96孔聚苯乙烯反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的0D650數值，并根據以下公式判定結果:已知陰性樣品的OD值< 0.4，而且已知陽性樣品的OD值> 1.0 ;在上述條件成立的情況下，如果待檢血清樣品與已知陽性樣品OD值的比值S/P彡0.5，則判為陽性；否則判為陰性。
實施例
[0015]I)以商品化的豬流行性腹瀉病毒，17 TCID50/ml (半數細胞感染量/毫升)濃度，感染Vero細胞，培養72小時后，收集病毒液，4000g離心lOmin，取上清；35000g離心lh，獲得純化病毒，并滴定TCID50。將抗原以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至16 TCID50/ml，以10ul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板，飽和濕度下，4°C孵育16h。隨后棄去包被液，拍干ELISA板，加入以PBST (pH7.3 PBS, 0.05% tween-20)稀釋的5%脫脂奶粉溶液(PBST溶)200ul/孔，于22-28°C封閉lh。棄去封閉液，拍干ELISA板，每孔加入350 ul洗液(PBST)，洗滌I minX3次，拍干ELISA板，置于4°C備用，見圖1。
[0016]2)將豬進行保定，先用75%酒精棉球對前腔靜脈入針處進行局部消毒，再用干棉球擦干，用大拇指自始至終壓住前腔靜脈近心端，然后用消毒過的針頭急刺遠心端的前腔靜脈，血液流出第一、二滴棄去后，接血，使血液沿著瓶壁流入，采到7毫升血液后，松開大拇指，血液即停止流出，用5%碘酊棉球壓一下針孔即達到消毒止血。給采得血液注明號碼，立即靜置使其凝固，然后帶到實驗室，冬季于溫暖處，夏季置于冷暗處，使血清析出。經10-12小時，將析出的血清倒入另一只消毒空瓶中。將血清編碼，用于初步保存和運輸(常溫下、6小時內，或4°C下、72小時內運至實驗室)。將血清以3000g離心5min，取上清，獲得血清一抗，并與4°C (<7d)或-20°C (<60d)保存備用。
[0017]3)將處理備用的血清一抗，以3%脫脂奶粉溶液(PBST溶)1:50稀釋后，按編號加入抗原包被的反應板上，10ul/孔，每個樣品3個重復，同時設置陰性和血清陽性抗體對照各2孔。飽和濕度下，22-28°C孵育lh。隨后棄去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 350ul洗液(PBST)，洗滌I minX4次，拍干ELISA板，備用，見圖1。
[0018]4)將辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以3%脫脂奶粉溶液(PBST溶)為稀釋液，作1:10000倍稀釋后，按10ul/孔加入到上述一抗包被的反應孔中，22-280C /飽和濕度反應2h，隨后棄去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 350 ul洗液(PBST)，洗滌I minX5次，拍干ELISA板，備用，見圖1。
[0019]5)將TMB顯色液按10ul/孔加入到上述反應孔中，室溫避光反應25min，隨后加入10ul/孔終止液(IM濃硫酸)，終止反應，見圖1。
[0020]6)將終止后的反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的0D650數值，并根據以下公式判定結果:已知陰性樣品的OD值彡0.4，而且已知陽性樣品的OD值彡1.0 ;在上述條件成立的情況下，如果待檢血清樣品與已知陽性樣品OD值的比值S/P ^ 0.5，則判為陽性；否則判為陰性。
【權利要求】
1.一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)豬流行性腹瀉病毒抗原的制備和抗原包被96孔聚苯乙烯反應板； 2)將待測動物保定，從其前腔靜脈處取血，將采集到的血液處理后獲得血清一抗，保存備用; 3)將血清一抗，以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液1:50稀釋后，按編號加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加lOOul，37°C飽和濕度反應1小時，以PBST洗滌備用； 4)將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體，以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液1:10000稀釋后,按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加lOOul，37°C飽和濕度避光反應2小時，以PBST洗滌備用； 5)將TMB顯色劑按順序加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，每個反應孔加lOOul，避光反應25分鐘，隨后每個反應孔加入lOOul 1M濃硫酸，終止反應； 6)放入酶標儀中，讀取0D650數據，判定結果。
2.根據權利要求1所述的一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法，其特征在于，所述的步驟1)為:以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋豬流行性腹瀉病毒純化抗原至106 TCID50/ml,以lOOul/孔的濃度包被96孔聚苯乙烯ELISA反應板，并以質量百分比濃度5%的脫脂奶粉的PBST溶液封閉，獲得ELISA反應的抗原基質，置于4°C備用。
3.根據權利要求1所述的一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法，其特征在于，所述的步驟3)為:以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液將待測豬血清中所含豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體1:50稀釋后，按編號以lOOul/孔的濃度加入抗原包被的96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，37°C飽和濕度反應1小時，以PBST洗滌備用。
4.根據權利要求1所述的一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法，其特征在于，所述的步驟4)為:以質量百分比濃度3%的脫脂奶粉的PBST溶液將辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG-FC抗體1:10000稀釋后，按順序以lOOul/孔的濃度加入到96孔聚苯乙烯反應板的反應孔中，37°C飽和濕度反應2小時，以PBST洗滌備用。
5.根據權利要求1所述的一種檢測豬血液中豬流行性腹瀉病毒特異性IgG抗體的方法，其特征在于，所述的步驟6)為:將終止后的96孔聚苯乙烯反應板，放入預熱的酶標儀中，讀取各反應孔的0D650數值，并根據以下公式判定結果:已知陰性樣品的0D值< 0.4，而且已知陽性樣品的0D值彡1.0;在上述條件成立的情況下，如果待檢血清樣品與已知陽性樣品0D值的比值S/P彡0.5，則判為陽性；否則判為陰性。
【文檔編號】G01N33/569GK104330559SQ201410531939
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月11日 優先權日:2014年10月11日
【發明者】李龍, 于少芳, 曹洋洋 申請人:杭州貝爾塔生物技術有限公司