一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條，所述試紙條含有襯板和依次排列在襯板上的樣品墊、金標結合墊、纖維素膜和吸水墊，所述金標結合墊內吸附有異氯硫磷金標抗體，所述纖維素膜上有隱形檢測線和隱形對照線，所述隱形檢測線用異氯硫磷半抗原偶聯的載體蛋白溶液印制，所述隱形對照線用兔抗鼠IgG抗體印制。本發明具備特異性強，敏感性高，簡便、快速，結果顯示形象、直觀、準確等優點。
【專利說明】一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農藥殘留免疫分析【技術領域】，具體涉及一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條及其制備方法。
【背景技術】
[0002]異氯硫磷白色結晶固體，不溶于水，溶于丙酮、環己烷、甲苯、二甲苯、乙酸乙酯，用作農用殺蟲劑，該物質對環境有危害，應特別注意對水體的污染。建議用控制焚燒法或安全掩埋法處置。雄性大鼠的經口 LD50為400和460mg/kg，雌性大鼠經口值為330mg/kg，雄雌兩性經皮分別為790和1，250mg/kL大鼠體內總代謝與二乙基化合物的水解相反，有相當大部分為烷基磷酸酯及其他二烷基化合物的水解作用。
[0003]目前，對農藥殘留的檢測方法主要是儀器分析方法和酶聯免疫分析方法(ELISA)等。儀器分析方法包括高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)、氣相色譜法(Gas chromatography, GC)、薄層色譜法(Thin layer chromatography,TLC)、液-質串聯法(HPLC-MS)和氣-質串聯法(GC-MS)等，這些儀器分析方法雖然可以達到較高的檢測靈敏度，但需要復雜昂貴的儀器設備及專業操作人員，加之樣品前處理繁瑣費時、檢測費用高，難以滿足快速、在線檢測的需要。ELISA (Enzyme Linked ImmunosorbentAssay)方法是常用的免疫檢測方法，但是其卻有操作步驟相對較多，檢測時間較長，檢測結果不夠直觀，不能在線進行檢測等缺陷。因而ELISA方法的應用受到很大的限制。
【發明內容】
[0004]發明目的:本發明所要解決的第一個技術問題是提供了克服上述異氯硫磷快速檢測技術的不足，研制出一種特異、敏感、快速、簡便的異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條。本發明所要解決的第一個技術問題是提供了上述試紙條的制備方法。
[0005]技術方案:本發明提供的技術方案是一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條，所述試紙條含有襯板和依次排列在襯板上的樣品墊、金標結合墊、纖維素膜和吸水墊，所述襯板為不吸水的韌性材料，所述的韌性材料用硬質塑膠條或不吸水硬紙條制成，所述金標結合墊內吸附有異氯硫磷金標抗體，所述纖維素膜上有隱形檢測線和隱形對照線，所述隱形檢測線用異氯硫磷半抗原偶聯的載體蛋白溶液印制，所述隱形對照線用兔抗鼠IgG抗體印制。所述吸水墊為吸水能力較強的吸水濾紙或濾油紙。
[0006]其中，上述異氯硫磷金標抗體為膠體金標記的異氯硫磷單克隆抗體。
[0007]其中，上述偶聯異氯硫磷半抗原的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一種或幾種。
[0008]在試紙條的吸水墊上設有手柄端保護膜，在樣品墊上設有樣品浸入端保護膜。所述的保護膜為不透明的膠膜，樣品墊、金標結合墊對應的保護膜上印制有待測樣品標記線，該標記線偏向樣品墊一側約0.5厘米處。
[0009]其中，上述樣品墊用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜中的一種或幾種制成。
[0010]其中，上述纖維素膜為硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜中的一種或幾種。
[0011]上述異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條的制備方法包括以下步驟:
