高效活性表達的鴨坦布蘇病毒e蛋白核心抗原域蛋白的用途
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】內的蛋白質分析、制備和診斷技術，涉及高效活性表達的鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域蛋白的用途，鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域堿基序列見序列表中序列1所示，在篩選DTMUV抗原表位核心區域的基礎上，建立了高敏感性、準確性和操控性強的間接ELISA檢測方法，為有效預防和控制DTMUV的傳播提供強有力的工具和技術支撐。
【專利說明】高效活性表達的鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域蛋白的用途
[0001]
【技術領域】
本發明涉及生物【技術領域】內的蛋白質分析、制備和診斷技術，涉及高效活性表達的鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域蛋白的用途。
[0002]
【背景技術】
2010年，一種新型的鴨源黃病毒在我國規模化養鴨場爆發并迅速蔓延至全國，給我國養鴨業帶來了巨大的經濟損失。該病原-鴨坦布蘇病毒(Duck Tembusu virus, DTMUV)為黃病毒科、黃病毒屬成員，為有囊膜不分節段單股正鏈RNA病毒。鴨感染DTMUV后主要出現神經癥狀、采食量減少、產蛋嚴重下降甚至絕產，并出現大量死亡。感染DTMUV的鴨容易繼發病毒性肝炎、傳染性漿膜炎、大腸桿菌等其他疾病，疾病發生后由于大量應用藥物，導致藥物殘留嚴重，影響到鴨肉品質和人類健康。此外，水禽是流感病毒在自然界中的重要“貯存器”，一旦自身免疫力下降，就會造成流感病毒的大量增殖和重組變異。
[0003]鑒于DTMUV產生和潛在的巨大危害，必須建立合理的防控和監測措施，全面及時的了解鴨群的感染帶毒狀況。因此，標準化、高準確度的血清學檢測方法成為必然。國際上通用的黃病毒屬血清學檢測方法有ELISA、AGP、血凝抑制試驗(HI)、補體結合試驗(CF)和中和實驗(NT)等，但ELISA具有特異性強、靈敏度高、檢測速度快、操作簡便等優點。CN103869066A公開了一種坦布蘇病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法。檢測靈敏度及準確性，是判斷檢測方法好壞的依據。現有技術中公開的ELISA檢測方法，靈敏度及準確性，都有很大的提升空間。
【發明內容】
[0004]為了解決以上現有技術中坦布蘇病毒的ELISA檢測方法中存在的靈敏度及準確性不高的問題，本發明提供了一種高效活性表達的鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域蛋白在坦布蘇病毒的ELISA檢測方法中的應用。
[0005]本發明是通過以下措施實現的:
本發明所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域的確定，是根據鴨坦布蘇病毒E蛋白的表達產物進行同源建模，通過分析其完整3D結構、蛋白組成及各組成區域精細結構，發現E蛋白在病毒表面折疊成3個不同結構域1-1IKDomain 1-1II ):D I是由8個β折疊片組成的桶狀結構，位于蛋白的中心位置，為圖中淺灰區域；D II (圖中深灰色區域)則是形成延伸的指狀結構，其序列穿插于D I序列之中，在D II末端即為融合環；在0 II相反的方向為D IIK圖中黑色區域),為Ig樣(Immunoglobulin-like)結構域,是典型的免疫球蛋白結構，含有7個β片層，同時根據其他相似黃病毒的研究和對該區域精細結構分析發現，此區域是病毒抗原表位存在的主要位置；此外，通過對黃病毒進入宿主細胞的過程研究，發現DTMUV E蛋白中His 144、His285、His320位于D I和D III之間的界面上(見圖1標注)，參與E蛋白pH依賴的構象改變，也是抗體作用的主要位點。所以，由以上蛋白質結構可知，DTMUV抗原優勢區域位于E蛋白的D III。
