一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種人類副流感病毒(HPIVs)IgM抗體檢測試紙條及其制備方法，該試紙條包括PVC底板、樣品墊、吸水墊、包被有HPIVs特異性重組抗原的金標墊、包被有鼠抗人IgM多克隆抗體的檢測線和包被有抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜(NC膜)，運用免疫層析法對人體血清中的人類副流感病毒特異性抗體IgM進行快速檢測，以便于對人類副流感病毒急性期感染的鑒別診斷，在臨床檢驗學上有一定的意義。
【專利說明】一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學檢驗【技術領域】，具體涉及一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條及其制備方法。
【背景技術】
[0002]人類副流感病毒(HPIVs)是引起兒童下呼吸道感染的一種病毒，從血清學上HPIVs可分為4型(I型到IV型)，可以造成反復發作的上呼吸道感染(如感冒和喉嚨痛)，它也能造成嚴重的反復感染的下呼吸道疾病(如肺炎，支氣管炎和細支氣管炎)，特別是在老年人中和有免疫缺陷人群中。
[0003]目前臨床上診斷HPIVs感染的方法有:先通過組織培養，再分離鑒定在細胞中的病毒或直接檢測存在于呼吸道分泌物中的病毒，其中包括使用免疫熒光試驗、PCR、酶聯免疫反應測定等方法，另外一種方法就是檢測單一血清標本中特異抗體IgM。
[0004]患者感染HPIV s病原體后，臨床癥狀出現后一周左右，血清中產生特異性抗體IgM, 10-30天到達高峰，12-26周消失，當患者出現癥狀再去就診時，IgM抗體已經達到比較高的水平，因此IgM抗體陽性可作為急性期感染的診斷指標。目前比較先進的一種檢測方法是用免疫熒光法進行檢測，但是該檢測方法每次只能檢測相應的一種物質，敏感性較差，效果有時不理想。
[0005]所以快速高效地檢驗人類副流感病毒IgM抗體的方法在臨床上有一定的研究意義。
【發明內容】
[0006]本發明解決的技術問題就是提供一種快速高效地檢驗人體血清中人類副流感病毒(HPIVs) IgM抗體的檢測試紙條及其制備方法。
[0007]本發明的技術方案為:一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條，該試紙條包括:含有膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原的玻璃纖維膜、包被有二抗IgM的檢測線和包被有抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜。
[0008]進一步地，所述的二抗IgM為鼠抗人IgM多克隆抗體。
[0009]進一步地，所述HPIVs特異性重組抗原的濃度為lmg/mL，所述二抗IgM的濃度為2mg/mL,所述抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的濃度為lmg/mL。
[0010]所述的人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條的制備方法，包括下述步驟:
[0011]I)制備膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原玻璃纖維膜:
[0012](I)膠體金溶液的制備:用王水(體積比為3:1的濃HCL和濃HNO3)浸泡容器一定時間20-30min，然后用超純水清洗干凈，烘干；向容器內加入99.14mL純水和0.86mL的2%氯金酸溶液，邊攪拌邊加熱，加熱至沸騰后繼續煮沸8min，加入2.5mLl%檸檬酸三鈉水溶液，繼續攪拌加熱lOmin，冷卻后加入純水至10mL,得到酒紅色膠體金溶液；其中，膠體金顆粒平均直徑在15-25nm ；
[0013](2)金標HPIVs特異性重組抗原的制備:
[0014]a.調節膠體金溶液pH:取上述制備的膠體金溶液，用0.1M的K2CO3溶液調節pH至8.5—9.0 ；
[0015]b.稀釋HPIVs特異性重組抗原:用磷酸鹽緩沖液(PB)將HPIVs特異性重組抗原稀釋至蛋白含量為0.2-0.8mg/mL ;其中，所述的磷酸鹽緩沖液為:取KCL、Na2HPO4、KH2PO4共1.8g,用0.8L蒸懼水溶解,再用鹽酸調節pH,加水至總體積為IL制成；
[0016]c.膠體金與重組抗原的偶聯:取步驟b中的稀釋液0.2-1.0mL，在4°C條件下2500r/min離心30min，吸取出250 μ L上清液，棄去沉淀，邊攪拌邊將上清液逐滴加入到步驟a中調節好pH的膠體金溶液中，靜置1min ;加入穩定劑10% BSA溶液lmL，使終濃度為1%，在4°C條件下2500r/min離心30min，靜置lOmin，棄上清，留沉淀物，用緩釋劑溶解，再在4°C條件下500r/min離心lOmin，去除聚集物，留上清液，再次將上清液在4°C條件下2500r/min離心30min,重懸底部疏松沉淀，即得到膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原；