[0012]I)異氯硫磷半抗原的合成；
[0013]2)異氯硫磷半抗原與載體蛋白偶聯得到異氯硫磷半抗原偶聯的載體蛋白溶液；
[0014]3)異氯硫磷金標抗體的制備；
[0015]4)金標結合物墊的制備；
[0016]5)兔抗鼠IgG抗體的制備；
[0017]6)異氯硫磷半抗原偶聯的載體蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗體包被纖維素膜；
[0018]7)試紙條的組裝。
[0019]所述步驟I)中異氯硫磷半抗原的合成步驟如下:
[0020]81) O-甲基-O- (2-氯_4_硝基苯基)硫代憐酸氯的合成:稱取2_氯_4_硝基苯酌.3.7g用乙腈溶解；常溫下，將溶液逐滴加入20mL乙腈溶解的O-甲基硫代磷酰氯3.83g、粉WK2CO3S.7g混合溶液，滴完后，繼續反應I小時，反應完畢后真空過濾，蒸去溶劑，得黃色油狀物，柱層析，用體積比8:1的石油醚/ 二氯甲烷洗滌，蒸去溶劑得淡黃色油狀液體5.9g ；
[0021]82)異氯硫磷半抗原:0_甲基-O-(2-氯-4-硝基苯基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯的合成:稱取4-氨基丁酸0.54g、K0H 0.78g，溶解于6mL甲醇中，冰水浴冷卻至0_10°C，攪拌下緩慢加入溶解于6mL甲醇溶液的步驟(81)得到的黃色油狀液體1.28g，保溫反應2小時，反應完畢后，用體積比7:1的石油醚/乙醚洗滌，水層調pH = 3.0后用乙醚提取，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，得淺黃色油狀物O-甲基-O-(2-氯-4-硝基苯基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯 1.23g。
[0022]有益效果:現對于現有技術，本發明具備以下優點:
[0023]I)特異性強，敏感性高。本膠體金試紙條以膠體金標記高親和力的單克隆抗體為基礎制備而成，金標抗體中的膠體金顆粒與抗體分子之間無共價鍵，兩者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金的標記對單克隆抗體的特異性和親和力影響很小，而且有較高的標記率。因此，試紙條很好的保留了單克隆抗體的特性，具有較強的特異性和較高的敏感性，檢出最低限量可達到25ppb。
[0024]2)簡便、快速。在使用本膠體金試紙條時，無需任何其他輔助儀器，可現場操作，只要將檢測樣加入樣品墊，在5至10分鐘內即可判定檢測結果。
[0025]3)結果顯示形象、直觀、準確。膠體金試紙條的檢測結果以纖維素膜上的顯色情況來判斷。如果樣品中有待測物時，待測物和金標抗體結合形成抗原一金標抗體復合物，并且繼續上移，遇隱形檢測線T線不顯色或者顯色很弱即表示檢測樣品陽性或者弱陽性；如果樣品中沒有待測樣品時，金標抗體繼續上移，遇隱形檢測線T線顯示一條清晰紅線即表示檢測樣品陰性。隱形對照線C線顏色的有或無表示此試紙條的有效或無效。結果判定形象、直觀、準確、簡單明了。
[0026]4)節省費用，適用范圍廣，便于推廣。使用膠體金試紙條進行檢測，比使用儀器和ELISA試劑盒檢測進行檢測的費用大幅降低。再者，試紙條的使用范圍廣，可滿足不同層次人員的需要，便于推廣應用，具有廣闊的市場前景和明顯的經濟和社會效益。
[0027]本發明的異氯硫磷膠體金試紙條，無需專業操作人員及任何輔助類儀器，根據反應所顯現的條帶幾分鐘內即可判定結果，不僅操作簡便、快速、結果直觀準確、成本低，并且可以在室外進行檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028]圖1異氯硫磷快速檢測試紙條俯瞰結構示意圖；
[0029]圖2異氯硫磷快速檢測試紙條剖面結構示意圖；
[0030]圖中，1:襯板,2:樣品墊,3:金標結合墊,4:纖維素膜,5:隱形檢測線,6:隱形對照線，7:吸水墊，8-1:樣品浸入端保護膜，8-2:手柄端保護膜，9:標識線；
[0031]圖3、異氯硫磷快速檢測試紙條結果判定示意圖；