[0006]本發明所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域(堿基序列見序列表中序列I所示，以下簡稱E DIII)的表達，是在確定核心抗原域的基礎上，首先設計鴨坦布蘇病毒E蛋白DIII的 PCR 擴增表達引物 E Dili exp-1: 5 ’ -CATGCCATGGAAAGGCATGACCTACCCGATGTG-3 ’(包含NcoI 酶切位點)，E Dili exp-2: 5’-CCGCTCGAGACTTCTATGCCACTGGTACCT_3’(包含 XhoI 酶切位點)，用于鴨坦布蘇病毒E DIII的克隆。采用NcoI和XhoI雙酶切PCR產物后，連入同樣雙酶切的pET32a中，構建重組表達質粒pET32a/E D III，然后轉化大腸桿菌表達菌株Rosettagarni B (DE3)進行E D III的高效活性表達。SDS-PAGE結果顯示，當溫度為18 °C，IPTG濃度為0.2mM過夜誘導培養時，實現了 E DIII蛋白的高效可溶性表達，蛋白表達量可占到菌體總蛋白的42%，并且蛋白具有天然活性。
[0007]本發明所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域的表達還包括表達蛋白的高純度制備。菌體進行超聲破碎，收集上清蛋白，選用鎳柱進行純化。首先用含50mM Tris和300mMNaCl (pH值8.0)的緩沖液平衡柱體，然后以合適的速度使上清蛋白經過柱體，最后用不同濃度的咪唑進行梯度洗脫，洗脫液為50mM Tris,300mM NaCl和O mM、20mM、40 mM、50 mM、250mM不同濃度的Imidazole (pH值8.0),收集洗脫的蛋白在20mM Tris (pH7.4 )的條件下透析。最終獲得純度為90%的高純度蛋白。
[0008]本發明所述的鴨坦布蘇病毒抗體間接ELISA診斷方法其特征在于:用原核表達的高純度活性E DIII蛋白作為ELISA包被蛋白，每孔加入100--L含0.5ug/ml的E DIII蛋白的包被液，室溫作用30min后4°C過夜，PBST洗三次，37°C封閉2h，然后加入待檢的稀釋10000倍的鴨坦布蘇病毒血清，每孔100--L，室溫作用0.5h，PBST洗板3次后加入100--L 1:5000稀釋的兔抗鴨酶標二抗，室溫0.5h，PBST洗板3次，最后加入100--Llmg/mLTMB底物，室溫作用15min后加入終止液，酶標儀中測定0D450值。反應同時設陽性和陰性對照，陰性陽性的判定標準為當0D450檢測值-陰性對照均值/陽性對照均值-陰性對照均值，所得比值大于等于0.2為陽性，小于等于0.2為陰性。
[0009]本發明提供的ELISA檢測試劑盒，其特征在于:
所用的ELISA板為用10mL含0.5mg/mL鴨坦布蘇病毒E D III蛋白的包被液室溫作用30min后4°C包被過夜，PBST洗板3次，加入封閉液，37°C封閉2h的酶標板。
[0010]所用包被液為含15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3, pH 9.6 的溶液。
[0011]所用PBST 為每 100mL 溶液含 8g NaCl,0.2g KCl, 2.9g Na2HP04.12H20, 0.2gKH2PO4j 0.5mL tween-20 0
[0012]所用底物緩沖液為每500mL溶液含14.2g檸檬酸，10.5g Na2HPO4.12H20。
[0013]所用底物溶液為TMB母液(0.Ig/1OOmL無水乙醇)1mL,底物溶液90mL，H2O2 750uL臨用前配制而成。
[0014]所用封閉液為含1%BSA的PBST。
[0015]所用酶標二抗是以PBST 1: 5000稀釋。
[0016]所用陽性血清對照標準品為使用鴨坦布蘇病毒純化E DIII蛋白經過四次免疫新西蘭大白兔制備而成，作為標準陽性血清_20°C分裝保存備用。
[0017]所用陰陽性結果判定:當0D450檢測值-陰性對照均值/陽性對照均值-陰性對照均值，所得比值大于等于0.2為陽性，小于等于0.2為陰性。
[0018]本發明的有益效果: 在篩選DTMUV抗原表位核心區域的基礎上，建立了高敏感性、準確性和操控性強的間接ELISA檢測方法，為有效預防和控制DTMUV的傳播提供強有力的工具和技術支撐。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1.E蛋白3D結構示意圖，