[0017](3)用三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將標記好膠體金的HPIVs特異性重組抗原溶液均勻涂布到已經處理好的玻璃纖維素膜上，冷凍干燥，備用；
[0018]2)制備包被有二抗IgM的檢測線和包被有抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜:
[0019]將二抗IgM稀釋成2mg/mL,將抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體稀釋成lmg/mL ;用三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將稀釋好的二抗IgM均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將稀釋好的抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質控線，室溫包被過夜，封袋備用；
[0020]3)制備試紙條:
[0021]將樣品墊在封閉液中浸泡40min，烘干，封裝備用；將PVC底板、硝酸纖維素膜檢測層、樣品墊、玻璃纖維素膜和吸水墊組合，PVC底板上硝酸纖維素膜的上方粘帖吸水紙，硝酸纖維素膜與吸水紙相互交疊0.2mm，在硝酸纖維素膜的下方依次粘貼玻璃纖維膜和樣品墊，硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜之間以及玻璃纖維膜與樣品墊之間相互交疊0.2mm,即得本發明產品人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條。
[0022]本發明試紙條的工作原理為:采用膠體金免疫層析技術，當待檢樣品中含有HPIVsIgM抗體時，HPIVs IgM抗體先和玻璃纖維素膜上膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原結合，由于層析作用復合物沿包被膜向前移動，當遇到檢測線上的鼠抗人IgM多克隆抗體時，形成抗體-金標重組抗原-抗體復合物，在檢測線上富集，形成紅色沉淀線。
[0023]本發明還可以達到半定量檢測目的:在試紙制備時通過調節檢測線和質控線包被物濃度，控制檢測時檢測線和質控線的顯色深淺，并將其顯色深淺與標準物質濃度對應起來，即可。
[0024]本發明的有益效果體現在:由于IgM抗體陽性可作為急性期感染的診斷指標，所以用膠體金標記抗HPIVsIgM抗體，通過免疫層析法檢測人體血清中是否存在HPIVsIgM抗體，就可以快速直接地判斷出是否感染了 HPIVs病原體。
【具體實施方式】
[0025]實施例1:一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條，該試紙條包括PVC底板、硝酸纖維素膜檢測層、樣品墊、玻璃纖維素膜和吸水墊，其中所述的玻璃纖維膜為含有膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原的玻璃纖維膜，所述的硝酸纖維素膜檢測層為包被有二抗IgM的檢測線和包被有抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜；所述的二抗IgM為鼠抗人IgM多克隆抗體；所述HPIVs特異性重組抗原的濃度為lmg/mL，所述二抗IgM的濃度為2mg/mL,所述抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的濃度為lmg/mL。
[0026]一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條的構成:PVC膠板購自北京傲銳東源(OriGene Technologies)生物科技有限公司，吸水墊北京傲銳東源(OriGeneTechnologies)生物科技有限公司，硝酸纖維素膜購自賽默飛世爾科技有限公司，HPIVs特異性重組抗原、鼠抗人IgM多克隆抗體以及抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體均購自美國傲銳東源公司(OriGene)，含有膠體金標記的類副流感病毒特異性重組抗原的玻璃纖維膜購自賽默飛世爾科技有限公司。
[0027]一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條的制備方法為:
[0028]I)制備膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原玻璃纖維膜:
[0029](I)膠體金溶液的制備:用王水(體積比為3:1的濃HCL和濃HNO3)浸泡容器一定時間20min，然后用超純水清洗干凈，烘干；向容器內加入99.14mL純水和0.86mL的2%氯金酸溶液，邊攪拌邊加熱，加熱至沸騰后繼續煮沸8min，加入2.5mLl %檸檬酸三鈉水溶液，繼續攪拌加熱lOmin，冷卻后加入純水至10mL,得到酒紅色膠體金溶液；其中，膠體金顆粒平均直徑在15nm ；
[0030](2)金標HPIVs特異性重組抗原的制備:
[0031]a.調節膠體金溶液pH:取上述制備的膠體金溶液，用0.1M的K2CO3溶液調節pH至
8.5 ；
[0032]b.稀釋HPIVs特異性重組抗原:用磷酸鹽緩沖液(PB)將HPIVs特異性重組抗原稀釋至蛋白含量為0.2mg/mL ;其中，所述的磷酸鹽緩沖液為:取KCL、Na2HPO4, KH2PO4共1.8g,用0.8L蒸餾水溶解，再用鹽酸調節pH，加水至總體積為IL制成；
[0033]c.膠體金與重組抗原的偶聯:取步驟b中的稀釋液0.2mL，在4°C條件下2500r/min離心30min,吸取出250 μ L上清液,棄去沉淀,邊攪拌邊將上清液逐滴加入到步驟a中調節好PH的膠體金溶液中，靜置1min ;加入穩定劑10 % BSA溶液lmL，使終濃度為I %，在4°C條件下2500r/min離心30min，靜置lOmin，棄上清，留沉淀物，用緩釋劑溶解，再在4°C條件下500r/min離心1min,去除聚集物，留上清液,再次將上清液在4?條件下2500r/min離心30min,重懸底部疏松沉淀，即得到膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原；
[0034](3)用三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將標記好膠體金的HPIVs特異性重組抗原溶液均勻涂布到已經處理好的玻璃纖維素膜上，室溫包被過夜，備用；
[0035]2)制備包被有二抗IgM的檢測線和包被有抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜:
[0036]將二抗IgM稀釋成2mg/mL,將抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體稀釋成lmg/mL ;用三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將稀釋好的二抗IgM均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將稀釋好的抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質控線，室溫包被過夜，備用；
[0037]3)制備試紙條:
[0038]將樣品墊在封閉液中浸泡40min，烘干，封裝備用，所述封閉液為含牛血清蛋白的PH為8.5的磷酸鹽洗滌液；將PVC底板、硝酸纖維素膜檢測層、樣品墊、玻璃纖維素膜和吸水墊組合，PVC底板上硝酸纖維素膜的上方粘帖吸水紙，硝酸纖維素膜與吸水紙相互交疊
0.2mm，在硝酸纖維素膜的下方依次粘貼玻璃纖維膜和樣品墊，硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜之間以及玻璃纖維膜與樣品墊之間相互交疊0.2mm,即得產品人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條。
[0039]實施例2:—種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條，該試紙條包括PVC底板、硝酸纖維素膜檢測層、樣品墊、玻璃纖維素膜和吸水墊，其中所述的玻璃纖維膜為含有膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原的玻璃纖維膜，所述的硝酸纖維素膜檢測層為包被有二抗IgM的檢測線和包被有抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜；所述的二抗IgM為鼠抗人IgM多克隆抗體；所述HPIVs特異性重組抗原的濃度為lmg/mL，所述二抗IgM的濃度為2mg/mL,所述抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的濃度為lmg/mL。
[0040]人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條的構成:PVC膠板購自北京傲銳東源(OriGene Technologies)生物科技有限公司，吸水墊北京傲銳東源(OriGeneTechnologies)生物科技有限公司，硝酸纖維素膜購自賽默飛世爾科技有限公司，HPIVs特異性重組抗原、鼠抗人IgM多克隆抗體以及抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體均購自美國傲銳東源公司(OriGene)，含有膠體金標記的類副流感病毒特異性重組抗原的玻璃纖維膜購自賽默飛世爾科技有限公司。
