基于葉綠素熒光的浮游植物光合速率快速檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于葉綠素熒光的浮游植物光合速率快速檢測方法。本發明從光合作用能流角度出發，采用葉綠素熒光作為光合作用的探針，提出一種浮游植物葉綠素熒光的可變光脈沖誘導方法，將復雜的光合作用能流過程分段，通過分析不同誘導模式下葉綠素熒光動力學曲線，分段獲得主導光合作用能流效率的光合參數；在此基礎上，根據生物膜能流過程，建立基于葉綠素熒光的浮游植物光合速率的定量分析方法，實現浮游植物光合作用狀態和生長潛能的實時快速檢測，為發展現場原位測量技術提供方法基礎。
【專利說明】基于葉綠素熒光的淳游植物光合速率快速檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于環境科學領域，具體涉及一種基于葉綠素熒光的浮游植物光合速率快 速檢測方法。
【背景技術】
[0002] 浮游植物是自然水體初級生產者，其光合組織雖然不到全球總植被生物量的1 %， 但其生產力約占總植物生產力45%，光合固碳量占全球總固碳量40% [1]，對維持水體生態 系統的正常運轉至關重要。近些年隨著我國水質富營養化程度加劇，浮游植物過量繁殖，水 華和赤潮災害頻發，特別是自20世紀70年代以來，水華和赤潮發生頻率以每10年增加3倍 的速度不斷上升，已經嚴重危害生態環境，極大地影響了漁業、旅游業、水產養殖業的發展， 實時快速監測浮游植物的生長潛能是預測、防治水華和赤潮災害的關鍵。浮游植物光合速 率是其生長潛能和光合作用狀態的指示劑，實時快速測量浮游植物光合速率對研究水體初 級生長力、防治水華和赤潮災害具有重要的現實意義。
[0003]目前，浮游植物光合速率是通過測量光合作用過程中反應物消耗速率或產物生成 速率間接獲得，包括光合放氧測定法、C02吸收測定法和有機物積累分析法等。然而，這些傳 統光合速率分析方法大多采用現場采樣后離線分析方式，測量周期長、效率低、時效性差且 手續繁瑣。更為重要的是傳統方法離線分析過程已經改變浮游植物生長環境，影響了浮游 植物生理狀態，只能獲得實驗模擬環境下的光合速率，難以對自然條件下浮游植物光合速 率進行快速準確測量。
【發明內容】
[0004] 針對浮游植物光合作用狀態和生長潛能的實時快速監測需求，本發明從光合作用 能流角度出發，以葉綠素熒光作為浮游植物光合作用的探針，利用可變光脈沖誘導葉綠素 熒光，分段研究浮游植物光合作用能流過程，獲取主導光合作用能流效率的光合參數，建立 基于葉綠素熒光的光合速率的定量分析方法，實現浮游植物光合速率的實時快速檢測，為 發展現場原位測量技術提供方法基礎。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：
[0006] 基于葉綠素熒光的浮游植物光合速率快速檢測方法，包括以下步驟：
[0007] (1)設計快速可變光脈沖激發策略，實現光合作用能流過程的分段
[0008] 浮游植物細胞經暗適應后，參與Calvin循環的幾種酶失去活性，重新照光后需要 經過一個光合誘導期才能正常運行；在光合誘導期內，所有的電子受體均可以接收電子被 還原，卻不能及時給出電子被氧化，存在一個單電子周轉期，不同電子受體單周轉的周期不 同；在單周轉期內，強光照射促使能夠接收電子的電子受體數快速減少至零，電子傳遞鏈被 阻塞，葉綠素熒光快速上升至最大；單周轉期后，電子受體再氧化給出電子，葉綠素熒光開 始弛豫下降；
[0009] QA、QjPPQ單周轉周期分別為100μ s、lms和10-20ms，是電子傳遞鏈中的容易產 生電子阻塞的三個電子受體，本發明采用快速可變的光脈沖作激發光源，通過調節光脈沖 振幅、頻率、占空比和激發時序，設計不同的激發策略，選擇性還原QA、QB和PQ，獲取不同誘 導模式下的葉綠素熒光動力學曲線；
[0010] ① QA飽和快相熒光動力學曲線
[0011] 在不造成光損傷的情況下，采用占空比大的高強度快速光脈沖，在QA單電子周轉 內產生足夠高的能量累積，將其全部還原，打斷光合作用的電子傳遞鏈，獲得QA飽和快相熒 光動力學曲線，該曲線僅與QA之前光合能流過程有關；
[0012] ②QB飽和快相熒光動力學曲線