[0032]圖中，A為陰性樣品檢測結果，B為弱陽性樣品檢測結果，C為強陽性樣品檢測結果，D和E為試紙條失效。
【具體實施方式】
[0033]要制備異氯硫磷快速檢測試紙條，首先要制備偶聯異氯硫磷半抗原的載體蛋白，用于印制檢測線，進而制備異氯硫磷的金標抗體，用于制備金標抗體纖維棉，其次需要制備兔抗鼠IgG抗體，用于制備對照線。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0034]實施例1
[0035]一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條，所述試紙條含有襯板I和依次排列在襯板上的樣品墊2、金標結合墊3、纖維素膜4和吸水墊7，所述襯板I為不吸水的韌性材料，所述的韌性材料用硬質塑膠條制成，所述金標結合墊3內吸附有異氯硫磷金標抗體，所述纖維素膜4上有隱形檢測線5和隱形對照線6，所述隱形檢測線5用異氯硫磷半抗原偶聯的載體蛋白溶液印制，所述隱形對照線6用兔抗鼠IgG抗體印制。所述吸水墊7為吸水能力較強的吸水濾紙或濾油紙。異氯硫磷金標抗體為膠體金標記的異氯硫磷單克隆抗體。偶聯異氯硫磷半抗原的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA。在試紙條的吸水墊上設有手柄端保護膜8-2，在樣品墊2上設有樣品浸入端保護膜8-1。所述的保護膜為不透明的膠膜，樣品墊2、金標結合墊3對應的保護膜上印制有待測樣品標記線，該標記線偏向樣品墊一側約0.5厘米處。
[0036]樣品墊2用玻璃纖維棉制成。纖維素膜為硝酸纖維素膜。
[0037]實施例2
[0038]與實施例1基本一樣，區別在于，所述的韌性材料用不吸水硬紙條制成，所述吸水墊7為吸水能力較強的濾油紙。偶聯異氯硫磷半抗原的載體蛋白為雞卵清白蛋白0VA。樣品墊2用尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜制成。纖維素膜為純纖維素膜。
[0039]實施例3
[0040]與實施例1基本一樣，區別在于，所述的韌性材料用硬質塑膠條制成，吸水墊7為吸水能力較強的吸水濾紙。偶聯異氯硫磷半抗原的載體蛋白為人血清白蛋白HAS。樣品墊2用聚偏二氟乙烯膜和聚酯膜制成。纖維素膜為羧化纖維素膜。
[0041]實施例4
[0042]1、異氯硫磷半抗原(O-甲基-0-(2-氯-4-硝基苯基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯)的合成
[0043]①O-甲基-0-(2-氯_4_硝基苯基)硫代憐酸氯的合成。稱取2_氯_4_硝基苯酚3.7g (約21mmol)用乙腈溶解；常溫下，將溶液逐滴加入20mL乙腈溶解的O-甲基硫代磷酰氯3.83g (約23.2mmol)、粉狀K2C038.7g (約63mmol)混合溶液，滴完后，繼續反應I小時。反應完畢后真空過濾，蒸去溶劑，得黃色油狀物。柱層析，用石油醚/ 二氯甲烷(8: 1，體積比)洗滌，蒸去溶劑得淡黃色油狀液體5.9g。
[0044]②O-甲基-O-(2-氯-4-硝基苯基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯的合成。稱取4_氨基丁酸0.54g(約5.2mmol)、KOH 0.78g(約11.4mmol)，溶解于6mL甲醇中，冰水浴冷卻至0-10°C，攪拌下緩慢加入溶解于6mL甲醇溶液的⑴1.28g(約4.2mmol)，保溫反應2小時。反應完畢后，用石油醚/乙醚(7: 1，體積比)洗滌，水層調pH = 3.0后用乙醚提取，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，得淺黃色油狀物O-甲基-O-(2-氯-4-硝基苯基)-N-(丁酸)硫代憐Ife酷 1.23g。
[0045]2、異氯硫磷半抗原與載體蛋白偶聯