[0041]一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條的制備方法為:
[0042]I)制備膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原玻璃纖維膜:
[0043](I)膠體金溶液的制備:用王水(體積比為3:1的濃HCL和濃HNO3)浸泡容器一定時間25min，然后用超純水清洗干凈，烘干；向容器內加入99.14mL純水和0.86mL的2%氯金酸溶液，邊攪拌邊加熱，加熱至沸騰后繼續煮沸8min，加入2.5mLl %檸檬酸三鈉水溶液，繼續攪拌加熱lOmin，冷卻后加入純水至10mL,得到酒紅色膠體金溶液；其中，膠體金顆粒平均直徑在20nm ；
[0044](2)金標HPIVs特異性重組抗原的制備:
[0045]a.調節膠體金溶液pH:取上述制備的膠體金溶液，用0.1M的K2CO3溶液調節pH至
8.7 ；
[0046]b.稀釋HPIVs特異性重組抗原:用磷酸鹽緩沖液(PB)將HPIVs特異性重組抗原稀釋至蛋白含量為0.5mg/mL ;其中，所述的磷酸鹽緩沖液為:取KCL、Na2HPO4, KH2PO4共1.8g,用0.8L蒸餾水溶解，再用鹽酸調節pH，加水至總體積為IL制成；
[0047]c.膠體金與重組抗原的偶聯:取步驟b中的稀釋液0.6mL，在4°C條件下2500r/min離心30min,吸取出250 μ L上清液,棄去沉淀,邊攪拌邊將上清液逐滴加入到步驟a中調節好PH的膠體金溶液中，靜置1min ;加入穩定劑10 % BSA溶液lmL，使終濃度為I %，在4°C條件下2500r/min離心30min，靜置lOmin，棄上清，留沉淀物，用緩釋劑溶解，再在4°C條件下500r/min離心1min,去除聚集物，留上清液,再次將上清液在4?條件下2500r/min離心30min,重懸底部疏松沉淀，即得到膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原；
[0048](3)用三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將標記好膠體金的HPIVs特異性重組抗原溶液均勻涂布到已經處理好的玻璃纖維素膜上，室溫包被過夜，備用；
[0049]2)制備包被有二抗IgM的檢測線和包被有抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜:
[0050]將二抗IgM稀釋成2mg/mL,將抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體稀釋成lmg/mL ;用三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將稀釋好的二抗IgM均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將稀釋好的抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質控線，室溫包被過夜，備用；
[0051]3)制備試紙條:
[0052]將樣品墊在封閉液中浸泡40min，烘干，封裝備用，所述封閉液為含牛血清蛋白的PH為8.7的磷酸鹽洗滌液；將PVC底板、硝酸纖維素膜檢測層、樣品墊、玻璃纖維素膜和吸水墊組合，PVC底板上硝酸纖維素膜的上方粘帖吸水紙，硝酸纖維素膜與吸水紙相互交疊
0.2mm，在硝酸纖維素膜的下方依次粘貼玻璃纖維膜和樣品墊，硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜之間以及玻璃纖維膜與樣品墊之間相互交疊0.2mm,即得產品人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條。
[0053]實施例3:—種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條，該試紙條包括PVC底板、硝酸纖維素膜檢測層、樣品墊、玻璃纖維素膜和吸水墊，其中所述的玻璃纖維膜為含有膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原的玻璃纖維膜，所述的硝酸纖維素膜檢測層為包被有二抗IgM的檢測線和包被有抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜；所述的二抗IgM為鼠抗人IgM多克隆抗體；所述HPIVs特異性重組抗原的濃度為lmg/mL，所述二抗IgM的濃度為2mg/mL,所述抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的濃度為lmg/mL。
