電致化學發光傳感器的制備方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法及應用。屬于電化學發光傳感器領域。以CdS量子點為電致化學發光信號源，利用介孔四氧化三鐵優良的生物兼容性和大的比表面積將抗體有效地固載在CdS-Fe3O4納米復合物表面，CdS量子點通過共價鍵固載在介孔四氧化三鐵表面制得抗體捕獲基底。根據對不同濃度的待測物的電致化學發光信號強度的不同，實現對真菌毒素類和激素類的檢測。
【專利說明】—種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法及應用。具體涉及一種CdS作為發光材料，CdS-Fe3O4作為捕獲抗體基底的電化學發光傳感器的制備與應用，屬于電化學發光檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]真菌毒素是廣泛存在于自然界的農產品污染物，真菌毒素具有強烈的腎臟毒性，肝臟毒性和神經毒性，并且有致畸、致癌和致突變作用。真菌毒素的存在對人類和動物健康以及畜牧業發展構成了巨大的威脅。激素是由人和動物某些細胞合成和分泌、能調節機體生理活動的特殊物質，和神經系統一起調節人體的代謝和生理功能。正常情況下各種激素是保持平衡的，如因某種原因使這種平衡打破了這就造成內分泌失調，會引起相應的臨床表現。因此，可利用測定真菌毒素和激素的含量來判斷農產品污染狀況及疾病診斷。
[0003]目前真菌毒素和激素的檢測方法主要是色譜分析和免疫分析法，例如薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法。雖然色譜分析靈敏度很高，但是色譜分析需要繁瑣的樣品預處理、預富集、儀器操作步驟復雜等缺點。為了克服以上色譜分析方法的缺點，本發明設計了一種簡單、快速、靈敏度和選擇性高的電致化學發光免疫分析方法。
[0004]本發明利用CdS量子點為電致化學發光信號源，CdS量子點通過共價鍵固載在介孔四氧化三鐵表面制得抗體捕獲基底，利用介孔四氧化三鐵優良的生物兼容性和大的比表面積將抗體固載在CdS-Fe3O4表面。在本發明中制備的電致化學發光傳感器具有操作簡單，成本低，靈敏度高，特異性高等優點，克服了色譜分析的一些不足。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是針對現有的真菌毒素和激素檢測方法存在的問題，提供一種簡單快速可靠的CdS-Fe3O4量子點電致化學發光傳感器的制備方法和應用，實現對真菌毒素和激素的靈敏、特異、快速、高效檢測。
[0006]本發明的技術方案如下:
1.一種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μπι氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，然后用乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈；
(2)滴涂4μ L、0.5^2 mg mL—1的Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液于電極表面，4°C保存至干燥；
(3)滴加4μ L、質量分數為f 3%的牛血清白蛋白溶液，以封閉電極表面的非特異性活性位點，用PH6.4^8.4的PBS緩沖溶液沖洗電極表面，4°C晾干；
(4)滴加4μ L待測物溶液，用ρΗ6.4^8.4的PBS緩沖溶液沖洗電極表面，放置在4°C的冰箱中孵化3?12 h晾干,制得一種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法。
[0007]2.上述所述的Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液的制備
在CdS-Fe3O4納米復合物溶液中，加入I mL、0.4?0.6mol/L的EDC溶液混合，加入ImL、0.09?0.13 mol/L的NHS溶液，利用EDC和NHS活化CdS-Fe3O4表面的羧基，加入10?10yLU mg/mL待測物抗體Ab溶液，混合，在4°C下振蕩孵化24 h，磁分離，去除上清液，然后將其分散在I mL、pH 7.4的PBS緩沖溶液，制得Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液，儲存在4 °C的冰箱中備用。
[0008]3.上述所述的CdS-Fe3O4納米復合物溶液的制備
(1)巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液的制備
將250 μ L巰基乙酸加入到50 mL、5?15mmol/L的CdCl2水溶液中，通氮氣25?40min以除去溶液中的氧氣；在氮氣保護下，加熱至100?12(TC,用1.0 mol/L的NaOH溶液調pH為11 ;加入5.5 mL、0.07?0.3mol/L的Na2S溶液，繼續攪拌4 h ;冷卻至室溫，制得巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液，4°C儲存；