[0046]利用活潑酯法(Active Ester method,簡稱AE法)將具有羧基末端(-C00H)的半抗原偶聯到大分子的蛋白質上。分別稱取0.1mmol半抗原與0.1mmol NHS，用600 μ I DMF溶解于反應裝置中；稱取0.1mmol DCC，用400μ I DMF溶解；將DCC/DMF溶液緩慢滴加到上述反應裝置中。在磁力攪拌下室溫密封反應7小時。反應終液置4°C冰箱冷卻2小時以上，經8000rpm離心5分鐘,取上清活潑酯液十分緩慢的加入到5ml 15mg/ml的BSA蛋白中，反應在磁力攪拌下室溫攪拌4小時。待反應完成后，將反應液置于透析袋內，于0.02mol/LpH6.8的PB緩沖液中4°C攪拌透析，每四小時換一次透析液，共透析60小時。透析結束后將透析袋中的液體取出，經4°C 12000rpm離心5分鐘，取上清分裝保存于_20°C冰箱中。
[0047]同法，用OVA或HAS代替BSA制備人工抗原HAPTEN-0VA或HAPTEN-HAS。
[0048]3、抗異氯硫磷單克隆抗體的制備
[0049]以50 μ g?100 μ g每只的抗原量免疫6?8周齡健康的雌性BALB/c小鼠。每次間隔時間為2?3周，最后一次超強免疫后3天，無菌條件下取出小鼠脾細胞，將小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0以5:1的細胞數量用PEG介導的方法融合。融合后置于37°C、5%C02培養箱中培養。培養至細胞長滿培養孔1/3?1/2時，用間接競爭ELISA法選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行3次優先稀釋克隆，然后擴大培養，建立雜交瘤細胞株。將特異性的細胞株移入高密度細胞培養器(CELLINE 350)中培養，收集細胞培養液并用Protein A進行抗體純化，之后用超濾離心管去鹽，冷凍抽干獲得干粉狀抗體，并于_20°C凍存備用。
[0050]4、金標抗體和金標結合物墊的制備
[0051]采用檸檬酸三鈉還原氯金酸的方法，制備平均直徑在40nm的膠體金懸浮液。在回流條件下，把10ml 0.01%的氯金酸溶液加熱至沸騰,不停的攪拌,迅速加入1.1ml 1%的檸檬酸三鈉。當反應溶液顏色變成葡萄紅色時繼續加熱攪拌5min。冷卻至室溫后，加入0.05%的疊氮化鈉4°C保存。膠體金在與抗體標記前以0.2mol的K2C03溶液調到pH為8.2左右，采用經典NaCl滴定法確定膠體金溶液與異氯硫磷抗體的最佳標記量為5 μ g/ml。然后按最佳標記量進行標記，標記I小時后，攪拌下加入10% BSA (使最終BSA濃度為1% )，孵育I小時后4°C 1000rpm離心25min，并去上清。再用和所用膠體金溶液同體積的2% BSA溶液重懸后4°C 1000rpm離心25min，重復兩次。最后，用1/5膠體金溶液體積的TB溶液(含3%85八、3%蔗糖、0.0111101/1硼酸鈉和0.05%疊氮化鈉)重懸，4°C保存。用XYZ-3000三維噴膜儀把4%的BSA溶液以8 μ 1/cm的量噴在玻璃棉上，使用干燥箱42°C干燥50min，再把金標記抗體以7 μ 1/cm的量噴在玻璃棉上，干燥箱42°C干燥50min，真空干燥保存。
[0052]5、兔抗鼠IgG抗體的制備
[0053]將純化得到的IgG按50?100 μ g/kg體重經皮下和肌肉注射家兔3?4次，末次注射10天后，以ELISA測定其血清效價達到1:2000以上時，心臟采血，分離收集高免血清。以飽和硫酸銨法提取兔抗鼠IgG抗體，用于膠體金層析檢測試紙條對照線的制備。
[0054]6、偶聯抗原和兔抗鼠包被纖維素膜
[0055]用XYZ-3000三維噴膜儀把濃度為1.3mg/ml的偶聯抗原以1.2 μ 1/cm的量噴在纖維素膜的偏下側，作為檢測線。用XYZ-3000三維噴膜儀把濃度為0.6mg/mL的兔抗鼠IgG以1.2 μ Ι/cm的量噴在纖維素膜的偏上側，作為對照線，兩線間隔5mm。
[0056]7、快速試紙條的組裝
[0057]把纖維素膜粘貼在襯板中間部位上，吸水墊粘貼在纖維素膜上側和纖維素膜重疊1mm。金標結合物墊粘貼在NC膜下方重疊1mm。樣品墊粘貼在進標結合物墊下方重疊2mm。組裝好的試紙板用斬切機切成4.08mm寬的試紙條。
[0058]8、快速檢測試紙條檢測反應原理