[0054]一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條的構成:PVC膠板購自北京傲銳東源(OriGene Technologies)生物科技有限公司，吸水墊北京傲銳東源(OriGeneTechnologies)生物科技有限公司，硝酸纖維素膜購自賽默飛世爾科技有限公司，HPIVs特異性重組抗原、鼠抗人IgM多克隆抗體以及抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體均購自美國傲銳東源公司(OriGene)，含有膠體金標記的類副流感病毒特異性重組抗原的玻璃纖維膜購自賽默飛世爾科技有限公司。
[0055]一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條的制備方法為:
[0056]I)制備膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原玻璃纖維膜:
[0057](I)膠體金溶液的制備:用王水(體積比為3:1的濃HCL和濃HNO3)浸泡容器一定時間30min，然后用超純水清洗干凈，烘干；向容器內加入99.14mL純水和0.86mL的2%氯金酸溶液，邊攪拌邊加熱，加熱至沸騰后繼續煮沸8min，加入2.5mLl %檸檬酸三鈉水溶液，繼續攪拌加熱lOmin，冷卻后加入純水至10mL,得到酒紅色膠體金溶液；其中，膠體金顆粒平均直徑在25nm ；
[0058](2)金標HPIVs特異性重組抗原的制備:
[0059]a.調節膠體金溶液pH:取上述制備的膠體金溶液，用0.1M的K2CO3溶液調節pH至
9.0 ；
[0060]b.稀釋HPIVs特異性重組抗原:用磷酸鹽緩沖液(PB)將HPIVs特異性重組抗原稀釋至蛋白含量為0.8mg/mL ;其中，所述的磷酸鹽緩沖液為:取KCL、Na2HPO4, KH2PO4共1.8g,用0.8L蒸餾水溶解，再用鹽酸調節pH，加水至總體積為IL制成；
[0061]c.膠體金與重組抗原的偶聯:取步驟b中的稀釋液1.0mL，在4°C條件下2500r/min離心30min,吸取出250 μ L上清液,棄去沉淀,邊攪拌邊將上清液逐滴加入到步驟a中調節好PH的膠體金溶液中，靜置1min ;加入穩定劑10% BSA溶液lmL，使終濃度為1%，在4°C條件下2500r/min離心30min，靜置lOmin，棄上清，留沉淀物，用緩釋劑溶解，再在4°C條件下500r/min離心1min,去除聚集物，留上清液,再次將上清液在4?條件下2500r/min離心30min,重懸底部疏松沉淀，即得到膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原；
[0062](3)用三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將標記好膠體金的HPIVs特異性重組抗原溶液均勻涂布到已經處理好的玻璃纖維素膜上，室溫包被過夜，備用；
[0063]2)制備包被有二抗IgM的檢測線和包被有抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜:
[0064]將二抗IgM稀釋成2mg/mL,將抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體稀釋成lmg/mL ;用三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將稀釋好的二抗IgM均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將稀釋好的抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質控線，室溫包被過夜，備用；
[0065]3)制備試紙條:
[0066]將樣品墊在封閉液中浸泡40min，烘干，封裝備用，所述封閉液為含牛血清蛋白的PH為9.0的磷酸鹽洗滌液；將PVC底板、硝酸纖維素膜檢測層、樣品墊、玻璃纖維素膜和吸水墊組合，PVC底板上硝酸纖維素膜的上方粘帖吸水紙，硝酸纖維素膜與吸水紙相互交疊
0.2mm，在硝酸纖維素膜的下方依次粘貼玻璃纖維膜和樣品墊，硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜之間以及玻璃纖維膜與樣品墊之間相互交疊0.2mm,即得產品人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條。
[0067]檢測方法:按臨床常規取血并分離血清，取150_200ul血清，用吸管滴加到實施例
1、2或3中制備的試紙條的樣品墊上，10-15分鐘判讀結果:如樣品中含有HPIVsIgM抗體，則其經過膠體金墊時，會與金標HPIVs重組抗原結合，進而被檢測線上的鼠抗人IgM多克隆抗體捕獲，聚集而形成紅色的沉淀，即為陽性，反之則為陰性；無論樣本中是否含有待檢測的抗體，金標重組抗原都會與質控線上包被的抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體形成紅色沉淀線，即質控線。如此線不出現，說明試紙條失效。