[0013] QA單周轉期后，電子向后傳遞給QB;通過降低脈沖光瞬時光強和占空比，在Q B單周 轉期內使QA發生更多氧化還原反應，將電子傳遞到QB，將其全部還原，阻塞電子傳遞鏈，獲 得QB飽和快相熒光動力學曲線，該曲線僅與QB之前光合能流過程有關；
[0014] ③PQ飽和快相熒光動力學曲線
[0015] 再次降低脈沖光瞬時光強和占空比，在PQ單周轉期內使QB發生更多氧化還原反 應，將電子傳遞到PQ，將其全部還原，阻塞光電子傳遞鏈，產生PQ飽和快相熒光動力學曲 線，該曲線取決于PQ之前光合能流過程；
[0016] ④PQ飽和弛豫熒光動力學曲線
[0017] PQ電子飽和后，關閉飽和光脈沖，使用微弱探測光脈沖激發，為了減小探測光對光 合作用過程影響，探測光脈沖需要保持較低光強和占空比；PQ飽和模式下，PQ池被全部還 原，探測光脈沖產生的熒光達到峰值，PQ單周轉期結束，PQ重新被氧化，電子向后傳遞，探 測光脈沖誘導熒光出現弛豫下降過程，該過程僅與PQ后光合能流過程有關；
[0018] (2)分析葉綠素熒光動力學曲線，獲取主導光合作用能流效率的光合參數
[0019] 在浮游植物光合誘導期內，強光照射促使能夠接收電子的電子受體數快速減少至 零，葉綠素 a分子吸收的激發能就不再參與光化學反應，表現為葉綠素熒光的快速上升；過 了光合誘導期后，Calvin循環得以正常運行，葉綠素熒光開始弛豫下降；根據浮游植物光 合作用能量傳遞模型，該葉綠素熒光動力學過程f(t)可以表示為激發光能I (t)、功能吸收 截面〇PSII、光化學反應電荷分離效率η和電子受體再氧化動力學過程的函數；
[0020]
【權利要求】
1.基于葉綠素熒光的浮游植物光合速率快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 設計快速可變光脈沖激發策略，實現光合作用能流過程的分段 浮游植物細胞經暗適應后，參與Calvin循環的幾種酶失去活性，重新照光后需要經過 一個光合誘導期才能正常運行；在光合誘導期內，所有的電子受體均可以接收電子被還原， 卻不能及時給出電子被氧化，存在一個單電子周轉期，不同電子受體單周轉的周期不同；在 單周轉期內，強光照射促使能夠接收電子的電子受體數快速減少至零，電子傳遞鏈被阻塞， 葉綠素熒光快速上升至最大；單周轉期后，電子受體再氧化給出電子，葉綠素熒光開始弛豫 下降； QA、QjPPQ單周轉周期分別為1〇〇μ s、lms和10-20ms，是電子傳遞鏈中的容易產生電 子阻塞的三個電子受體，本發明采用快速可變的光脈沖作激發光源，通過調節光脈沖振幅、 頻率、占空比和激發時序，設計不同的激發策略，選擇性還原Q A、QB和PQ，獲取不同誘導模式 下的葉綠素熒光動力學曲線； ① QA飽和快相熒光動力學曲線 在不造成光損傷的情況下，采用占空比大的高強度快速光脈沖，在仏單電子周轉內產 生足夠高的能量累積，將其全部還原，打斷光合作用的電子傳遞鏈，獲得QA飽和快相熒光動 力學曲線，該曲線僅與Q A之前光合能流過程有關； ② QB飽和快相熒光動力學曲線 QA單周轉期后，電子向后傳遞給QB;通過降低脈沖光瞬時光強和占空比，在QB單周轉期 內使Qa發生更多氧化還原反應，將電子傳遞到Qb，將其全部還原，阻塞電子傳遞鏈，獲得Q b 飽和快相熒光動力學曲線，該曲線僅與Qb之前光合能流過程有關； ③ PQ飽和快相熒光動力學曲線 再次降低脈沖光瞬時光強和占空比，在PQ單周轉期內使QB發生更多氧化還原反應，將 電子傳遞到PQ，將其全部還原，阻塞光電子傳遞鏈，產生PQ飽和快相熒光動力學曲線，該曲 線取決于PQ之前光合能流過程； ④ PQ飽和弛豫熒光動力學曲線 PQ電子飽和后，關閉飽和光脈沖，使用微弱探測光脈沖激發，為了減小探測光對光合作 用過程影響，探測光脈沖需要保持較低光強和占空比；PQ飽和模式下，PQ池被全部還原，探 測光脈沖產生的熒光達到峰值，PQ單周轉期結束，PQ重新被氧化，電子向后傳遞，探測光脈 沖誘導熒光出現弛豫下降過程，該過程僅與PQ后光合能流過程有關； (2) 分析葉綠素熒光動力學曲線，獲取主導光合作用能流效率的光合參數 在浮游植物光合誘導期內，強光照射促使能夠接收電子的電子受體數快速減少至零， 葉綠素 a分子吸收的激發能就不再參與光化學反應，表現為葉綠素熒光的快速上升；過了 光合誘導期后，Calvin循環得以正常運行，葉綠素熒光開始弛豫下降；根據浮游植物光合 作用能量傳遞模型，該葉綠素熒光動力學過程f(t)可以表示為激發光能I(t)、功能吸收截 面〇 psn、光化學反應電荷分離效率η和電子受體再氧化動力學過程的函數；