[0059]當待測樣品溶液加入試紙條或試紙卡測試端后，待測溶液通過虹吸作用帶動待測物及金標結合物墊中的金標抗體一起向纖維素膜擴散，并最終滲入吸水墊端。在擴散過程中，如果樣品中有待測物時，待測物和金標抗體結合，進而占據了金標抗體上的抗原結合點，阻止金標抗體與纖維素膜上檢測線(半抗原與載體蛋白的結合物)的結合，使檢測線不顯色或者顯色很弱即表示檢測樣品陽性或者弱陽性；如果樣品中沒有待測樣品時，金標抗體在上移過程中，遇檢測線顯示一條清晰紅線即表示檢測樣品陰性。同樣，金標抗體也與纖維素膜上的對照線(兔抗鼠IgG)結合，使對照線顯紅色。對照線顏色的有或無分別表示此試紙條的有效或無效。
[0060]實施例5:(應用實施例)
[0061]1、檢測樣品液的制備
[0062]I)水檢測樣品溶液的預處理
[0063]取水樣離心(4000rpm，5min)或用濾紙過濾后，I比I (V/V)與10%甲醇PBS混勻，取150 μ I用于進行檢測。
[0064]2)蘋果樣品液的制備
[0065]取待測樣品去皮，用攪拌機勻漿。稱取10.0g樣品加入10.0ml乙腈，漩渦振蕩2分鐘，加入1.0g NaCl, 4.0g MgSO4，劇烈震蕩2分鐘，4000rpm離心10分鐘，吸取上清液2.0ml,溫和氮氣吹干。用Iml PBS緩沖液(含5%甲醇)定容，用漩渦振蕩器振蕩2分鐘，取1.0ml液體12000rpm離心10分鐘，再從上清中取出150 μ I用于檢測。
[0066]3)包菜樣品液的制備
[0067]取待測樣品洗凈，晾干，用攪拌機勻漿。稱取10.0g樣品加入10.0ml乙腈，漩渦振蕩2分鐘，加入1.0g NaCl,4.0g MgSO4,劇烈震蕩2分鐘，4000rpm離心10分鐘，吸取上清液
2.0ml，溫和氮氣吹干。用Iml PBS緩沖液(含5%甲醇)定容，用漩渦振蕩器振蕩2分鐘，取1.0ml液體12000rpm離心10分鐘，再從上清中取出150 μ I用于檢測。
[0068]2、檢測及結果判斷
[0069]如圖3所示:將異氯硫磷試紙條樣品端插入以上預處理的各待檢測樣品中，插入深度不超過標記線9，待測溶液通過虹吸作用帶動待測物及金標結合墊中的金標抗體一起向纖維素膜擴散，并最終滲入吸水墊端。在擴散過程中，如果樣品中有待測物濃度大于10ppb時，阻止金標抗體與纖維素膜上檢測線(半抗原與載體蛋白的結合物)的結合，使檢測線不顯色即表示檢測樣品為陽性(如圖3C);如果樣品中待測物在25?10ppm時，阻止部分金標抗體與纖維素膜上檢測線的結合，使檢測線顯示很弱的紅色即表示檢測樣品為弱陽性(如圖3B);如果樣品中待測物濃度小于25ppb時，不能阻止金標抗體與纖維素膜上檢測線的結合，使檢測線顯示一條清晰紅線即表示檢測樣品為陰性(如圖3A)。同樣，金標抗體也與纖維素膜上的對照線(兔抗鼠IgG)結合，使對照線顯紅色，對照線顏色的有或無分別表示此試紙條的有效或無效(如圖3A、B、C為有效D、E為無效)。5分鐘判定檢測結果。
[0070]實施例6
[0071]1.特異性試驗
[0072]按實施例5所述的方法進行試驗，將與異氯硫磷結構相似的五種農藥(毒死蜱、殺螟硫磷、甲基對硫磷、異氯硫磷、倍硫磷)的標準品配成1ppm,用本發明試紙條進行檢測，纖維素膜上檢測線與對照線呈“ I I ”排列，即異氯硫磷試紙條與毒死蜱、殺螟硫磷、甲基對硫磷、異氯硫磷、倍硫磷這五種農藥沒有交叉反應。從而可以斷定此試紙條特異性很好，在進行檢測時不會受到其他樣品的干擾。
[0073]2.敏感性和均一性試驗
[0074]按實施例5所述的方法進行試驗，用本發明試紙條進行檢測0ppb、12.5ppb、25ppm、50ppb、10ppb、200ppb、400ppb 的異氯硫磷標準品，重復 10 次，其中 100ppb、200ppb和400ppb的異氯硫磷標準品檢測的檢測結果為纖維素膜上的對照線呈一條紅色線，即為陽性；25ppm和50ppb的異氯硫磷標準品檢測的檢測結果為纖維素膜上的對照線呈一條紅色線，檢測線呈一條很弱的紅色線，即為弱陽性；0ppb和12.5ppb的異氯硫磷標準品檢測的檢測結果為纖維素膜上的檢測線和對照線呈兩條紅色線。因此本發明檢測試紙條的靈敏度為25ppb。此10檢測顯色深度均一，檢測結果顯示一致。
[0075]3.穩定性試驗
[0076]將試紙條放入鋁鉬袋中真空包裝，并且室溫保存，6個月后各項指標均符合上1-2項指標，即檢測其他相似農藥無交叉反應，靈敏度達25ppb，檢測顯色深度均一，反應結果一致。
【權利要求】