[0068]本發明還可以達到半定量檢測目的:在試紙制備時通過調節檢測線和質控線包被物濃度，控制檢測時檢測線和質控線的顯色深淺，并將其顯色深淺與標準物質濃度對應起來，即可。
[0069]臨床統計試驗:
[0070]臨床患者人類副流感病毒IgM抗體檢測:在流行季節，檢測收治的47例疑似病人血清樣本、確診病例13份，與傳統常用的人類副流感病毒檢測法免疫熒光法比較，本發明試紙條法有2例疑似病例IgM抗體未能檢出。其靈敏度為95.7 %，特異性為100 %。檢測結果如表I所示。
[0071]表1:免疫熒光法與本發明試紙條檢測結果統計
[0072]
I疑似病例I陽性病例I陰性病例I靈敏度 I特異度免疫熒光法$311291.5% 100%
【權利要求】
1.一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條，其特征在于，該試紙條包括:含有膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原的玻璃纖維膜、包被有二抗IgM的檢測線和包被有抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜。
2.如權利要求1所述的一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條，其特征在于所述的二抗IgM為鼠抗人IgM多克隆抗體。
3.如權利要求1或2所述的一種人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條，其特征在于所述HPIVs特異性重組抗原的濃度為lmg/mL，所述二抗IgM的濃度為2mg/mL，所述抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的濃度為lmg/mL。
4.一種如權利要求1至3任意一項所述的人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條的制備方法，其特征在于，該方法包括下述步驟: 1)制備膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原玻璃纖維膜: (1)膠體金溶液的制備:用王水浸泡容器一定時間，然后用超純水清洗干凈，烘干；向容器內加入99.14mL純水和0.86mL的2%氯金酸溶液，邊攪拌邊加熱，加熱至沸騰后繼續煮沸8min，加入2.5mLl %檸檬酸三鈉水溶液，繼續攪拌加熱lOmin，冷卻后加入純水至10mL,得到酒紅色膠體金溶液； (2)金標HPIVs特異性重組抗原的制備: a.調節膠體金溶液pH:取上述制備的膠體金溶液，用K2CO3溶液調節pH至8.5-9.0 ； b.稀釋HPIVs特異性重組抗原:用磷酸鹽緩沖液(PB)將HPIVs特異性重組抗原稀釋至蛋白含量為0.2-0.8mg/mL ； c.膠體金與重組抗原的偶聯:取步驟b中的稀釋液,在4°C條件下2500r/min離心30min,吸取上清液,棄去沉淀，邊攪拌邊將上清液逐滴加入到步驟a中調節好pH的膠體金溶液中，靜置；加入穩定劑，在4°C條件下2500r/min離心30min，靜置，棄上清，留沉淀物，用緩釋劑重懸，即得到膠體金標記的HPIVs特異性重組抗原； (3)用三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將標記好膠體金的HPIVs特異性重組抗原溶液均勻涂布到已經處理好的玻璃纖維素膜上，冷凍干燥，備用； 2)制備包被有二抗IgM的檢測線和包被有抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體的質控線的硝酸纖維素膜: 將二抗IgM稀釋成2mg/mL,將抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體稀釋成lmg/mL ;用三維平面點膜噴金儀儀器HM3055，將稀釋好的二抗IgM均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到檢測線；將稀釋好的抗HPIVs重組抗原的多克隆抗體均勻噴在硝酸纖維素膜上，得到質控線，室溫包被過夜，封袋備用； 3)制備試紙條: 將樣品墊在封閉液中浸泡40min，烘干，封裝備用JfPVC底板、硝酸纖維素膜檢測層、樣品墊、玻璃纖維素膜和吸水墊組合，PVC底板上硝酸纖維素膜的上方粘帖吸水紙，硝酸纖維素膜與吸水紙相互交疊0.2mm，在硝酸纖維素膜的下方依次粘貼玻璃纖維膜和樣品墊，硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜之間以及玻璃纖維膜與樣品墊之間相互交疊0.2mm,即得本發明產品人類副流感病毒IgM抗體檢測試紙條。
【文檔編號】G01N33/532GK104181298SQ201410442757
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年9月2日 優先權日:2014年9月2日
【發明者】秦志浩, 陳艷, 董瑞臻 申請人:秦志浩