其中D I為左端淺灰區域，D II為中段深灰區域，D III為右端黑色區域；
圖2.鴨坦布蘇病毒誘導表達圖，
其中:M: Markers, I:未誘導上清，2:未誘導沉淀，3:0.2mM IPTG 18 V過夜(上清);4:0.2mM IPTG 18 °C 過夜(沉淀)；5:0.2mM IPTG 25 °C過夜(上清)；6:0.2mMIPTG 25 °C 過夜(沉淀)；7:0.2mM IPTG 30 °C過夜(上清)；8:0.2mM IPTG 30 °C過夜(沉淀)9:0.2mM IPTG 37 °C (上清)5h ; 10:0.2mM IPTG 37 °C 5h (沉淀)；
圖3.鴨坦布蘇病毒E D III蛋白純度鑒定，
其中:M: Markers，1，2均為E D III蛋白純化產物。
【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例，進一步闡明本發明有關內容。下列實例中未注明的具體試驗方法，通常按照分子克隆實驗室手冊中所述的條件，或按照制造廠商提供的條件。
[0021 ] 實施例1抗原蛋白的獲得
鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域(以下簡稱E D III)的表達，是在確定核心抗原域的基礎上，首先設計鴨坦布蘇病毒E蛋白DIII的PCR擴增表達引物E Dili exp-1: 5’_CATGCCATGGAAAGGCATGACCTACCCGATGTG-3’(包含NcoI 酶切位點)，E Dili exp-2: 5’-CCGCTCGAGACTTCTATGCCACTGGTACCT-3’ (包含XhoI酶切位點)，用于鴨坦布蘇病毒E D III的克隆。采用NcoI和XhoI雙酶切PCR產物后，連入同樣雙酶切的pET32a中，構建重組表達質粒pET32a/E D III，然后轉化大腸桿菌表達菌株Rosetta garni B (DE3)進行E DIII的高效活性表達。SDS-PAGE結果顯示，當溫度為18 V，IPTG濃度為0.2mM過夜誘導培養時，實現了 E DIII蛋白的高效可溶性表達，蛋白表達量可占到菌體總蛋白的42%，并且蛋白具有天然活性。
[0022]本發明所述的鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域的表達還包括表達蛋白的高純度制備。菌體進行超聲破碎，收集上清蛋白，選用鎳柱進行純化。首先用含50mM Tris和300mMNaCl (pH值8.0)的緩沖液平衡柱體，然后以合適的速度使上清蛋白經過柱體，最后用不同濃度的咪唑進行梯度洗脫，洗脫液為50mM Tris,300mM NaCl和O mM、20mM、40 mM、50 mM、250mM不同濃度的Imidazole (pH值8.0),收集洗脫的蛋白在20mM Tris (pH7.4 )的條件下透析。最終獲得純度為90%的高純度蛋白。
[0023]實施例2
鴨坦布蘇病毒E DIII間接ELISA方法抗原最佳包被濃度、最佳血清稀釋度、抗原最佳包被條件、酶標二抗的工作濃度和時間通過以下方式獲得:
(O抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度的確定
抗原與血清的濃度確定采用方陣滴定法。用20mM Tris(pH7.4 )對E DIII抗原蛋白進行倍比稀釋，終濃度分別為 I U g/ml, 0.5 μ g/ml, 0.25 μ g/ml, 0.125 μ g/ml,每孔 100 μ L 橫向包被酶標板，4°C過夜。然后使用PBST液洗三次，加入封閉液，37°C封閉2h。陰陽性血清從1:2000開始進行酶標板縱向的倍比稀釋，稀釋度分別為1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:16000,每孔加100--L，室溫作用0.5h，PBST洗板3次。然后加入2000倍稀釋羊抗鴨酶標二抗酶標二抗100--L，室溫0.5h，PBST洗板3次，最后加入100--Llmg/mL TMB底物，室溫作用15min后加入終止液，在酶標儀中測定0D450值。根據P/N值最終確定抗原的最佳包被濃度和陰陽性血清的最佳稀釋度。當抗原濃度為0.5 μ g/ml，血清稀釋度1:10000時，陽性血清的0D450值為1.0303 1)，陰性為0.1597，P/N值最大為6.4493 (見下表)。因此0.05 μ g抗原為包被最佳濃度，血清1:10000稀釋是最佳稀釋濃度。