(2)單分散的介孔Fe3O4的制備
將0.6?1.3 g FeCl3.6Η20溶解在20 mL乙二醇溶液中，形成透明的溶液，加入2.5?4 g乙酸鈉和10 mL乙二胺,強烈攪拌25?40 min,封裝在聚四氟乙烯的反應爸中，195?210°C下反應7?9 h，然后冷卻到室溫，所得到的產物用超純水洗滌，40?60°C條件下真空干燥12 h，制得單分散介孔四氧化三鐵；
(3)CdS-Fe3O4納米復合物溶液的制備
將2 mL巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液與I mL、0.4?0.6mol/L的EDC溶液混合，加入 I mL、0.09 ?0.13 mol/L 的 NHS 溶液，加入 0.8 ?1.2 mg Fe3O4,震蕩 20 ?40 min，磁性分離，超純水洗滌3次，制得CdS-Fe3O4納米復合物；將其分散到2mL、pH6.4^8.4的PBS緩沖溶液中，制得CdS-Fe3O4納米復合物溶液。
[0009]4.待測物的檢測方法
(1)使用電化學工作站的三電極體系進行測試，Ag/AgCI電極作為參比電極，鉬絲電極為對電極，所制備的電化學發光傳感器為工作電極，將電化學工作站和化學發光檢測儀連接在一起將光電倍增管的高壓設置為800 V，掃描電壓設置為-1.4?O V;
(2)在10mL、pH 7.8?8.2的含l(T30mmol/L過氧化氫的PBS緩沖溶液中，通過電致化學發光系統檢測對不同濃度的待測物標準溶液，產生的電致化學發光信號強度，繪制工作曲線；
(3 )將待測樣品溶液代替待測物標準溶液進行檢測。
[0010]如上所述待測物，選自真菌毒素類或激素類；真菌毒素類選自下列之一:黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素、雜色曲霉素、展青霉素；激素類選自下列之一:地塞米松、炔諾酮、19-去甲睪酮、玉米赤霉醇、群勃龍、醋酸甲羥孕酮、雌二醇。
[0011]本發明的有益成果
(1)電致化學發光傳感器制備方法，以CdS量子點為發光材料，利用CdS量子點良好的光學性能，構建的傳感器具有更高的靈敏度；
(2)CdS通過共價鍵與Fe3O4結合作為抗體捕獲基底，利用介孔Fe3O4優良的生物兼容性和大的比表面積將抗體有效地固載在CdS-Fe3O4表面。
[0012](3)本發明制備的電致化學發光傳感器用于真菌毒素和激素的檢測，操作簡單，響應時間短，信號響應范圍寬，可以實現簡單、快速、高靈敏和特異性檢測。
[0013]實施例1 一種基于CMS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μπι氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，然后用乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈；
(2)滴涂4μ L、0.5 mg mL—1的Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液于電極表面，4°C保存至干燥；
(3)滴加4μ L、質量分數為1%的牛血清白蛋白溶液，以封閉電極表面的非特異性活性位點，用ΡΗ6.4的PBS緩沖溶液沖洗電極表面，4°C晾干；
(4)滴加4μ L待測物溶液，用ρΗ6.4的PBS緩沖溶液沖洗電極表面，放置在4°C的冰箱中孵化3 h晾干,制得一種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法。
[0014]實施例2 —種基于CMS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μπι氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，然后用乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈；
(2)滴涂4μ LU.0mg mL—1的Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液于電極表面，4°C保存至干燥；
(3)滴加4μ L、質量分數為2%的牛血清白蛋白溶液，以封閉電極表面的非特異性活性位點，用ΡΗ7.4的PBS緩沖溶液沖洗電極表面，4°C晾干；
(4)滴加4μ L待測物溶液，用ρΗ7.4的PBS緩沖溶液沖洗電極表面，放置在4°C的冰箱中孵化8 h晾干,制得一種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法。
[0015]實施例3 —種基于CMS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μπι氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，然后用乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈；