(!) F。為所有PSII反應中心都打開時的初始熒光，Fm為PSII反應中心全部關閉時的最大 熒光，C(t)是t時刻PSII反應中心關閉比例或關閉狀態。C(t)取決于激發光能I(t)至 PSII的傳遞速率和QA的再氧化速率，可由下式表示：
函數g(t)描述了 t時刻QA的再氧化動力學過程，取決于其后的電子傳遞速率
，可由下式表示：
01 然而，由于公式（1)-(3)非線性很強，不存在能夠描述葉綠素熒光信號與激發信號之 間函數關系的解析解。在本發明專利中，采用快速光脈沖和高速采樣率測量葉綠素熒光動 力學曲線，公式（1)-(3)可離散化為公式（4)-(6)的遞歸形式：
14) fn為第η個光脈沖的葉綠素熒光采樣值，Cn為第η個脈沖時PSII反應中心關閉狀態， 表示如下：
(5) Ιη為第η個光脈沖的激發能量，ΑηΛ取決于QA及其后的電子受體的再氧化動力學過程：
m ak和
bV別是各電子受體的再氧化幅值常數和電子傳遞速率，At是光脈沖周期；理 論上通過（4)-(6)式對4進行擬合，便可反演得到之前列舉的所有的熒光參數； 然而，（4)-(6)式中共有功能吸收截面、電子傳遞速率等7個光合參數，直接進行熒光 動力學曲線擬合仍無法得到準確的數值解；因此，在本發明中，通過分析QA、QB和PQ飽和模 式下的快相熒光和弛豫熒光，分段研究光合作用過程，以減少擬合參數個數，使擬合函數對 某個或幾個參數更加敏感，獲得準確有效的光合參數； ① QA飽和快相熒光分析 QA飽和模式下，電荷在仏處累積，電子傳遞鏈中斷，熒光快速上升，得到PSII的最大熒 光產率Fm、初始熒光產率F。；該快相熒光過程與QA后的電子傳遞過程無關，（4)-(6)式得以 簡化：
(K) 通過（7)、（8)式對QA飽和模式的快相熒光進行曲線擬合，可得到有效吸收截面〇PSII 和電荷分離效率η。同時，可計算出最大光量子效率Λ φ = (F^FJ/Fm; ② QB飽和快相熒光分析 QB飽和模式下，電荷在％處累積，該快相熒光過程與QB后的電子傳遞過程無關，Fo、Fm、 〇PSII和Π 保持不變且已知，通過（4)-(6)式分析％飽和下的快相熒光曲線能夠準確得到 9&到％間電子傳遞速率.·^; ③ PQ飽和快相熒光分析 PQ飽和模式下，電荷在PQ處累積，該快相熒光過程與PQ后的電子傳遞過程無關，同理 通過QB飽和下的快相熒光分析可準確得到QB到PQ間電子傳遞速率
④PQ飽和弛豫突光分析 PQ電子飽和后，PQ池被全部還原，探測光脈沖產生的熒光達到峰值，PQ單周轉期結束， PQ再氧化過程開啟，在PQ處累積的電荷向后傳遞，光合作用正向電子傳遞效率非常高，逆 向電子傳遞過程可以忽略，熒光呈現弛豫下降過程，該過程僅與PQ后光合能流過程有關。 通過（5)式，即可擬合出PQ至PSI電子傳遞速率和PSI至Fd的電子傳遞速率 (3)結合生物膜能流理論，建立浮游植物光合速率葉綠素熒光分析方法 浮游植物光合速率是活體細胞對光能吸收、轉化和利用效率，即參與光化學反應能量 占激發光能量的比例；根據生物膜能流理論，浮游植物光合速率與最大光量子效率，光能的 吸收效率〇 PSII，電荷分離效率Π ，以及QA、QB、PQ、PSI和Fd等主要電子受體間的電子傳遞 速率
等光合參數線性相關，具體可由（9)式計算：
(9) 通過（9)式建立基于葉綠素熒光的浮游植物光合速率的定量分析方法，實現浮游植物 光合作用狀態和生長潛能的實時快速檢測。
2.根據權利要求1所述的基于葉綠素熒光的浮游植物光合速率快速檢測方法，其特征 在于，所述方法也可用于高等植物光合速率快速測定。
【文檔編號】G01N21/64GK104215616SQ201410465026
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】殷高方, 趙南京, 石朝毅, 胡麗, 方麗, 肖雪, 段靜波, 邱曉晗, 覃志松, 王園園, 張玉鈞, 劉建國, 劉文清 申請人:中國科學院合肥物質科學研究院