[0024]滴定方陣OD值
【權利要求】
1.一種高效活性表達的鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域表達蛋白在鴨坦布蘇病毒的ELISA檢測方法中的應用，鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域堿基序列如序列表中序列I所/Jn ο
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域表達蛋白是通過以下步驟得到的: 設計鴨坦布蘇病毒E蛋白D III的PCR擴增表達引物:
E D III exp-1: 5’-CATGCCATGGAAAGGCATGACCTACCCGATGTG-3’，
E D III exp-2: 5’-CCGCTCGAGACTTCTATGCCACTGGTACCT-3’， 用于鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原基因的克隆，采用NcoI和XhoI雙酶切PCR產物后，連入同樣雙酶切的質粒中，構建重組表達質粒，轉化大腸桿菌表達菌株進行活性表達。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于大腸桿菌表達菌株在18V, IPTG濃度為0.2mM過夜誘導培養。
4.根據權利要求2或3所述的應用，其特征在于對大腸桿菌菌體進行超聲破碎，收集上清蛋白，選用鎳柱進行純化得到鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域的高純度表達蛋白。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于首先用pH值為8.0、含50mMTris和300mMNaCl的緩沖液平衡柱體，然后使上清蛋白經過柱體，最后用咪唑進行梯度洗脫，洗脫液為50mM Tris,300mM NaCl 和濃度分別為 O mM、20mM、40 mM、50 mM、250mM 的咪唑，pH值為 8.0，收集洗脫的蛋白在PH7.4、20mM Tris的條件下透析，獲得純度為90%的高純度蛋白。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的應用，其特征在于鴨坦布蘇病毒E蛋白核心抗原域表達蛋白作為ELISA包被蛋白，用于鴨坦布蘇病毒的ELISA檢測。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于ELISA包被蛋白的包被濃度為0.5mg/mL。
8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所用的ELISA板為用10uL含0.5mg/mL鴨黃病毒E D III蛋白的包被液室溫作用30min后4°C包被過夜，PBST洗板3次，加入封閉液，37°C封閉2h的酶標板。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于所用包被液為含15mMNaCO3, 35mMNaHCO3, pH 9.6 的溶液；所用 PBST 為每 100mL 溶液含 8gNaCl，0.2gKCl, 2.9gNa2HP04.12H20, 0.2g KH2PO4, 0.5mL tween-20 ;所用底物緩沖液為每 500mL 溶液含 14.2g 檸檬酸，10.5g Na2HPO4.12H20 ;所用底物溶液為0.1g/1OOmL無水乙醇1mL,底物溶液90mL，H2O2 750uL臨用前配制而成；所用封閉液為含1%BSA的PBST;所用酶標二抗是以PBST 1:5000稀釋。
【文檔編號】G01N33/68GK104198736SQ201410445731
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】張琳, 黃慶華, 張秀美, 許傳田, 楊少華, 黃艷艷 申請人:山東省農業科學院畜牧獸醫研究所