(2)滴涂4yL、2 mg mL—1的Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液于電極表面，4°C保存至干燥；
(3)滴加4μ L、質量分數為3%的牛血清白蛋白溶液，以封閉電極表面的非特異性活性位點，用ΡΗ8.4的PBS緩沖溶液沖洗電極表面，4°C晾干；
(4)滴加4μ L待測物溶液，用ρΗ8.4的PBS緩沖溶液沖洗電極表面，放置在4°C的冰箱中孵化12 h晾干,制得一種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法。
[0016]實施例4 Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液的制備
在上述制得的CdS-Fe3O4納米復合物溶液中，加入I mL、0.4mol/L的EDC溶液混合，加入I mL、0.09mol/L的NHS溶液，利用EDC和NHS活化CdS-Fe3O4表面的羧基，加入10 μ LUmg/mL待測物抗體Ab溶液，混合，在4°C下振蕩孵化24 h，磁性分離，去除上清液，然后將其分散在I mL、pH 7.4的PBS緩沖溶液，制得Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液，儲存在4°C的冰箱中備用。
[0017]實施例5 Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液的制備
在上述制得的CdS-Fe3O4納米復合物溶液中，加入I mL、0.5mol/L的EDC溶液混合，加入I mL、0.10 mol/L的NHS溶液，利用EDC和NHS活化CdS-Fe3O4表面的羧基，加入50 μ L、I mg/mL待測物抗體Ab溶液，混合，在4°C下振蕩孵化24 h，磁性分離，去除上清液，然后將其分散在I mL、pH 7.4的PBS緩沖溶液，制得Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液，儲存在4°C的冰箱中備用。
[0018]實施例6 Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液的制備
在上述制得的CdS-Fe3O4納米復合物溶液中，加入I mL、0.6mol/L的EDC溶液混合，加入I mL、0.13 mol/L的NHS溶液，利用EDC和NHS活化CdS-Fe3O4表面的羧基，加入100 μ L、I mg/mL待測物抗體Ab溶液，混合，在4°C下振蕩孵化24 h，磁性分離，去除上清液，然后將其分散在I mL、pH 7.4的PBS緩沖溶液，制得Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液，儲存在4°C的冰箱中備用。
[0019]實施例7 CdS-Fe3O4納米復合物溶液的制備
(1)巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液的制備
將250 μ L巰基乙酸加入到50 mL、5 mmol/L的CdCl2水溶液中，通氮氣25 min以除去溶液中的氧氣；在氮氣保護下，加熱至100°C，用1.0 mol/L的NaOH溶液調pH為11 ;加入
5.5 mL、0.07 mol/L的Na2S溶液，繼續攪拌4 h ;冷卻至室溫，制得巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液，4°C儲存；
(2)單分散的介孔Fe3O4的制備
將0.6 g FeCl3.6H20溶解在20 mL乙二醇溶液中，形成透明的溶液，加入2.5 g乙酸鈉和10 mL乙二胺，強烈攪拌25min，封裝在聚四氟乙烯的反應釜中，195°C下反應7h，然后冷卻到室溫，所得到的產物用超純水洗滌，40°C條件下真空干燥12 h，制得單分散介孔四氧化三鐵；
(3)CdS-Fe3O4納米復合物溶液的制備
將2 mL巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液與I mL、0.4mol/L的EDC溶液混合，加入I mL、
0.09 mol/L的NHS溶液，然后加入0.8 mg Fe3O4,震蕩20min,磁性分離，超純水洗滌3次，制得CdS-Fe3O4納米復合物；將其分散到2mL、pH6.4的PBS緩沖溶液中，制得CdS-Fe3O4納米復合物溶液。
[0020]實施例8 CdS-Fe3O4納米復合物溶液的制備
(1)巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液的制備
將250 μ L巰基乙酸加入到50 mL、10 mmol/L的CdCl2水溶液中，通氮氣30 min以除去溶液中的氧氣；在氮氣保護下，加熱至110°C，用1.0 mol/L的NaOH溶液調pH為11 ;加入5.5 mL、0.2 mol/L的Na2S溶液，繼續攪拌4 h ;冷卻至室溫，制得巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液，4°C儲存；