1.一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條，其特征在于，所述試紙條含有襯板(I)和依次排列在襯板(I)上的樣品墊(2)、金標結合墊(3)、纖維素膜(4)和吸水墊(7),所述金標結合墊(3)內吸附有異氯硫磷金標抗體，所述纖維素膜(4)上有隱形檢測線(5)和隱形對照線(6)，所述隱形檢測線(5)用異氯硫磷半抗原偶聯的載體蛋白溶液印制，所述隱形對照線(6)用兔抗鼠IgG抗體印制。
2.根據權利要求1所述的一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條，其特征在于，所述異氯硫磷金標抗體為膠體金標記的異氯硫磷單克隆抗體。
3.根據權利要求1所述的一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條，其特征在于，所述的偶聯異氣硫憐半抗原的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA、雞卵清白蛋白OVA或人血清白蛋白HAS中的一種或幾種。
4.根據權利要求1所述的一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條，其特征在于，在試紙條的吸水墊上設有手柄端保護膜，在樣品墊上設有樣品浸入端保護膜。
5.根據權利要求1所述的一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條，其特征在于，所述的樣品墊用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜中的一種或幾種制成。
6.根據權利要求1所述的一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條，其特征在于，所述的纖維素膜為硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜中的一種或幾種。
7.權利要求1所述的一種異氯硫磷膠體金快速檢測試紙條的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: O異氯硫磷半抗原的合成； 2)異氯硫磷半抗原與載體蛋白偶聯得到異氯硫磷半抗原偶聯的載體蛋白溶液； 3)異氯硫磷金標抗體的制備； 4)金標結合墊的制備； 5)兔抗鼠IgG抗體的制備； 6)異氯硫磷半抗原偶聯的載體蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗體包被纖維素膜； 7)試紙條的組裝。
8.根據權利要求7所述的異氯硫磷金快速檢測試紙條的制備方法，其特征在于，所述步驟I)中異氯硫磷半抗原的合成步驟如下: 81)0-甲基-O-(2-氯-4-硝基苯基)硫代憐酸氯的合成:稱取2-氯-4-硝基苯酌.3.7g用乙腈溶解；常溫下，將溶液逐滴加入20 mL乙腈溶解的O-甲基硫代磷酰氯3.83 g、粉狀K2CO3 8.7 g混合溶液，滴完后，繼續反應I小時，反應完畢后真空過濾，蒸去溶劑，得黃色油狀物，柱層析，用體積比8:1的石油醚/ 二氯甲烷洗滌，蒸去溶劑得淡黃色油狀液體5.9 g； 82)異氯硫磷半抗原:0-甲基-O-(2-氯-4-硝基苯基)-N- ( 丁酸)硫代磷酸酯的合成:稱取4-氨基丁酸0.54 g、K0H 0.78 g，溶解于6 mL甲醇中，冰水浴冷卻至0_10 °C，攪拌下緩慢加入溶解于6 mL甲醇溶液的步驟(81)得到的黃色油狀液體1.28 g，保溫反應2小時，反應完畢后，用體積比7:1的石油醚/乙醚洗滌，水層調pH = 3.0后用乙醚提取，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑，得淺黃色油狀物O-甲基-O- (2-氯-4-硝基苯基)-N- (丁酸)硫代磷酸酯1.23g。
【文檔編號】G01N33/577GK104267179SQ201410499528
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月25日 優先權日:2014年9月25日
【發明者】韓志成 申請人:句容市農業技術推廣中心