(2)單分散的介孔Fe3O4的制備
將1.0 g FeCl3.6H20溶解在20 mL乙二醇溶液中，形成透明的溶液，加入3.0 g乙酸鈉和10 mL乙二胺，強烈攪拌30 min，封裝在聚四氟乙烯的反應釜中，200°C下反應8 h，然后冷卻到室溫，所得到的產物用超純水洗滌，50°C條件下真空干燥12 h，制得單分散介孔四氧化三鐵；
(3)CdS-Fe3O4納米復合物溶液的制備
將2 mL巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液與I mL、0.5mol/L的EDC溶液混合，加入I mL、
0.10 mol/L的NHS溶液，然后加入1.0 mg Fe3O4,震蕩30 min,磁性分離，超純水洗滌3次，制得CdS-Fe3O4納米復合物；將其分散到2mL、pH7.4的PBS緩沖溶液中，制得CdS-Fe3O4納米復合物溶液。
[0021]實施例9 CdS-Fe3O4納米復合物溶液的制備
(1)巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液的制備
將250 μ L巰基乙酸加入到50 mL、15 mmol/L的CdCl2水溶液中，通氮氣40 min以除去溶液中的氧氣；在氮氣保護下，加熱至120°C，用1.0 mol/L的NaOH溶液調pH為11 ;加入5.5 mL、0.3 mol/L的Na2S溶液，繼續攪拌4 h ;冷卻至室溫，制得巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液，4°C儲存；
(2)單分散的介孔Fe3O4的制備
將1.3 g FeCl3.6H20溶解在20 mL乙二醇溶液中，形成透明的溶液，加入4 g乙酸鈉和10 mL乙二胺，強烈攪拌40 min，封裝在聚四氟乙烯的反應釜中，210°C下反應9 h，然后冷卻到室溫，所得到的產物用超純水洗滌，60°C條件下真空干燥12 h，制得單分散介孔四氧化三鐵；
(3)CdS-Fe3O4納米復合物溶液的制備
將2 mL巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液與I mL、0.6mol/L的EDC溶液混合，加入I mL、0.13 mol/L的NHS溶液，然后加入1.2 mg Fe3O4,震蕩40 min,磁性分離，超純水洗滌3次，制得CdS-Fe3O4納米復合物；將其分散到2mL、pH8.4的PBS緩沖溶液中，制得CdS-Fe3O4納米復合物溶液。
[0022]實施例10伏馬菌素的檢測
(1)使用電化學工作站的三電極體系進行測試，Ag/AgCI電極作為參比電極，鉬絲電極為對電極，所制備的電化學發光傳感器為工作電極，將電化學工作站和化學發光檢測儀連接在一起將光電倍增管的高壓設置為800 V，掃描電壓設置為-1.4?O V ;
(2)在10mL、pH 7.8的含10 mmol/L過氧化氫的PBS緩沖溶液中，通過電致化學發光系統檢測對不同濃度的待測物標準溶液，產生的電致化學發光信號強度，繪制工作曲線；
(3)將待測樣品溶液代替伏馬菌素標準溶液進行檢測，測得線性范圍為0.01ng/mL?100ng/mL,檢測限為 2.lpg/mL。
[0023]實施例11赭曲霉毒素A的檢測
(1)使用電化學工作站的三電極體系進行測試，Ag/AgCI電極作為參比電極，鉬絲電極為對電極，所制備的電化學發光傳感器為工作電極，將電化學工作站和化學發光檢測儀連接在一起將光電倍增管的高壓設置為800 V，掃描電壓設置為-1.4?O V ;
(2)在10mL、pH 8.2的含30 mmol/L過氧化氫的PBS緩沖溶液中，通過電致化學發光系統檢測對不同濃度的赭曲霉毒素A標準溶液，產生的電致化學發光信號強度，繪制工作曲線；
(3)將待測樣品溶液代替赭曲霉毒素A標準溶液進行檢測，測得線性范圍為0.0lng/mL?100 ng/mL,檢測限為 2.lpg/mL。
[0024]實施例12雜色曲霉素的檢測
繪制工作曲線步驟同實施例10，按照繪制工作曲線的方法進行黃曲霉毒素B2樣品分析，測得線性范圍為0.0lng/mL^lOO ng/mL,檢測限為2.lpg/mL。
[0025]實施例13地塞米松的檢測
繪制工作曲線步驟同實施例10，按照繪制工作曲線的方法進行黃曲霉毒素B2樣品分析，測得線性范圍為0.015ng/mL、0ng/mL,檢測限為3.lpg/mL。
[0026]實施例15醋酸甲羥孕酮的檢測
繪制工作曲線步驟同實施例10，按照繪制工作曲線的方法進行黃曲霉毒素B2樣品分析，測得線性范圍為0.0080ng/mL?100 ng/mL,檢測限為1.6 pg/mL。
【權利要求】
1.一種基于CMS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法及應用 一種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0 μ m、0.3 μ m、0.05 μπι氧化鋁拋光粉依次做拋光處理，然后用乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈； (2)滴涂4μ L、0.5^2 mg mL—1的Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液于電極表面，4°C保存至干燥； (3)滴加4μ L、質量分數為f 3%的牛血清白蛋白溶液，以封閉電極表面的非特異性活性位點，用PH6.4^8.4的PBS緩沖溶液沖洗電極表面，4°C晾干； (4)滴加4μ L待測物溶液，用ρΗ6.4^8.4的PBS緩沖溶液沖洗電極表面，放置在4°C的冰箱中孵化3?12 h晾干,制得一種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法。
2.如權利要求1所述的一種基于CMS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法,所述Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液，其特征在于，制備步驟如下: 在CdS-Fe3O4納米復合物溶液中，加入I mL、0.4?0.6mol/L的EDC溶液混合，加入ImL、0.09?0.13 mol/L的NHS溶液，利用EDC和NHS活化CdS-Fe3O4表面的羧基，加入10?10yLU mg/mL待測物抗體Ab溶液，混合，在4°C下振蕩孵化24 h，磁分離，去除上清液，然后將其分散在I mL、pH 7.4的PBS緩沖溶液，制得Ab-CdS-Fe3O4抗體孵化溶液，儲存在4 °C的冰箱中備用。
3.如權利要求2所述的一種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法,所述CdS-Fe3O4納米復合物溶液，其特征在于，制備步驟如下: (1)巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液的制備 將250 μ L巰基乙酸加入到50 mL、5?15mmol/L的CdCl2水溶液中，通氮氣25?40min以除去溶液中的氧氣；在氮氣保護下，加熱至100?12(TC,用1.0 mol/L的NaOH溶液調pH為11 ;加入5.5 mL、0.07?0.3mol/L的Na2S溶液，繼續攪拌4 h ;冷卻至室溫，制得巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液，4°C儲存； (2)單分散的介孔Fe3O4的制備 將0.6?1.3 g FeCl3.6Η20溶解在20 mL乙二醇溶液中，形成透明的溶液，加入2.5?4 g乙酸鈉和10 mL乙二胺,強烈攪拌25?40 min,封裝在聚四氟乙烯的反應爸中，195?210°C下反應7?9 h，然后冷卻到室溫，所得到的產物用超純水洗滌，40?60°C條件下真空干燥12 h，制得單分散介孔四氧化三鐵； (3)CdS-Fe3O4納米復合物溶液的制備 將2 mL巰基乙酸穩定的CdS量子點溶液與I mL、0.4?0.6mol/L的EDC溶液混合，加入 I mL、0.09 ?0.13 mol/L 的 NHS 溶液，加入 0.8 ?1.2 mg Fe3O4,震蕩 20 ?40 min,磁性分離，超純水洗滌3次，制得CdS-Fe3O4納米復合物；將其分散到2mL、pH6.4^8.4的PBS緩沖溶液中，制得CdS-Fe3O4納米復合物溶液。
4.如權利要求1所述的制備方法制備的一種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法，其特征在于，用于待測物的檢測，檢測步驟如下: (I)使用電化學工作站的三電極體系進行測試，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉬絲電極為對電極，所制備的電化學發光傳感器為工作電極，將電化學工作站和化學發光檢測儀連接在一起將光電倍增管的高壓設置為800 V，掃描電壓設置為-1.4?O V; (2)在10mL、pH 7.8?8.2的含l(T30mmol/L過氧化氫的PBS緩沖溶液中，通過電致化學發光系統檢測對不同濃度的待測物標準溶液，產生的電致化學發光信號強度，繪制工作曲線； (3)將待測樣品溶液代替待測物標準溶液進行檢測。
5.如權利要求1、2和4所述的一種基于CdS-Fe3O4電致化學發光傳感器的制備方法，所述待測物，選自真菌毒素類或激素類；真菌毒素類選自下列之一:黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素、雜色曲霉素、展青霉素；激素類選自下列之一:地塞米松、炔諾酮、19-去甲睪酮、玉米赤霉醇、群勃龍、醋酸甲羥孕酮、雌二醇。
【文檔編號】G01N33/74GK104316707SQ201410465916
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月13日 優先權日:2014年9月13日
【發明者】魏琴, 呂曉輝, 閆濤, 朱寶存, 杜斌, 馬洪敏, 張勇, 吳丹 申請人:濟南大學